Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa

laser assistida por matriz de Dessorção / ionização (MALDI) Imagiologia espectrometria de massa (IMS) está a tornar-se uma técnica muito procurado para a visualização da distribuição espacial dos lípidos, péptidos e proteínas através de superfícies intactas de amostra. MALDI IMS foi anteriormente conhecido como uma técnica analítica para analitos pré-purificado, mas em anos recentes, tem-se chamar a atenção em muitas outras disciplinas por causa da capacidade de combinar a precisão de espectrometria de massa com pontos de referência de alta resolução visuais / anatómicas sem a precisa para qualquer rotulagem externo. Como a associação científica dos investigadores que utilizam esta técnica continua a crescer, há um aumento da necessidade de protocolos, fácil de seguir normalizados para auxiliar no desenvolvimento e optimização das experiências IMS. Os gangliósidos, um grupo de lípidos da membrana altamente abundantes no sistema nervoso central, são ideais para experiências MALDI IMS como a sua localização, incorporado no interior da membrana, faz certa especificidadees impossível detectar utilizando Imuno-rotulagem convencional. Adicionalmente, temos mostrado, utilizando MALDI IMS, de que estes lípidos, que funcionam como moduladores da sinalização celular, entre outras coisas, têm perfis de distribuição anatómica original no cérebro de roedores saudáveis que são modificadas após a lesão cerebral ^{3, 4, 5.} Os gangliósidos estão localizados a uma gama de massa mais elevada em comparação com a maioria das espécies de lípidos, e são, assim, mais adequado para a plataforma de imagem MALDI.

Figura 1: Fluxo de trabalho de MALDI IMS Experiment. Diagrama do fluxo de trabalho geral de uma experiência MALDI IMS usando sublimação. Tecido congelado a -80 ° C é seccionado num criostato e 10 uM secções são montadas em lâminas de degelo ITO condutoras. A lâmina é então colocado num excicador até sublimação. Slides são inseridas no aparelho de sublimação e mesmo uma camada de matriz é aplicada à superfície da amostra de tecido. As amostras são congeladas durante a noite num congelador a -20 ° C e depois colocada num excicador durante 10 minutos. Uma vez que tenham sido aplicados os padrões, as amostras são inseridas no instrumento MALDI onde um laser é dirigido através do tecido, causando moléculas dessorvidas na matriz para ionizar. Os íons de viajar para baixo um tubo de vôo e separada com base em sua massa (time-of-flight / TOF) até chegar ao detector. A informação sobre a abundância iónica de analitos num (m / z) gama predeterminada de massa-carga é apresentada como uma imagem de ambos molecular e espectro de massa. Estes dados podem ser utilizados para visualizar e quantificar tanto a abundância iónica do analito de interesse dentro do tecido impressa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Preparação de amostrapara MALDI IMS é altamente variável à medida que cada etapa do processo deve ser personalizado para os analitos de interesse. A característica definidora de experiências baseadas em MALDI é o uso de um revestimento de matriz depositada sobre a superfície da amostra antes da análise. Em adição à função de absorver e transferir energia de radiação do laser durante o processo de ablação, a matriz também serve para isolar vários analitos a partir da amostra, facilitando assim a análise de compostos de interesse ^{6, 7.} aplicação homogénea da matriz para a superfície da amostra é a etapa mais importante no processo de preparação de amostras. Deposição de matriz inadequada pode levar a grandes formações heterogêneas cristal matriz e o desenvolvimento de artefatos, sinal de iões de baixa e pouca reprodutibilidade ^7.

