Descobertas recentes sugerem que os motores flagelares bacterianos detectam uma variedade de sinais ambientais e se remodelam em resposta. Espera-se que os ensaios de contas discutidos aqui ajudem a explicar o papel da remodelação na adaptação celular aos estressores ambientais.
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Artigo de método
Caracterização biofísica das funções Flagellar motor
Neste artigo
Resumo
Resumo
O papel dos motores flagelares na motilidade bacteriana e na quimiotaxia é bem compreendido. Descobertas recentes sugerem que os motores flagelares são capazes de se remodelar em resposta a uma variedade de estímulos ambientais e estão entre os gatilhos para colonização superficial e infecções. Os mecanismos precisos pelos quais os motores remodelam e promovem a adaptação celular provavelmente dependem dos principais atributos motores. A técnica de rastreamento de esferas baseada em fotomultiplicador apresentada aqui permite a caracterização biofísica precisa das funções motoras, incluindo adaptações nas velocidades do motor e na dinâmica do interruptor. Essa abordagem oferece a vantagem do rastreamento em tempo real e a capacidade de sondar o comportamento motor por longos períodos. Os protocolos discutidos podem ser prontamente estendidos para estudar motores flagelares em uma variedade de espécies bacterianas.
Introdução
motores flagelares permitir que as células para nadar girando filamentos extracelulares helicoidais. A quantidade de torque do motor pode gerar para um dado comprimento do flagelo (isto é, a carga viscosa) determina as velocidades de natação. Por outro lado, a sua capacidade de mudar o sentido de rotação controla a migração celular em resposta a produtos químicos, um processo conhecido como quimiotaxia. Quimiotaxia e motilidade sendo fatores de virulência 1-3, motores flagelares foram bem caracterizado ao longo dos anos 4. Evidências crescentes agora sugere que o motor actua como um mechanosensor - lo mecanicamente detecta a presença de....
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Protocolo
1. Preparação de células
- Crescer culturas de uma noite da estirpe desejada carregando a fliC pegajoso alelo 15,22 em Caldo de triptona (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguida de inoculação a diluição 1: 100 em 10 mL de TB fresco. Crescer a cultura a 33 ° C numa incubadora agitadora até DO600 = 0,5.
- Agregar as células a 1500 xg durante 5-7 minutos e re-dispersar vigorosamente o sedimento em 10 mL de tampão de filtro esterilizado motilidade (MB; 10 mM de tampão de fosfato: 0,05-0,06 M de NaCl, 10 -4 M de EDTA, 1 | iM de metionina, pH 7,0).
- Repita o passo 1.2 mais duas vezes e re-dispersar o sed....
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Resultados
A configuração do fotomultiplicador é mostrado na Figura 1A. É importante que os PMTs ter alta sensibilidade ao longo do intervalo de comprimentos de onda dispersa pelas esferas de interesse. Os PMTs empregadas aqui operam nas faixas visíveis e do infravermelho próximo, e foram capazes de detectar a luz dispersa pelas esferas iluminadas por uma fonte de luz halógena. As condições de iluminação ideais e tensões de alimentação irá variar de uma instalação para outra. Para .......
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Discussão
A fim de facilitar tethered talão de rastreamento e estimativa correcta do motor-torques, as seguintes informações devem ser revistos. Ao realizar essas medições com células flageladas, corte é um passo crítico. Cisalhamento reduz o filamento flagelar a um mero topo, assegurando desse modo que a carga no motor viscoso é predominantemente devido ao cordão e pode ser estimado dentro de erro de 10% 16. Shearing também melhora as chances de encontrar trajetórias circulares com excentricidades bem distribuídos (&l.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Howard Berg pelo presente do microscópio de rastreamento de contas / fotomultiplicadores e à Texas A & M Engineering Experiment Station pelos fundos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de poli-L-lisina (0,1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Seringa de Ponta Deslizante Luer de 1 mL | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Tubulação de Polietileno | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Fotomultiplicador Tubos | Hamamatsu | R7400U-20 | Faixa de resposta espectral de 300 a 920 nm, Comprimento de onda máximo de 630 nm, Tempo de resposta de 0,78 ns http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 x 1 mm fendas de precisão | Edmund Optics | NT39-908 | 2 fendas montadas em ângulos retos entre si em tubos fotomultiplicadores |
| Osciloscópio | Tektronix | TBS 1032B | Marcas alternativas são aceitáveis. Osciloscópio Digital, Série TBS 1000B, 2 Analógicos, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| Filtro LP/HP de 8 Polos | Krohn-Hite | 3384 | Marcas alternativas são aceitáveis. Recomenda-se uma faixa de frequência de 0,1 Hz a 200 kHz. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Microscópio Optiphot | Nikon | NA | Qualquer microscópio de fase vertical ou invertida pode ser usado. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Divisor de feixe de cubo | ThorLabs | BS013 |
Referências
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun<....
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Reimpressões e permissões
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