Os mutantes de deleção de genes gerados através da recombinação homóloga são o padrão-ouro para estudos de função gênica. O método OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) para a geração rápida de construções de exclusão é descrito. A transformação fúngica mediada por Agrobacterium segue. Finalmente, é apresentado um método de confirmação baseado em PCR de deleções genéticas em transformantes fúngicos.
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Artigo de método
Produção de Deleção Rápida em Fungi via
Neste artigo
Resumo
Resumo
Eliminação precisa de gene (s) de interesse, deixando o resto do genoma inalterado, fornece o produto ideal para determinar a função desse gene específico no organismo vivo. Neste protocolo, descreve-se o método OSCAR de construção de plasmídeos de deleção precisa e rápida. OSCAR depende do sistema de clonagem no qual uma única reação de recombinase é realizada contendo os flancos 5 'e 3' amplificados de PCR amplificados do gene de interesse e dois plasmídeos, pA-Hyg OSCAR (o vetor marcador) e pOSCAR (a assembléia vetor). A confirmação do vetor de deleção corretamente montado é realizada por mapeamento de digestão de restrição seguido de seqüenciamento. Agrobacterium tumefaciens é então usado para mediar a introdução da construção de deleção em esporos de fungos (referido como ATMT). Finalmente, um ensaio de PCR é descrito para determinar se a construção de deleção integrada por recombinação homóloga ou não homóloga, indicando deleção de gene ouIntegração ectopica, respectivamente. Esta abordagem foi utilizada com sucesso para a eliminação de numerosos genes em Verticillium dahliae e em Fusarium verticillioides entre outras espécies.
Introdução
A dissecção genética é uma metodologia poderosa para determinar a importância funcional de indivíduos ou combinações de genes. Uma abordagem padrão para entender o papel de genes específicos é a produção de mutantes de genes únicos inalterados em qualquer outro gene. A abordagem mais poderosa e menos potencialmente confusa é a deleção completa e precisa de um quadro de leitura aberto do gene de interesse (GOF ORF) sem danos a qualquer outra função genética.
Como as abordagens de ligadura padrão para a produção de plasmídeos de deleção requerem etapas múltiplas, o racional para OSCAR 1 era produzir uma abordagem in vitro mais rápida. A Figura 1 mostra o processo de montagem na abordagem OSCAR. O método descrito aqui tem a vantagem de combinar a construção rápida de vetores de deleção de genes individuais em uma única reação multipart em combinação com transfo mediado subseqüente Agrobacterium tumefaciens(ATMT). O OSCAR é muito rápido e compara-se bem com outras estratégias, como o uso da montagem de Gibson em leveduras 2 . O método OSCAR foi utilizado com sucesso com diversas espécies de fungos de Ascomycota. Essas espécies incluem: Fusarium verticillioides (não publicado), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 e Dothistroma septosporum 9 e Sarocladium zeae (não publicado) .
Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para o método, incluindo design de iniciadores, amplificação de PCR de flanco, reação de OSCAR BP, confirmação de estrutura de construção de exclusão, transformaçãoIão de Agrobacterium com a construção seguida pela transferência baseada na ATMT da construção de deleção nas células de fungos e, finalmente, diferencia os mutantes de deleção de fungos daqueles com construções de exclusão ectopicamente integradas.
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Protocolo
1. Projeto de iniciador para amplificação por PCR de flancos de genes
- Faça o download para um arquivo de processamento de texto da região genômica do gene de interesse (GOI) incluindo o quadro de leitura aberto (ORF) e pelo menos 2 kb flanqueando o gene em cada lado do FungiDB ou outro recurso de dados genômicos.
- Destaque o ORF destinado a eliminação e rotina de arranque e paragem de codificações.
- Identificar e destacar ORFs adjacentes dentro da seqüência de download.
- Use o final de 5 kb do ORF GOI e a ferramenta de design do primer (consulte Lista de materiais) para projetar o par de iniciadores de PCR O1 e O2 para gerar um produto de tamanho mínimo de 1 kb. Tenha cuidado para não afetar ORFs adjacentes.