Devido à afinidade de certas matrizes para isolar analitos específicos, do tipo de matriz seleccionado de um experimento podealterar significativamente o resultado. As matrizes utilizadas para geração de imagens de proteínas e péptidos são muitas vezes diferentes das utilizadas para a lípidos de imagem e o processo é ainda mais complicado pela necessidade de procedimentos adicionais, tais como passos de lavagem e re-hidratação, a fim de detectar sinais com sucesso a partir de tecido. Embora existam etapas de lavagem para o reforço de sinais de lipídios ^8, eles não são um pré-requisito para a detecção da maioria das espécies de lipídios. Ao seleccionar uma matriz para uma experiência de imagem de lípidos, é importante ter em conta a polaridade do lípido de interesse como isso vai limitar a gama de matrizes adequadas. Por exemplo, gangliósidos contêm resíduos de ácido siálico, que lhes dão uma polaridade negativa global. Há um certo número de matrizes que podem eficazmente de s sorver e ionizar gangliósidos de tecido; No entanto, factores tais como picos de matriz derivada do espectro e estabilidade da matriz sob vácuo deve ser levado em consideração. 1,5-diaminonapthalene (DUma matriz) é suficientemente estável sob condições de vácuo instrumento para a maioria das aplicações de imagem e demonstrou um elevado grau de sensibilidade para a dessorção lipídica e pode ser utilizado para a análise de lípidos em ambos os modos de iões positivos e negativos ^2. matriz DAN, quando comparada com outras matrizes de afinidade lipídica negativa, tais como o ácido di-hidroxibenzóico (DHB), 9-aminoacridina (9-AA), e 5-cloro-2-mercaptobenzotiazole (CMBT), foi capaz de dessorver mais eficientemente gangliosidos de cérebro de rato tecido no modo de iões negativos (manuscrito em preparação).

Selecionando o método adequado para a deposição de matriz é de igual importância para a seleção da própria matriz. métodos de deposição de matriz molhado em que a matriz sólida é dissolvido num solvente orgânico, e depositadas por pneumático ou pulverizadores ou observadores automatizadas, são particularmente eficazes para a dessorção de proteínas e péptidos como o líquido penetra a amostra para permitir adicionalcção de compostos e de co-cristalização com a matriz. Embora estas técnicas também podem ser usados para aplicações de lipídios, deslocalização de analitos e formações de cristal da matriz irregular são ocorrências comuns devido à grande abundância e solubilidade de lipídios na solventes, particularmente no tecido ^{2, 9.} Porque os lípidos são prontamente ionizadas a partir de tecidos, técnicas de deposição de matriz seco, tal como a sublimação, oferecem uma alternativa de custo simples, eficaz para pulverizadores, contornando muitos dos desvantagem destas técnicas. O sucesso da sublimação em experiências MALDI IMS é atribuído a funções tais como a morfologia da matriz microcristalina que aumenta a área de superfície para a matriz de ligação para a substância analisável, o aumento da pureza da matriz, e deposição de matriz homogénea que conduzem ao aumento da reprodutibilidade da matriz em comparação com as técnicas sanitária ^{1, 10.}

invo sublimaçãoLves aquecimento de uma matriz em pó sob vácuo imediatamente abaixo de uma superfície de uma amostra arrefecida resultante em sólido de transição de fase gasosa da matriz em pó seguido de deposição sobre a superfície da amostra de tecido. Durante a sublimação, a deposição de matriz pode ser controlada por factores variáveis, tais como tempo, temperatura e pressão para proporcionar resultados altamente reprodutíveis. Uma experiência única sublimação pode levar de 5 a 20 minutos, dependendo do tipo de matriz seleccionado, o qual pode ser re-utilizada várias vezes antes da sua eliminação. O aparelho pode ser adquirido comercialmente a uma fracção do preço de pulverizadores automáticos e é facilmente desmontado para limpeza e manutenção. O baixo custo e relativa simplicidade dessa técnica deposição de matriz tornam ideal para pesquisadores iniciantes ou expandindo aplicações de imagem lipídico em MALDI IMS. Embora a informação detalhando protocolos para a sublimação dos tecidos para IMS foram relatados ^11, alguns protocolos padronizados existem which focar o fluxo de trabalho básico envolvido com a realização de um experimento de sublimação para imagiologia lipídios de alta massa no modo de iões negativos, o que torna difícil estabelecer a técnica sem extensa tentativa e erro. O que se segue é um protocolo experimental com o objetivo de preencher essa lacuna para a sublimação da matriz DAN em secções de cérebro de rato para imagens de alta resolução e detecção de gangliosídeos.

