Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação

Resumo

Expansão de células epiteliais humanas esofágicas pediátricos utilizando reprogramação condicional fornece investigadores com uma população específica no paciente de células que pode ser utilizada para engenharia construções esofágicas autólogo para implantação para tratar defeitos ou ferimentos e servir como um reservatório para ensaios de pesquisa de terapêuticos.

Resumo

Identificar e expandir células específicas do paciente em cultura para uso em engenharia de tecidos e investigação de doenças pode ser muito desafiador. A utilização de vários tipos de células-tronco para derivar tipos de células de interesse costuma ser cara, demorada e altamente ineficiente. Além disso, os tipos de células indesejados devem ser removidos antes de usar essa fonte de célula, o que requer outra etapa do processo. Para obter células epiteliais esofágicas suficientes para projetar o lúmen de uma construção esofágica ou para rastrear abordagens terapêuticas para o tratamento de doenças esofágicas, as células epiteliais esofágicas nativas devem ser expandidas sem alterar sua expressão gênica ou fenótipo. A reprogramação condicional do tecido epitelial esofágico oferece uma abordagem promissora para expandir as células epiteliais esofágicas específicas do paciente. Além disso, essas células não precisam ser classificadas ou purificadas e retornarão a um estado epitelial maduro após removê-las da cultura de reprogramação condicional. Essa técnica foi descrita em muitos estudos de rastreamento de câncer e permite a expansão indefinida dessas células em várias passagens. A capacidade de realizar ensaios de triagem esofágica ajudaria a revolucionar o tratamento de doenças esofágicas pediátricas, como a esofagite eosinofílica, identificando o mecanismo de gatilho que causa os sintomas do paciente. Para aqueles pacientes que sofrem de defeito congênito, doença ou lesão do esôfago, essa fonte de células pode ser usada como um meio de semear uma construção sintética para implantação para reparar ou substituir a região afetada.

Introdução

engenharia de tecidos e esofagite eosinofílica (EoE) têm sido o foco de pesquisas em muitos laboratórios ao longo da última década. Defeitos congênitos, como a atresia de esôfago, são vistos em aproximadamente 1 em cada 4.000 nascidos vivos, o que resulta no desenvolvimento incompleto do esôfago levando à incapacidade de comer ^1. A incidência e prevalência de EoE têm vindo a aumentar desde a identificação da entidade doença em 1993. A incidência de EoE variou entre 0,7 a 10 / 100.000 por pessoa-ano e a prevalência variou de 0,2-43 / 100.000 ^2. Uma nova abordagem cirúrgica atraente para o tratamento de longo intervalo at....

Protocolo

biópsias esofágicas foram obtidos após consentimento informado foi obtido dos pais / responsáveis ​​dos pacientes pediátricos e de acordo com a placa de revisão institucional (IRB # 13-094).

1. esterilização de instrumentos e gelatina Solution

1. forceps autoclave, lâminas de barbear e tesouras antes de manusear do tecido para evitar a contaminação.
2. Para fazer 200 ml de solução de gelatina a 0,1%, combinar 200 mL de água destilada com 0,2 g de gelatina. Autoclave e fresco antes da utilização.

2. revestindo placas de cultura de tecidos

1. Aproximadamente 2 h antes do isolamento das células, suficient....

Resultados

Um resumo das principais etapas isolar células epiteliais do esôfago de biópsias de pacientes estão resumidos na Figura 1. As colónias de células epiteliais vai formar em cerca de 4-5 dias e vai ser rodeado por células de alimentação de fibroblastos (Figura 2A). À medida que essas colônias expandir eles vão fundir-se com outras colónias para formar grandes colônias (Figura 2B). Uma vez que as culturas se tornaram 70% confluentes, eles pr.......

Discussão

Os passos mais importantes, a fim de isolar e expandir células epiteliais esofágicas a partir de biópsias de pacientes são: 1) dissociação adequadamente tecido de biopsia com a morte celular mínima; 2) assegurar ROCHA inibidor é adicionado ao meio de cultura de células em cada mudança de meio; 3) Não use mais células alimentadoras do que o recomendado; 4) manter uma cultura asséptica limpo; e 5) células de passagem apenas antes de atingir a confluência.

Devido às diferenças relacionadas com .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane Sigma	Aldrich	277258-1L
Gelatina de pele suína	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific
Tubos Cônicos de 15 mL	Denville Scientific	C1017-p
Soro Completo de Queratinócitos Meio Livre	Thermofisher Scientific	10724011
Penicilina Estreptomicina	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	Solução de Insulina 35050061
	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Fator de Crescimento Epidérmico Humano (EGF)	Peprotech	AF-100-15
Inibidor de ROCK (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Soro Bovino	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0,05% Tripsina-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0,25% Tripsina-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Pratos	Denville Pratos Scientific	T1110-20
150 mm	Denville Scientific	T1115
50 mL Cônicos	Denville Scientific	C1062-9;
Comprimidos de solução salina tamponada com fosfato	Fisher Scientific	BP2944-100
Pipetas de 5 mL	Fisher Scientific	1367811D
Pipetas de 10 mL	Fisher Scientific	1367811E
Pipetas de 25 mL	Pipetas Pasteur	de
9"	da Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Células	ATCC	CRL1658

6769006 1367811