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Artigo de método

Caracterização biofísica das funções Flagellar motor

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DOI:

10.3791/55240

⸱

18 de janeiro de 2017

 ,  , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

Neste artigo

Resumo

Descobertas recentes sugerem que os motores flagelares bacterianos detectam uma variedade de sinais ambientais e se remodelam em resposta. Espera-se que os ensaios de contas discutidos aqui ajudem a explicar o papel da remodelação na adaptação celular aos estressores ambientais.

Resumo

O papel dos motores flagelares na motilidade bacteriana e na quimiotaxia é bem compreendido. Descobertas recentes sugerem que os motores flagelares são capazes de se remodelar em resposta a uma variedade de estímulos ambientais e estão entre os gatilhos para colonização superficial e infecções. Os mecanismos precisos pelos quais os motores remodelam e promovem a adaptação celular provavelmente dependem dos principais atributos motores. A técnica de rastreamento de esferas baseada em fotomultiplicador apresentada aqui permite a caracterização biofísica precisa das funções motoras, incluindo adaptações nas velocidades do motor e na dinâmica do interruptor. Essa abordagem oferece a vantagem do rastreamento em tempo real e a capacidade de sondar o comportamento motor por longos períodos. Os protocolos discutidos podem ser prontamente estendidos para estudar motores flagelares em uma variedade de espécies bacterianas.

Introdução

motores flagelares permitir que as células para nadar girando filamentos extracelulares helicoidais. A quantidade de torque do motor pode gerar para um dado comprimento do flagelo (isto é, a carga viscosa) determina as velocidades de natação. Por outro lado, a sua capacidade de mudar o sentido de rotação controla a migração celular em resposta a produtos químicos, um processo conhecido como quimiotaxia. Quimiotaxia e motilidade sendo fatores de virulência 1-3, motores flagelares foram bem caracterizado ao longo dos anos 4. Evidências crescentes agora sugere que o motor actua como um mechanosensor - lo mecanicamente detecta a presença de substratos sólidos 5,6. Esta capacidade provável ajuda no desencadeamento de colonização superfície e infecções 5,7. Como resultado, os mecanismos pelos quais o motor sentidos superfícies e iniciados de sinalização são de importância 8,9.

O motor flagelar pode ser facilmente estudado por amarrar o flagellhum a um substrato e observando a rotação celular. Esta operação foi primeiramente alcançada por Silverman e Simon, que trabalhou com um mutante polyhook em E. coli e ganchos ligados com sucesso para substratos de vidro com anticorpos anti-gancho 10. O ensaio de célula tethered permitiu aos investigadores a estudar as respostas de o interruptor do motor a uma variedade de estímulos químicos. Por exemplo, Segall e co-trabalhadores quimicamente estimulado células conectada com o auxílio de pipetas iontoforéticos. As alterações correspondentes no viés CW (a fração dos motores tempo de rotação no sentido horário, CW) lhes permitiu medir a cinética de adaptação na rede quimiotaxia 11,12. Enquanto o ensaio de células tethered foi eficaz em estudar respostas de switch, ele só foi capaz de oferecer insights sobre a mecânica do motor através de uma gama limitada de cargas viscosos 13. Para ultrapassar este problema, Ryu e colaboradores tethered esféricas, esferas de látex de filamento topos sobre as células presas às superfícies. Os grânulos eramentão rastreados usando interferometria de back-focal com fracos armadilhas ópticas 14. Ao trabalhar com contas de diferentes tamanhos, os pesquisadores poderiam estudar o motor ao longo de uma gama muito maior de cargas. Este ensaio foi posteriormente melhorado por Yuan e Berg, que desenvolveu uma técnica de talão-de rastreamento baseado photomultiplier combinada com iluminação a laser de campo escuro. Seu método de rastreamento habilitado de nanobeads tethered de ouro que foram tão pequena (~ 60 nm) que as resistências viscosos externos foram menores em comparação com as resistências viscosos internos para rotação 15,16. Isto conduziu às medições das velocidades máxima alcançável em E. coli (~ 300 Hz). Em V. alginolyticus, ensaios talão semelhantes permitiu medições das taxas de fiação em cargas intermédias viscosos (~ 700 Hz) 17. Ao permitir que as medições de respostas motoras ao longo de toda a gama possível de cargas viscoso (a partir de zero a carga de quase-box), os ensaios de Bead-forneceu uma ferramenta importante para compreender a biofísica tprocesso orque geração 18,19.