Figura 2: A sublimação Aparelho. A fotografia (A) e diagrama esquemático (B) do aparelho de sublimação. A bomba de vácuo ligada a um tubo de borracha para uma armadilha fria cheio com 300 ml de etanol. A câmara de frio é então ligado por tubos de borracha para o aparelho de sublimação. O aparelho é constituído por duas peças separadas de material de vidro que são seladas juntamente com um metal de L-articular. A metade superior da sublimadorcontém o condensador que é enchido com lama de gelo. A placa de amostra é gravado na parte inferior do condensador, no interior do aparelho de vidro selado. A metade inferior do aparelho de sublimação contém a matriz DAN, espalhar-se uniformemente em frente da placa de amostra. Durante a sublimação, o aparelho de vidro é colocada sobre um banho de areia aquecida a 140 ° C por uma placa quente directamente por baixo dele. A sonda de temperatura ajuda a manter uma temperatura estável durante todo o experimento sublimação através de realimentação da temperatura do banho de areia em comparação com a temperatura predefinida para o experimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Todos os procedimentos de manipulação animal descrito abaixo aderir à Universidade do comitê de cuidados com os animais de Western Ontario (2016-014).

1. Preparação de tecidos e Seccionamento

1. Extraia o tecido cerebral de ratos através de um processo conhecido como "Fresco Congelado Extraction" (FFE).
   1. Euthanize o rato com uma overdose de pentobarbital de sódio e monitorar reflexos nos membros. Uma vez que todos os reflexos cessaram, cortar a cabeça do rato, utilizando uma guilhotina.
   2. Cuidadosamente separar os músculos e outros tecidos do crânio utilizando um bisturi. Use uma pinça de corte de osso para quebrar o crânio para expor o cérebro, a partir da base do crânio (buraco occipital) para a porção anterior.
   3. Uma vez que o cérebro é exposto, colher-a cuidadosamente com uma espátula cirúrgica e colocar imediatamente em gelo seco esmagado para o flash de congelamento.
      NOTA: O cérebro vai ser muito maleável. Portanto, tome cuidado extremo ao colocar o cérebro emgelo seco. Se o cérebro é esmagado ou pressionado de encontro a uma superfície, que vai alterar a sua forma e congelar nessa posição.
2. Remover o tecido fresco congelado (não perfundidos com formaldeído ou incorporado em OCT) de - 80 ° C freezer e colocar no gelo seco.
3. Coloque algumas gotas de água sobre um suporte de criostato e colocar em gelo seco ou barra de congelamento criostato. Imprensa tecido levemente no suporte criostato, uma vez que começa a congelar e segure até que a água congela em torno da base do tecido e ancora-lo no lugar. Adiciona-se água adicional para proteger ainda mais o tecido sobre o titular, se necessário.
   NOTA: A água é utilizada, em vez de meios de outubro de tecido de montagem, a fim de evitar a contaminação do tecido com os compostos que podem afectar a detecção do sinal desejado.
4. tecidos posição no criostato. Secção de tecido até ao local anatómico desejado. Certifique-se de que a espessura de corte é entre 8-12 mm.
   NOTA: Quando o corte de tecidos em criostato comunaldispositivos, é imperativo que os materiais separados, tais como lâminas, escovas, barras estabilizadoras, e os titulares de ser utilizada, a fim de evitar a contaminação com a incorporação de compostos. O interior do criostato também devem ser limpos cuidadosamente com etanol antes do uso.
5. Usando a barra anti-roll criostato, lentamente secção achatada secções de tecido. Furos ou marcas no tecido pode ocorrer se a colocação de barra de rolo está incorreto ou lâmina é maçante. Mova o tecido para o centro de cortar plataforma, usando pincéis limpos.
6. Montagem
   1. Congelar lâminas condutoras ou placas de metal, colocando-os no criostato, enquanto cortando. Quando o slide é completamente congelado, mova com cuidado o tecido seccionado para a superfície condutora da lâmina utilizando pincéis limpos. Uma vez que todas as secções de tecido são posicionados corretamente no slide, coloque um dedo sob o slide, em frente ao tecido, e pressione até que a secção descongela.
      NOTA: As Secções podem dobrar ou enrolar-se durante o processo de descongelamento quandousando este método de montagem. Este pode ser reduzido, mantendo a corrediça no criostato quando o descongelamento do tecido. Se estas questões tornar-se problemática, uma alternativa, warm-mount método é listado abaixo.
   2. Alternativamente, dê uma temperatura ambiente de índio-estanho Oxide (ITO) de slides (ou placa de metal) e pressione levemente para baixo na seção de tecido congelado na superfície da plataforma do corte, o lado condutora para baixo. Isto conduzirá à secção de tecido descongelamento uniformemente sobre a superfície da lâmina com pouco de ondulação ou a dobragem do tecido.
      NOTA: A condensação pode aparecer abaixo da seção na montagem usando este método que pode levar a perda de certas proteínas e lipídios.
7. Colocar as lâminas com o tecido em um exsicador para 5 - 10 min.