- Cole o flanco de 5 kb de 5 'na janela "Sequence Entry". Clique na caixa "Mostrar parâmetros personalizados". Digite os seguintes parâmetros de design personalizados: primer TM 58 (min), 60 (opt) e 62 (máximo); Primer GC 40 (min), 50 (opt) e 60 (máximo); Primer Tamanho 22 (min), 24 (opt) e 26(Máximo); Amplicon Tamanho 1250 (min), 1500 (opt) e 2000 (máximo).
- Escolha o resultado que coloca o primário reverso (O2) mais próximo do ORF. Capture uma captura de tela dos ensaios e copie e cole as sequências de iniciadores no documento de processamento de texto.
- Repita o processo para o flanco de 3 'para gerar primers O3 e O4, desta vez escolha o resultado colocando o iniciador direto (O3) mais próximo do ORF de destino.
- Adicione locais de ligação apropriados às extremidades 5 'dos iniciadores 1 a 4 (ver Tabela 1 ).
- Também crie e ordene primers ORF específicos para serem usados para confirmação de exclusão na seção 4 abaixo. Os parâmetros devem ser os mesmos que na etapa 1.4.1, exceto usar Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) e 1000 (máximo) ajustando o comprimento do ORF, se necessário. Finalmente, para a confirmação de recombinantes homólogos, gerar 5 'out e 3' out primers encontrados apenas fora dos flancos dentro do cromossomo. Esses iniciadores "fora" serão usados comHygR (210) e hygF (850), respectivamente ( Fig. 2 ).
- Primários de pedidos.
2. Produção de Construções OSCAR
- Usando uma Taq de alta fidelidade , realizar duas reações, uma para cada 5 'e 3' flancos, usando primers (100 μM) O1 e O2 em uma reação e primers O3 e O4 no segundo. A mistura de reacção contém o seguinte: 29,5 μL de água destilada estéril (SDW), 5 μL de tampão de PCR de 10x LA, 8 μL de mistura de dNTP 2,5 mM, 5 μL de MgCl2 25 mM, molde de 1 μL (50 ng / μL), 0,5 μL de hi- Taq de fidelidade , 0,5 μL de Primer O1 e 0,5 μL de Primer O2 para flanco de 5 '(ou 0,5 μL de Primer O3 e 0,5 μL de Primer O4 para flanco de 3'). As condições de reacção de utilização são as seguintes: 94 ° C durante 1 min, depois 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 2 min, depois etapas finais de 72 ° C durante 5 min e depois segure indefinidamente a 10 ° C.
- Execute 0,8%Agarose 1x TAE (acetato de Tris 40 mM pH 8,3, EDTA 1 mM) eletroforese em gel para aproximadamente 125 Vh em um aparelho minigel padrão para determinar o tamanho do produto e a concentração relativa. Posicione o gel com mancha não-etídica de acordo com as instruções do fabricante. Visualize em um iluminador UV.
- Se os produtos de flanco de 5 'e 3' estiverem em uma concentração aproximadamente igual, combine-os e use um kit de coluna de afinidade (ou precipitação de PEG, 90 μL de produtos de PCR combinados, 240 μL de tampão TE pH 7,5, 160 μL de polietileno glicol a 30% PEG8000 MgCl 30 mM 2 ) para co-purificar os produtos de PCR de acordo com o protocolo do fabricante. Se eles não são de igual concentração combinam todo o produto de baixa concentração com uma quantidade equivalente estimada de produto da reação de maior rendimento.
- Use um espectrofotômetro para medir a concentração de DNA purificada.
- Realize a reação da PA, misturando o seguinte: 1 μL de 60 ng / μL de pOSCAR, 2 μL de 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL de flancos combinados de 60 ng / μL, 1 μL de clonase. Incubar durante 16 h a 25 ° C. Terminar a reação adicionando 0,5 μL de proteinase K e incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Transforme alta competência E. Células de coli . Ambas as células competentes comercialmente disponíveis e as células competentes DH5α CaCl 2 caseiras foram usadas com sucesso como destinatários conforme descrito pelas instruções do fabricante. Placa com baixo teor de sódio (0,5 g / L de NaCl) contendo 100 μg / mL de espectinomicina (Spec).