Recentemente, nós modificamos o ensaio Yuan-Berg para incluir pinças ópticas que nos permitiram aplicar estímulos mecânicos precisos para motores individuais 6. Usando esta técnica, nós mostramos que a força-geradores que giram o motor são mechanosensors dinâmicos - eles remodelar em resposta às mudanças nas cargas viscosos. É possível que tal sensor de carga provoca a diferenciação de células em bactérias enxame, embora os mecanismos permanecem obscuros. Também é provável que os motores flagelares em outras espécies também são mechanosensitive 20, apesar de evidência directa que falta. Aqui, discutimos a abordagem baseada em fotomultiplicador (PMT) para acompanhar a rotação de esferas de látex amarrados a filamentos de flagelar 15. Em comparação com o acompanhamento com câmeras ultra-rápidos, o fotomultiplicador-setup é vantajoso porque é relativamente simples para rastrear esferas individuais em tempo real e mais longa durações. É particularmente útil quando se estuda a longo tempo remodelação em complexos motor flagelar devido a estímulos do meio ambiente 21. Embora nós detalhe protocolos específicos para E. coli, que pode ser facilmente adaptado para estudar motores flagelares em outras espécies.

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Protocolo

1. Preparação de células

  1. Crescer culturas de uma noite da estirpe desejada carregando a fliC pegajoso alelo 15,22 em Caldo de triptona (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguida de inoculação a diluição 1: 100 em 10 mL de TB fresco. Crescer a cultura a 33 ° C numa incubadora agitadora até DO600 = 0,5.
  2. Agregar as células a 1500 xg durante 5-7 minutos e re-dispersar vigorosamente o sedimento em 10 mL de tampão de filtro esterilizado motilidade (MB; 10 mM de tampão de fosfato: 0,05-0,06 M de NaCl, 10 -4 M de EDTA, 1 | iM de metionina, pH 7,0).
  3. Repita o passo 1.2 mais duas vezes e re-dispersar o sedimento final em 1 ml MB.
  4. Cisalhamento da suspensão, passando para trás e para a frente ~ 75 vezes entre duas seringas com 21 a 23 adaptadores calibre ligados por tubos de polietileno (7 - 12 cm de comprimento, diâmetro 0,58 mm interno). Limitar o tempo total para corte de 30 - 45 s.
  5. Centrifugar as células cortadas a 1.500 g durante 5-7 minutos e voltar a dispersar apelete em 100 - 500 mL de MB.

2. Deslize Preparação

  1. Preparar uma câmara de imagem imprensando duas fitas adesivas de dupla face entre um cover-derrapante e uma lâmina de microscópio. Para ensaios de quimiotaxia, empregar qualquer câmara de microfluidos que permite a troca de MB e estimulantes químicos.
  2. Adicionar solução de 0,01% de poli-L-lisina na câmara e depois de 5 min lave as superfícies com MB (80-100 mL).
  3. Adicionar 40 ul de suspensão de células para dentro da câmara e permitir tempo suficiente para a ligação à superfície do vidro (7-8 min). Fluxo de Saída células unstuck pela adição de 100 uL MB de um lado da câmara, enquanto wicking a solução com um papel de filtro a partir do outro lado.
  4. Adicionam-se 10 - 15? L de esferas de látex para dentro da câmara e permitir que as esferas de tempo suficiente para se estabelecer e anexar as células (7-8 min). Lave com 100 ul de MB, tal como descrito na etapa 2.3, para remover descolar grânulos. Use uma gama de talão-sizes para as experiências tanto tempo como um bom contraste está disponível.