2. sublimador Aparelho Set-up

NOTA: Execute estas etapas em um exaustor.

1. Coloque um banho de areia num recipiente de alumínio em um prato quente, com a placa quente em um elevador de metal tesourade área de superfície adequado (por exemplo maior do que a placa quente). Ligar a placa de aquecimento e ajustar a temperatura para 140 ° C.
   NOTA: O ponto de fusão para a matriz DAN é entre 187-190 ° C. Não exceda esta temperatura sobre a placa.
   1. Se a placa de aquecimento está equipado com uma sonda de realimentação de temperatura, usá-lo para monitorar a temperatura de areia ao longo da experiência e assegurar a consistência da temperatura. Esse recurso pode ajudar com reprodutibilidade experiência em vários experimentos de sublimação.
      NOTA: O banho de areia deve ser contido dentro de um recipiente de alumínio como um recipiente de vidro pode se quebrar a altas temperaturas.
2. Coloque 300 mg de matriz de DAN sobre a superfície inferior do aparelho de sublimação. Coloque a matriz no centro do aparelho e espalhar-se numa camada uniforme na largura e no comprimento da lâmina aproximada sendo sublimada.
   CUIDADO: matriz DAN é tóxico. Portanto, é importante usar luvas, máscaras, e segurançaóculos de proteção em todos os momentos ao manusear a matriz em pó. DAN devem ser armazenadas no escuro, pois é sensível à luz.
3. Tape uma placa de metal para a superfície interior do aparelho, com a placa que faz contacto directo com o fundo do condensador, de modo a assegurar uma distribuição uniforme da temperatura de arrefecimento através de toda a superfície da lâmina durante a sublimação. Alternativamente, a areia do fundo do condensador para assegurar uma superfície plana.
   1. Colocar a fita ao longo das bordas exteriores da placa e aderir aos lados do material de vidro interior. Se a fita adesiva é colocada sob a placa e adere à parte inferior da superfície de vidro interior, a distribuição de temperatura pode não ser uniforme e pode resultar na distribuição desigual da matriz sobre a superfície da lâmina.
   2. Tape um espaço em branco (teste) deslize em diagonal através da superfície da placa de metal com a fita de novo colocada sobre os bordos exteriores da corrediça.
4. Ligar as porções superior e inferior do aparelho, Wom uma borracha O-ring no meio para assegurar uma vedação completa.
5. Coloque um metal L-articular em torno do centro do aparelho e apertar vícios até a metade superior e inferior do aparelho são hermeticamente fechadas em conjunto. Colocar no metal de O-ring acima do banho de areia.
6. Pegue um punhado de gelo picado e colocá-lo no condensador. Preencha condensador de ¼ a ½ cheio com água fria para criar lama gelo. A lama de gelo irá arrefecer a placa de metal no interior do aparelho e subsequentemente a corrediça aderida a ela. Espere pelo menos 5 minutos para que a temperatura chegar a um estado estacionário.
7. Pour 300 ml de etanol no recipiente armadilha fria e colocar o material de vidro para dentro do recipiente. Redução de 2 - 3 pequenos pedaços de gelo seco, para o etanol na parte inferior do recipiente armadilha fria. A entrada de câmara de frio tem um tubo de vidro de correr para o fundo do cilindro, enquanto que a saída não.
8. Ligue a bomba de vácuo para a saída de câmara de frio utilizando tubos de borracha. Use outro pedaço de borrachatubagem de entrada para ligar a câmara de frio para o aparelho de sublimação. Certifique-se de que o tubo esteja bem preso com grampos de metal, se disponível.
9. Utilizar a bomba de vácuo para proporcionar um vácuo de 30 - 50 mT. Deixe a bomba funcionar durante pelo menos 5 minutos para equilíbrio de pressão. Vícios de L-anel de aparelho de sublimação pode ter que ser novamente apertados uma vez que a bomba de vácuo é ligada por causa da diminuição da pressão no aparelho.
   NOTA: É altamente recomendável que um indicador de vácuo ser ligado à bomba para monitorar a pressão de vácuo durante a experiência e para testar a existência de fugas de pressão, a fim de alcançar a mais alta reprodutibilidade possível entre experiências. No entanto, a maioria das bombas são concebidos para manter uma pressão constante, por conseguinte, o medidor pode não ser essencial que os utilizadores experientes. Além disso, o selo de vácuo gordura podem ser usadas para ajudar a manter a pressão de vácuo.

