Uma estratégia para gerar mutações em genes de histonas em sua localização endógena em Saccharomyces cerevisiae é apresentada.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Descrevemos um sistema baseado em PCR e recombinação homóloga para gerar mutações direcionadas em genes de histonas em células de levedura em brotamento. Os alelos mutantes resultantes residem em seus sítios genômicos endógenos e nenhuma sequência de DNA exógena é deixada no genoma após o procedimento. Uma vez que em células de levedura haplóides cada uma das quatro proteínas histonas principais é codificada por dois genes não alélicos com quadros de leitura abertos (ORFs) altamente homólogos, direcionar a mutagênese especificamente para um dos dois genes que codificam uma proteína histona específica pode ser problemático. A estratégia que descrevemos aqui contorna esse problema utilizando sequências fora, e não dentro, da ORF dos genes-alvo para a etapa de recombinação homóloga. Outra característica desse sistema é que as regiões do DNA que conduzem as etapas de recombinação homóloga podem ser muito extensas, aumentando assim a probabilidade de eventos de integração bem-sucedidos. Essas características tornam essa estratégia particularmente adequada para a mutagênese do gene das histonas, mas também pode ser adaptada para a mutagênese de outros genes no genoma da levedura.
Introdução
Os quatro proteínas histonas centrais H2A, H2B, H3, H4 e desempenham papéis centrais na compactação, organização e função dos cromossomas eucarióticos. Dois conjuntos de cada uma destas histonas formar o octâmero da histona, um carretel molecular que dirige o invólucro de ~ 147 pares de bases de ADN em torno de si, resultando na formação de um nucleossoma 1. Nucleossomas são agentes activos numa variedade de processos à base de cromossomas, tais como a regulação da transcrição de genes e a formação de eucromatina e heterocromatina entre cromossomas, e, como tal, têm sido o foco de intensa investigação ao longo de várias décadas passadas. Um nú....
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Protocolo
NOTA: A estratégia experimental para o alvo de mutagénese in situ do gene histona inclui várias etapas (resumidos na Figura 1). Estes passos incluem: (1) A substituição do gene alvo de histona com o gene URA3, (2) Geração e purificação de produtos de PCR correspondentes a dois fragmentos que se sobrepõem parcialmente do gene histona alvo utilizando iniciadores que albergam a mutação desejada (s), (3 ) fusão por PCR de dois fragmentos que se sobrepõem parcialmente de obter produtos de PCR completa tamanho para a integração, (4) co-transformação de produtos de PCR de tamanho completo e plasmídeo de esqueleto, e de selecção pa....
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Resultados
Descrevemos a geração de um alelo hht2 expressando uma proteína mutante da histona H3 abrigando uma substituição na posição 53 a partir de uma arginina para um ácido glutâmico (H3-R53E mutante) como um exemplo representativo do alvo na estratégia de mutagénese in situ.
Geramos uma estirpe em que toda a ORF de HHT2 é substituído pelo gene URA3 (veja o passo 1 do protocolo). .......
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Discussão
O nível elevado de homologia de sequências entre os dois genes não alélicos que codificam para cada uma das quatro proteínas histona de núcleo em células haplóides de S. cerevisiae pode representar um desafio para os investigadores que desejam atingir especificamente um dos dois genes para a mutagénese. Anteriormente descreveu metodologias de mutagénese de levedura, incluindo a Delitto Perfetto, genómico de mutagénese específica do local (SSG), e métodos de substituição alelo baseada em PCR livre de cl.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Reine Protacio pelos comentários úteis durante a preparação deste manuscrito. Expressamos nossa gratidão à National Science Foundation (subsídios nº 1243680 e 1613754) e ao Hendrix College Odyssey Program pelo apoio financeiro.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 kb DNA Ladder (padrões de DNA) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Ácido Bórico | Sigma | B0394-500G | |
| mistura dNTP (10 mM cada) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| Solução EDTA (0.5 M, pH 8.0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Etanol (200 Provas) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico di-hidratado (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Acetato de lítio di-hidratado | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Termociclador | BioRad | 170-9703 | |
| Poli(etilenoglicol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polymerase (DNA polimerase de alta fidelidade) e 5x buffer | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Solução de DNA de esperma de salmão | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (base Tris, forma de pó) | Sigma | T1378-1KG | |
| Acetato de sódio trihidratado | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarose (agarose de baixa temperatura) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polimerase e 10x Buffer | New England BioLabs | M0273X | |
| Palitos de dente | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| a-D(+)-Glucose | Fisher Scientific | AC170080025 | para meios de levedura |
| Agar Fisher Scientific | DF0140-01-0 | para meios de levedura | |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | para YPD meio |
| Extrato de Levedura | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | para meio YPD |
| 4-aminobenzoico ácido | Sigma | A9878-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| Adenine | Sigma | A8626-100G | para meio de dropout mínimo completo |
| Cloridrato de glicina | Sigma | G2879-100G | para meio de dropout mínimo completo |
| L-Alanina | Sigma | A7627-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| Cloridrato de L-Arginina | Sigma | A5131-100G | para meio de queda mínima completa |
| L-Asparagina monohidratada | Sigma | A8381-100G | para meio de queda mínima completa |
| Sal de sódio de ácido L-aspártico monohidratado | Sigma | A6683-100G | para meio de queda mínima completa |
| Cloridrato de L-cisteína monohidratado | Sigma | C7880-100G | para meio de queda mínima completa |
| Cloridrato de ácido L-glutâmico | Sigma | G2128-100G | para meio de dropout mínimo completo |
| L-Glutamina | Sigma | G3126-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| Cloridrato de L-Histidina monohidratado | Sigma | H8125-100G | para meio de dropout mínimo completo |
| L-Isoleucina | Sigma | I2752-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| L-Leucina | Sigma | L8000-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| Cloridrato de L-lisina | Sigma | L5626-100G | para meio de queda mínima completa |
| L-Metionina | Sigma | M9625-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| L-Fenilalanina | Sigma | P2126-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| L-Serine | Sigma S4500-100G | para um meio de dropout mínimo completo | |
| L-Treonina | Sigma | T8625-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| L-Triptofano | Sigma | T0254-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| L-Tirosina | Sigma | T3754-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| L-Valina | Sigma | V0500-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | para meio de queda mínima completa |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | para meio de abandono mínimo completo |
| Sulfato de Amônio | Fisher Scientific | A702-500 | para meio de abandono mínimo completo |
| Base de Nitrogênio de Levedura | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | para meio de dropout mínimo completo |
| Ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | para meio 5-FOA |
Referências
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Rand....
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Reimpressões e permissões