3. Acompanhamento Bead

  1. Colocar a amostra em um estágio do microscópio e digitalizar a superfície para grânulos ligados a motores. Utilize uma objectiva de 40x fase para fazer observações, embora microscopia de fase não é necessário. Alternativamente, empregam imagem de campo brilhante, desde que contraste suficiente é mantida a distinguir claramente um grânulo brilhante sobre um fundo escuro.
  2. Uma vez que um grânulo tenha sido seleccionado, mover a fase lateralmente para posicionar o grânulo em um canto pré-determinado, como mostrado na Figura 1B. grânulos posição na mesma curva para garantir que o sentido de rotação do grânulo é correctamente conhecido. A trajetória talão ideal é aproximadamente circular, mas trajetórias elípticas são admissíveis.
  3. Manter a frequência de amostragem mais elevada do que duas vezes a frequência de rotação do motor para evitar erros associados com serrilhado. Neste trabalho, utilizar um motor que foi rotativo a50 Hz e a amostra a frequências que eram 10 vezes mais elevada (500 Hz), para obter um sinal bom.

Análise 4. Dados

  1. Centro e escalar as tensões de saída PMT e elipticidade correta nas trajetórias com transformações afins, se necessário 23. Use uma análise de poder de espectro para determinar as taxas de rotação 17.
  2. Determinar ângulos polares, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). Determinar as variações de velocidades do motor e mudar ao longo do tempo por meio do cálculo ω figure-protocol-1 14.
  3. Empregar um filtro de mediana para alisar os dados de velocidade do motor. Uma janela de filtro de mais de duas rotações completas é recomendado 23,24.

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Resultados

A configuração do fotomultiplicador é mostrado na Figura 1A. É importante que os PMTs ter alta sensibilidade ao longo do intervalo de comprimentos de onda dispersa pelas esferas de interesse. Os PMTs empregadas aqui operam nas faixas visíveis e do infravermelho próximo, e foram capazes de detectar a luz dispersa pelas esferas iluminadas por uma fonte de luz halógena. As condições de iluminação ideais e tensões de alimentação irá variar de uma instalação para outra. Para ...

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Discussão

A fim de facilitar tethered talão de rastreamento e estimativa correcta do motor-torques, as seguintes informações devem ser revistos. Ao realizar essas medições com células flageladas, corte é um passo crítico. Cisalhamento reduz o filamento flagelar a um mero topo, assegurando desse modo que a carga no motor viscoso é predominantemente devido ao cordão e pode ser estimado dentro de erro de 10% 16. Shearing também melhora as chances de encontrar trajetórias circulares com excentricidades bem distribuídos (&l...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Howard Berg pelo presente do microscópio de rastreamento de contas / fotomultiplicadores e à Texas A & M Engineering Experiment Station pelos fundos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de poli-L-lisina (0,1%)Sigma-AldrichP8920http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7307http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
Seringa de Ponta Deslizante Luer de 1 mLExel Int.26048http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gaugeBecton, Dickinson and Company427565http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Tubulação de PolietilenoHarvard Apparatus59-8325http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Fotomultiplicador TubosHamamatsuR7400U-20Faixa de resposta espectral de 300 a 920 nm, Comprimento de onda máximo de 630 nm,  Tempo de resposta de 0,78 ns 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm fendas de precisãoEdmund OpticsNT39-9082 fendas montadas em ângulos retos entre si em tubos fotomultiplicadores
OsciloscópioTektronixTBS 1032BMarcas alternativas são aceitáveis. Osciloscópio Digital, Série TBS 1000B, 2 Analógicos, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
Filtro LP/HP de 8 PolosKrohn-Hite3384Marcas alternativas são aceitáveis. Recomenda-se uma faixa de frequência de 0,1 Hz a 200 kHz.     
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Microscópio OptiphotNikonNAQualquer microscópio de fase vertical ou invertida pode ser usado.
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Divisor de feixe de cuboThorLabsBS013

Referências

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