3. A sublimação

1. Certifique-se de que a temperatura do banho de areia tem stabilizado a 140 ° C e que o aparelho é fixado no metal de O-ring acima do banho de areia com toda a tubagem ligado e o vácuo ligada.
2. Definir temporizador para 7 min, mas não iniciar o temporizador. Lentamente levantar o elevador de tesoura e areia banho até o aparelho de sublimação até o U-conjunta do sublimador está bem acima do metal O-ring. Este espaço extra permite o ajuste do aparelho sobre a areia.
   1. Pressione rapidamente a sublimador suavemente na superfície da areia para garantir que o aparelho está sentado uniformemente sobre a areia, e em seguida, iniciar imediatamente o temporizador.
3. Quando o temporizador soa, desligue a bomba de vácuo e baixe cuidadosamente o elevador de tesoura até o sublimador não está tocando o banho de areia e está bem presa no metal O-ring.
   1. Lentamente solte a válvula de micro-vent para liberar a pressão no aparelho. Solte a braçadeira de metal ao redor do tubo de borracha do aparelho sublimação e lentamente começam a soltar o tubo. Uma vez que o rubber tubo foi afrouxado ligeiramente, dobrar o tubo de um lado para permitir que a pressão residual de escapar.
   2. Quando os retornos de pressão ambiente, remova cuidadosamente o tubo de borracha do aparelho sublimação.
4. Solte os vícios do U-joint do aparelho e remover. Cuidadosamente separar as duas metades do aparelho de sublimação e retirar o slide a partir do topo do objeto de vidro interior. Examina a corrediça para confirmar a distribuição uniforme da matriz.
   NOTA: Se a matriz é desigual, a matriz em pó na parte inferior da sublimador pode ser reposicionada ou sublimador o aparelho pode ser reposicionada na areia para o slide seguinte. O processo de sublimação pode ser repetido várias vezes utilizando a mesma matriz, no entanto, a matriz acabará por se tornar mais escura por exposição repetida de calor e a quantidade de pó irá diminuir de tal forma que o tempo de sublimação terá de ser ligeiramente ajustados para compensar. Por esta razão, é importante controlar a quantidade de matriz being sublimou após cada experimento para assegurar a coerência na deposição de matriz entre os slides
5. Se a distribuição e quantidade de matriz sublimada é suficiente, grave um novo slide com o tecido para o interior da Secção sublimador e repita 3.
   NOTA: Para o controlo de qualidade (QC) fins, a quantidade de matriz sublimado pode ser medida após cada experiência por pesagem do diapositivo antes e após sublimação e dividindo o peso da matriz sublimada com a área de superfície da lâmina ^2, deve notar-se que devido à falta de precisão da maioria das escalas além de 4 pontos decimais e variabilidade entre escalas, estas medidas devem ser ser usado apenas um guia para a deposição de matriz ideal em oposição a um meio totalmente quantificáveis de QC a menos que uma balança de alta precisão é usado (veja a Figura 3).