- Identifique a construção correta através da realização de minipretes de DNA 10 das colônias geradas acima. Faça uma digestão dupla com Hin dIII e Kpn I da seguinte maneira: pipeteie 5 μL de DNA, 2 U de cada enzima, 2 μL de tampão 10x apropriado com SDW para um volume total de 20 μL. Isso liberta a inserção (aproximadamente 4,5 kb com flancos de genes de 1,5 kb) do vetor ( aproximadamente 7 kb) e corta todos os sites emFlancos que podem dar tamanhos de banda previsíveis.
- Sequência 11 clones selecionados que mostram um padrão de bandas apropriado.
3. Agrobacterium tumefaciens Transformação Mediada (ATMT) de Fungos
- Transforme a Estirpe AGL1 de Agrobacterium tumefaciens com a construção de deleção de OSCAR 12 .
- Transforme o fungo com AGL1 contendo o plasmídeo de deleção GOI OSCAR. Para fazer isso, execute as seguintes etapas:
- Prepare uma suspensão de esporos fúngicos com água estéril a 2 x 10 6 esporos / mL. Quantificar esporos em um hemocitómetro ou contador de células automatizado. Coloque 500 μL deste em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Esta configuração é para 4 placas de transformação.
- Use um laço descartable estéril azul para adicionar uma gota facilmente visível (deve cobrir cerca de 20% do diâmetro do laço) do plasmídeo de deleção contendo AGL1 a partir do meio LB-Spec 100 de 2 a 3 dias de idade (ver MLista de composição para composição) contendo placas e misture na suspensão de esporos. Vortex até células bacterianas estão bem dispersas (aproximadamente 5 min de velocidade média).
- Pipetar 100 μL da suspensão conidia-Agro no centro de um filtro de membrana de celulose colocado em cada um dos quatro pratos de Petri de 6 cm contendo meio de co-cultivo 12 .
- Espalhe a suspensão com contas de vidro esterilizadas (cerca de 4) para cobrir toda a superfície do filtro de membrana. Alternativamente, espalhe a suspensão usando uma ferramenta de espalhamento tradicional. Deixe o filtro de membrana secar em um capuz por aproximadamente 10 minutos, envolva com filme de parafina. Repita as etapas 3.2.2 e 3.2.3 para configurar múltiplas transformações.
- Incubar a placa durante 2 dias à temperatura ambiente, invertida.
- Transfira o filtro de membrana para meio de seleção de Aspergillus de 6 cm 12 placas contendo higromicina B (Hyg) 150 μg / mL, cefotaxima 200 mM e 100 μg / mLMoxalactam. Incubar à temperatura ambiente durante 5-7 dias antes de isolar as colônias resistentes a Hyg.
- Com palitos de dentes estéreis, transfira transformantes putativos em placas de 6 cm de Agar Dextrose de Batata (PDA) contendo 150 μg / mL de Hyg, 100 μg / mL de kanamicina.
4. Eliminar Identificação de Mutantes por PCR
- Extrair DNA para PCR de transformantes por termólise 13 .
- Uma vez que os transformantes formam colônias no PDA do passo 3.2.7, use um palito de dente estéril para transferir uma pequena quantidade (2 mm x 2 mm) de células de micélio ou de fermento da colônia para 100 μL de solução de lise (pH de fosfato de 50 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, 5% de glicerol) num tubo de microcentrífuga.
- Incubar a mistura a 85-90 ° C durante 20 a 30 minutos. Armazene o extrato bruto contendo DNA genômico a -20 ° C até o uso no passo 4.2.
- Realizar 4 reações de PCR por transformante, uma a cada dEtect recombinação homóloga dos flancos 5 'e 3', respectivamente, um para o marcador selecionável (higromicina fosfotransferase neste caso) e um para ORF GOI.
