Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa

Resumo

Um protocolo para a sublimação da matriz DAN no tecido cerebral de ratos para a detecção de gangliosídeos usando espectrometria de massa de imagem MALDI é apresentado.

Resumo

A preparação da amostra é a chave para a detecção e a visualização de analitos em experiências com laser assistida por matriz de Dessorção / ionização (MALDI) Imagiologia espectrometria de massa (IMS) óptima. Determinação do protocolo apropriado para seguir em todo o processo de preparação da amostra pode ser difícil já que cada passo tem de ser optimizado para satisfazer as características únicas dos analitos de interesse. Este processo envolve não só em encontrar uma matriz compatível que pode desorver e ionizam as moléculas de interesse de forma eficiente, mas também seleccionar a técnica de deposição de matriz apropriada. Por exemplo, uma técnica de deposição húmida da matriz, o que implica a dissolução de uma matriz no solvente, é superior para a dessorção da maior parte das proteínas e péptidos, enquanto que as técnicas de deposição de matriz secas são particularmente eficazes para a ionização de lípidos. A sublimação foi classificado como um método altamente eficiente de deposição da matriz seco para a detecção de lípidos no tecido por MALDI IMS devido à homogeneity de deposição de cristais de matriz e mínima deslocalização analito, em comparação com muitos métodos de deposição molhadas ^{1, 2.} Em termos gerais, que envolve colocar uma amostra em pó e a matriz em uma câmara de vácuo com as amostras pressionada contra uma superfície fria. O aparelho é então reduzido para um banho aquecido (areia ou óleo), resultando em sublimação da matriz em pó sobre a superfície da amostra de tecido arrefecida. Descrevemos aqui um protocolo de sublimação utilizando 1,5-diaminonaftaleno matriz (DAN) para a detecção e a visualização de gangliósidos no cérebro de rato utilizando MALDI IMS.

Introdução

laser assistida por matriz de Dessorção / ionização (MALDI) Imagiologia espectrometria de massa (IMS) está a tornar-se uma técnica muito procurado para a visualização da distribuição espacial dos lípidos, péptidos e proteínas através de superfícies intactas de amostra. MALDI IMS foi anteriormente conhecido como uma técnica analítica para analitos pré-purificado, mas em anos recentes, tem-se chamar a atenção em muitas outras disciplinas por causa da capacidade de combinar a precisão de espectrometria de massa com pontos de referência de alta resolução visuais / anatómicas sem a precisa para qualquer rotulagem externo. Como a associação científica dos investigadores qu....

Protocolo

Todos os procedimentos de manipulação animal descrito abaixo aderir à Universidade do comitê de cuidados com os animais de Western Ontario (2016-014).

1. Preparação de tecidos e Seccionamento

1. Extraia o tecido cerebral de ratos através de um processo conhecido como "Fresco Congelado Extraction" (FFE).
   1. Euthanize o rato com uma overdose de pentobarbital de sódio e monitorar reflexos nos membros. Uma vez que todos os reflexos cessaram, cortar a cabeça do rato, utilizando uma guilhotina.
   2. Cuidadosamente separar os músculos e outros tecidos do crânio utilizando um bisturi. Use uma pinça de corte de osso para quebrar....

Resultados

Após a conclusão da experiência sublimação, as duas metades do aparelho de vidro estão separadas no exaustor de fumos e a corrediça, gravado para o condensador, pode ser removida (Figura 3A). Neste ponto, a lâmina deve ser examinada para a distribuição desigual de matriz e o tempo, a temperatura, ou a colocação do aparelho em banho de areia pode ter que ser ajustada para o slide seguinte. Um experimento sublimação DAN bem sucedido resultará num revestimento uniforme da m.......

Discussão

Este trabalho detalha um protocolo padronizado de sublimação matriz em tecidos para a detecção de lípidos carregados negativamente, tais como gangliósidos, em experimentos MALDI IMS. A preparação da amostra para MALDI IMS é altamente variável e deve ser personalizado para atender as propriedades únicas do analito de interesse. A aplicação da matriz sobre a superfície da amostra de tecido é um aspecto essencial do processo de preparação da amostra que diz respeito à qualidade dos resultados em IMS. Um cuidado especial de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sublimator	Chemglass Life Sciences	CG3038-01
1,5-Diaminonaftaleno (DAN) matriz	Sigma-Aldrich	D21200	100 gramas
Cryostat	Thermo-Fisher Scientific		CryoStar NX50
Placa quente com feedback de temperatura	Thermo-Fisher Scientific	HP88857290	Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V
Macaco de Aço Inoxidável	Thermo-Fisher Scientific	2216479	10x10
Cold Trap			Bomba de vácuo personalizada no local
Franklin	Electric	1102180403	Savant VP100
Slides de óxido de índio-estanho (ITO)	Tecnologia de superfície Hudson	PSI 1111000	tipo II, 1,1 mm/25 cada
MALDI TOF/TOF 5800 Instrumento	AB Sciex
Dessecador	Sigma-Aldrich	D2797	dessecador de mesa