4. Tissue Armazenamento / Reidratação

1. Depois de sublimação, loja desliza em um recipiente fechado ou pequena cassette em saco plástico selado.
2. Incubar as lâminas em freezer -20 ° C durante 2 h ou durante a noite.
   NOTA: O objectivo do processo de congelação é de actuar como um passo de re-hidratação para a dessorção de materiais de tecido no interior da matriz. O processo de congelamento também tem sido demonstrado para prevenir a degradação de sinais de lípidos durante até 1 semana, quando armazenados a -80 ° C ^12. Por esta razão, a quantidade de tempo que as amostras são armazenadas em congelador pode ser variado em certa medida de acordo com as necessidades do experimentador, sem alterar de forma significativa a detecção de sinal (como observado no nosso laboratório). No entanto, temos notado alguma descoloração da matriz quando as amostras são congeladas por mais de 24 h a -20 ° C. Assim, recomendamos a imagiologia do tecido sublimado antes que o tempo ou o armazenamento de tecido a -80 ° C durante períodos de incubação mais longos.
3. Retirar as lâminas do congelador (e recipiente) e coloque em um secador durante 5 - 10 min.

5. Imaging and Análise

1. Remover as lâminas da exsicador e aplicar normas de instrumentos para garantir a precisão massa de instrumento MALDI durante o exame. O tipo de padrões irá variar em função da instrumentação. Os padrões são geralmente aplicadas uniformemente ao longo de toda corrediça, em torno de tecido a ser visualizado (Figura 3D).
2. Inserir slide em instrumento MALDI e siga as instruções do fabricante para experimentos com imagens (métodos instrumento deve ser otimizado para um 1000 - faixa de massa 2,000). Resultado representativo (Figura 4) foi obtido em modo de reflectrão negativo com uma quadrícula de 70 uM e 20 disparos / espectro (aquisição em tempo ~ 2 h).

Após a conclusão da experiência sublimação, as duas metades do aparelho de vidro estão separadas no exaustor de fumos e a corrediça, gravado para o condensador, pode ser removida (Figura 3A). Neste ponto, a lâmina deve ser examinada para a distribuição desigual de matriz e o tempo, a temperatura, ou a colocação do aparelho em banho de areia pode ter que ser ajustada para o slide seguinte. Um experimento sublimação DAN bem sucedido resultará num revestimento uniforme da matriz de cinza / castanha ao longo da superfície da lâmina onde as características anatómicas do tecido pode ser claramente visualizadas e a quantidade de matriz sobre a lâmina de vidro é semelhante à quantidade no tecido (Figura 3B). Por exemplo, se demasiado matriz foi sublimada sobre o tecido, a espessura da matriz irá cobrir as características do tecido e apenas a forma geral será discernível. No entanto, muito pouco se matriz é sublimado, o tecido vai have uma aparência mais escura do que o resto da lâmina (Figura 3C). Ambos muito e muito pouco matriz irá resultar em mau sinal no instrumento MALDI. Para efeitos de controlo de qualidade, Thomas et al. pesava a quantidade de matriz depositado na corrediça e dividido o peso por área da superfície da lâmina. Eles relataram uma quantidade ideal de deposição de matriz para várias matrizes incluindo DAN (110 ug / cm) 2. Embora a maioria dos saldos não têm a precisão necessária para replicar esses resultados, temos tentado este método de QC; No entanto, devido a um elevado grau de variabilidade, que só pode aconselhar uma gama adequada de deposição de matriz verificou-se estar associada bem sucedida contra sublimação experiências mal sucedidas com matriz DAN tal como determinado através de detecção de sinal no instrumento. A medição da matriz de abaixo de 100 mg / cm² foi associado com "muito pouco" condições de matriz, enquanto uma medida de acima de 140 mg / cm² foiassociado com "muito". deposição de matriz entre 100 e 140 ug / cm verificou-se ser uma quantidade óptima para a imagiologia com matriz DAN. Padrões de calibração deve ser aplicado sobre a lâmina de vidro em torno das amostras de tecido para assegurar a precisão de massa dos sinais detectados de IMS (Figura 3D)