NOTA: Geralmente, usamos Taq de baixa fidelidade barato para essas reações. As condições de reacção são como descrito no passo 2.1 acima e contêm SDW 20 μL, tampão Taq 10x 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μL, Taq 14 caseiro, 0,5 μL, Primer A (100 μM) 0,5 μL, iniciador B (100 μM ) 0,5 μL, modelo 0,5 μL. Os estoques de iniciadores de menor concentração (10 μM) podem ser utilizados igualmente bem. - Execute um gel de agarose ( eg 0,8%) dos produtos de PCR. Os mutantes de exclusão produzirão a banda Hyg, mas não um produto ORF. Os integrantes ectopicos mostrarão as duas bandas. O tipo selvagem produzirá apenas a banda ORF.
- Permanentemente armazene mutantes de deleção (e um transformante ectópico ou dois para controles) para uso futuro.
NOTA: 15% de glicerol é usado para sRasgou nossas tensões a longo prazo a -80 ° C.
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Resultados
O método OSCAR, em uma única reação, gera um plasmídeo contendo os flancos do gene alvo a ser excluído em torno da cassete marcador selecionável. A produção de construções de exclusão usando o OSCAR é muito eficiente. O sistema pode, no entanto, produzir construções parciais que contenham alguns, mas não todos os três fragmentos (os dois flancos de genes e o marcador selecionável). Geralmente, a maioria dos transformantes de E. coli contém a construção OSCAR correta. Por exemplo...
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Discussão
One Step Construction of Agrobacterium - Os plasmídeos prontos para reconstrução (OSCAR) foram empregados com sucesso com um número cada vez maior de fungos de Ascomycota. O método também pode ser facilmente aplicável à Basidiomycota e a espécies de outros filamentos fúngicos (com promotores apropriados que geram genes marcadores selecionáveis), assumindo que a transformação mediada por Agrobacterium e a recombinação homóloga são possíveis. Foram gerados vetores marcadores adicionais para dive...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos seguintes estudantes de graduação e ensino médio por seu trabalho para gerar mutantes OSCAR em falsos verticillioiodes de Fusarium : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashli Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin Thi Ngoc Le e Angel Pham.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Banco de dados | FungiDB | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer software on-line de design/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Manipulação de arquivos de sequência | de palavras | ||
| Na LB Spec 100 médio | E. coli seleção transformante, composição: 1% triptona, 0,05% NaCl, 0,5% extrato de levedura, 1,5% ágar se for para meio sólido | ||
| de co-cultivo | Indução de transformação ATMT (Referência 12) | ||
| Meio mínimo de Aspergillus com Higromicina | Seleção de transformante fúngico | ||
| Meio PDA | Acumedia | 7149A | Tubos inclinados de esporos únicos |
| Meio | Isolamento de ransformant fúngico, PDA contendo 150 μ g/mL de higromicina B e 100 μ g/mL Kanamicina | ||
| Contas de vidro | Genlantis | C400100 | Espalhamento de placas |
| Filtros de nitrocelulose (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-cultura para ATMT |
| Vários tubos | várias preparações | ||
| Placas de Petri (várias) | Cultura de bactérias e fungos | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Vetor marcador selecionável |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Vetor de montagem |
| DH5α One Shot Competente E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP transformação |
| de reação ccdB sobrevivência células de E. coli | Life Technologies | A10460 | Manutenção de pOSCAR |
| Varetas | Listras de colônias | ||
| Palitos de dente | Colheita de colônias | ||
| Microcentrífuga | Pelotização de bactérias, etc.< / em> | ||
| Centrífuga | Coleta de esporos de fungos | ||
| Microscópio | único isolamento de esporos | ||
| Contador Automatizado de Células | Cálculo de suspensão de esporos | ||
| Microscópio | Hemocitômetro contagem de células | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purificação |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polimerase para geração de flanco OSCAR |
| Higromicina B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomicina | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxima | TCI América | C2224 | |
| Canamicina | 11815032 | ||
| Moxalactama | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Géis de agarose pós-coloração |
| Qiagen QIAquick PCR Kit de Purificação (Cat. Nº 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R ou um Shot_ OmniMAX™ 2 T1R da Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Mistura enzimática | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Usado para montar a construção de deleção em pOSAR |
Referências
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Reimpressões e permissões