Numa experiência MALDI IMS, a imagem molecular permite a visualização da distribuição espacial do analito de interesse, juntamente com quaisquer espécies desconhecidas que podem estar presentes em um determinado intervalo de massa. As imagens moleculares de gangliósidos nesta experiência foram sobrepostas utilizando o software ImageJ para mostrar a distribuição anatómica de várias espécies de gangliósidos em todas as regiões corticais e subcorticais do cérebro do rato (Figura 4A). Os gangliosídeos mais abundantes no cérebro são as espécies A-série GD1a e GM1, mas também contêm gangliosídeos GM2 e GM3, que podem ser encontrados entre o1.000-2.000 m / z gama de massa, uma gama de massa mais elevada do que a maioria dos lípidos do cérebro comuns, tornando estes gangliosidos fácil de identificar no espectro (Figura 4B). A abundância iónica de cada espécie de gangliósidos podem ser usados ​​para semi-quantificar as diferenças ou alterações nas espécies de gangliósidos no seio da mesma imagem. Uma vez que uma determinada quantidade de variabilidade de preparação da amostra não pode ser evitada em IMS, entre comparações de análise são considerados para ser semi-quantitativa.

Figura 3. DAN sublimação. Os resultados representativos de sublimação da matriz DAN no tecido cerebral de ratos. (A) Após a conclusão da sublimação, as duas metades do aparelho são separadas e a lâmina é removido a partir do condensador. Matriz (B) a DAN se espalha uniformemente através de múltiplas secções de tecido de cérebro de rato sobre a superfície da lâmina para permitir altamente reproducible resultados (entre 100-150 ng / cm). (C) Os exemplos de experiências de sublimação falharam, onde muito pouco matriz (esquerda - <90 mg / cm²) ou demasiado matriz (à direita -> 150 mg / cm²) foi depositado. Muito pouco matriz irá resultar em dessorção dos analitos insuficiente, enquanto muito matriz não vai permitir que o laser para penetrar no tecido durante a aquisição, o que resulta na detecção de baixa de iões. (D) Lâmina contendo secções de tecido de cérebro de rato sublimados com os padrões da matriz e calibração DAN aplicadas está pronto para inserção instrumento MALDI para a imagem latente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. IMS MALDI de gangliosídeos no cérebro de um rato. representantee MALDI IMS imagem molecular e espectro de massa de gangliosídeos no cérebro de ratos, após sublimação com a matriz DAN. A imagem molecular é um compósito de várias espécies de gangliósidos no espectro sobrepostas e pseudocolored usando o software Image J. mostrar a distribuição anatómica original de espécies de gangliósidos por todo o cérebro. Espécies GM1d18: 1 (vermelho, massa ~ 1.547 Da), GM1d20: 1 (verde, massa ~ 1.573 Da), GM3d18: 1 (azul, massa ~ 1.178 Da), e GM3d20: 1 (cerc, massa ~ 1.207 Da) são representados. O espectro de massa exibe abundância iónica de analitos dentro de um 1000 - faixa de massa de 2.000. Os principais gangliósidos Uma série são marcados ao longo do espectro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar.