Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Summary

Protocolos para gerar linhagens mutantes HPSC usando a plataforma iCRISPR e diferenciar hPSCs em células ß-like glicose-responsivos são descritos. Combinando tecnologia de edição de genoma com a diferenciação HPSC-dirigida fornece uma plataforma poderosa para a análise sistemática do papel das determinantes da linhagem no desenvolvimento humano e progressão da doença.

Abstract

Interrogando a função do gene em auto-renovação ou diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) oferece uma plataforma valiosa para a compreensão do desenvolvimento humano e dissecar os mecanismos da doença em um prato. Para capitalizar sobre esta aplicação potencial requer ferramentas de edição de genoma eficientes para gerar mutantes HPSC em genes associados à doença, bem como in vitro protocolos de diferenciação HPSC para produzir tipos de células doenças relevantes que recapitulam de perto os seus homólogos em vivo. Uma plataforma de edição de genoma eficiente para hPSCs chamado iCRISPR foi desenvolvido através da segmentação TALEN mediada de uma cassete de expressão Cas9 no locus AAVS1. Aqui, são descritos os protocolos para a geração de linhas Cas9 HPSC indutíveis utilizando células cultivadas num meio quimicamente definido e livre de uma condição de alimentação. Os procedimentos detalhados para utilizar o sistema iCRISPR para knockout gene ou alterações genéticas precisas em hPSCs, seja através de nem homóloga extremidade de união (NHEJ) ou através de alterações de nucleótidos precisos utilizando um modelo de reparação dirigida por homologia (HDR), respectivamente, estão incluídas. Estes procedimentos técnicos incluem descrições de concepção, produção e transfecção de RNAs guia CRISPR (gRNAs); a medição da taxa de mutação por meio de ensaios CRISPR ou T7E1 RFLP; ea criação e validação de linhas mutantes clonais. Finalmente, procedimentos crônica de diferenciação HPSC em células beta-pancreáticas como glicose-responsive imitando no desenvolvimento embrionário de pâncreas vivo. Combinando tecnologia iCRISPR com a diferenciação HPSC dirigido permite que o exame sistemático da função do gene para promover nossa compreensão dos mecanismos de desenvolvimento e doença diabetes pancreáticas.

Introduction

As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) têm a capacidade de se auto-renovar ambos e dão origem a todos os derivados das três linhagens germinais embriónicas. Eles fornecem um recurso valioso para a terapia de substituição celular e modelagem de doença, servindo como uma plataforma única para recapitular processos celulares em um contexto de desenvolvimento humano. Eles são também uma fonte de células experimentais para análises escaláveis, de alto rendimento. No entanto, o progresso tem sido limitado devido a dois desafios principais: a falta de ferramentas de modificação genética eficientes e a dificuldade em recapitulando as etapas de desenvolvimento embrionário complexos em um prato de cultura.

A modificação genética é uma ferramenta indispensável para estudar a função do gene em desenvolvimento normal e doença. No entanto, enquanto gene clássica visando abordagens através de recombinação homóloga tem provado ser uma ferramenta poderosa para dissecar a função do gene de rato em células estaminais embrionárias (mESCs) ^1, esta abordagemtem sido extremamente ineficiente quando aplicada para hPSCs ^{2, 3.} A recente adesão rápida de nucleases programáveis, específicas do local da natureza para uso em laboratório, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs), transcrição ativador-like nucleases efetoras (TALENS), e os aglomerados regularmente intercaladas repete palindr�icas curtas (CRISPR) / CRISPR-associados (CAS) sistemas ^4, significa que a engenharia genoma tornou-se uma tarefa muito mais fácil, em uma grande variedade de microrganismos e linhas de células, incluindo em hPSCs. Estas ferramentas de edição gene de tirar vantagem do facto de que as nucleases quiméricos, tais como a endonuclease Cas9 pode permitir que uma ampla gama de modificações genéticas através da indução de quebras de cadeia dupla (DSB) em locais precisos, provocando a endógeno máquinas de reparação do ADN para activar quer não homóloga acabar juntar (NHEJ) ou reparação dirigida por homologia (HDR). Ambos os mecanismos podem ser explorados para a manipulação genética através da indução de either inserção aleatória e mutações de deleção (indels; via NHEJ), para criar mutações frameshift que anulam alelos do gene, ou substituições de nucleotídeos precisos (via HDR), a recapitular mutações do paciente para modelar doenças humanas ou para corrigir uma mutação causadora da doença para a terapia genética .

CRISPR / engenharia genoma CAS-mediada requer dois componentes: a constante de endonuclease de Cas9 guiada por ARN necessárias para a clivagem de ADN e ARN de um CRISPR variável (crRNA) e duplex de trans-activação (tracrRNA) que especifica o reconhecimento alvo de ADN. O duplex crRNA / tracrRNA pode ser substituído com um único ARN quimérico guia (gRNA), que foram encontrados para trabalhar mais eficientemente ^{5, 6, 7.} Embora o sistema de / Cas9 CRISPR foi adaptada para os organismos mais experimentais e linhas celulares, o fornecimento e expressão de Cas9 e gRNA varia de forma significativa e deve ser optimizadas para Achieve edição genoma eficiente em muitos sistemas, incluindo hPSCs ^8. Uma plataforma de edição de genoma eficiente, iCRISPR, foi criada em hPSCs ^5. Neste sistema, uma abordagem TALEN mediada tem sido utilizado para segmentar os dois alelos do AAVS1 "transgene de locus de porto seguro" em trans, um alelo com um transactivador reverso controlado por tetraciclina (M2rtTA) e o outro com um elemento de resposta a tetraciclina (TRE ) que conduz a expressão de Cas9 (iCas9) nas hPSCs. Em linhas clonais estabelecidos (iCas9 hPSCs), Cas9 é altamente expressa com o tratamento doxiciclina. Entretanto, devido ao seu tamanho pequeno (100 nt), gRNAs únicas ou múltiplas podem ser facilmente entregue em iCas9 hPSCs com alta eficiência e pode dirigir Cas9 para a clivagem específica do local, permitindo eficiente disrupção do gene NHEJ-mediada, bem como HDR mediada modificações precisas de nucleótidos na presença de modelos de doadores curtas de ADN de cadeia simples (ADNcs). O sistema pode ser iCRISPRutilizada com sucesso para gerar um painel de linhas HPSC-simulando doença com bialélico (homozigota ou heterozigota composto) ou mutações heterozigóticas de perda de função em importantes genes de desenvolvimento ^{5, 9.} Enquanto um número de grupos relataram edição gene eficiente usando CRISPR / Cas em hPSCs, o sucesso continua a ser limitada a um pequeno número de laboratórios adeptos da tecnologia. A plataforma iCRISPR oferece uma solução eficiente, mas simples para edição gene rotina por pesquisadores de diferentes níveis de habilidade, e já tem sido utilizado em uma série de estudos publicados por nosso grupo e outros ^{9, 10, 11, 12.} Esta abordagem tem também sido alargado para silenciamento indutível com base na expressão de dCas9-KRAB ^13.

Junto com o progresso de edição de genoma technologia, melhorias significativas também foram alcançados na manutenção HPSC e diferenciação dirigida. Condições de cultura para hPSCs evoluíram a partir de condições do meio do mouse irradiado fibroblastos embrionárias (IMEF) às condições de livre-feeder sobre componentes da matriz extracelular definidos, e de formulações de meios complexos dependentes de alimentador química definida ^14. Tais melhorias reduziram a variabilidade na hPSCs devido a diferenças de lote para lote em componentes de substituição de preparação e soro knockout IMEF, e, assim, proporcionar um ambiente mais reproduzível para a diferenciação HPSC. Enquanto isso, um melhor conhecimento das vias de sinalização que regulam o desenvolvimento embrionário humano, bem como as descobertas de exames de drogas de alto rendimento, levaram ao aperfeiçoamento de protocolos de diferenciação ^{15, 16, 17, 18.} Estes protocolos mais de perto imitar em vivo etapas de desenvolvimento e gerar tipos de células que recapitulam de perto os seus homólogos em vivo. Para a diferenciação HPSC na linhagem de pâncreas, protocolos iniciais imitou o desenvolvimento pancreático precoce relativamente bem, mas eventualmente gerado células p polyhormonal que eram de fenótipos fetais imaturos e responderam mal ao estímulo da glicose. Os avanços recentes ^{16, 17, 19, 20,} têm permitido a geração de células beta-pancreáticas como glucose-responsivo, que nos permitirão investigar acontecimentos posteriores, como a formação e ainda a maturação de células beta monohormonal.

Aqui, nós pormenor a aplicação de linhas modificada do genoma para o estudo do desenvolvimento pancreático combinando o sistema iCRISPR com a diferenciação in vitro plataforma baseada em direcção HPSC pancr glucose-responsivocélulas beta-like eatic. Este acoplamento de poderosas ferramentas de edição genoma com uma melhor protocolo de diferenciação HPSC não só oferece a velocidade ea escala necessária para atender à crescente demanda por validar a causalidade da doença, mas também permite manipulações genéticas sofisticadas para novas investigações mecanicistas para controlo da transcrição subjacentes ao desenvolvimento normal e de doenças ⁹ .

Protocol

Este protocolo é baseado no nosso trabalho com linhas HPSC H1, HUES8, e Mel-1 na condição química definida e sem alimentação (Consulte o Material e Tabela Equipment). Para outras linhas HPSC ou hPSCs mantidos em diferentes condições de cultura, uma maior optimização é recomendada.

1. Cultura HPSC na condição química definida e sem Alimentador

1. Adaptar a cultura HPSC em alimentadores IMEF para a condição livre de alimentador. Nos casos em que células congeladas não sobrevivem bem quando recuperados diretamente na condição livre de alimentador, recuperar células em condição IMEF primeiro e depois adaptar-se à condição de livre de alimentador.
   NOTA: De um modo geral, leva-se 2 passagens para hPSCs cultivadas em alimentadores IMEF para ser adaptado para o estado livre de alimentador.
2. Mudar o meio todos os dias e passagem dos hPSCs quando as células atingiram ~ 80% de confluência. Em geral, a passagem no hPSCs ~ 1: 6 - 1:15 rácios cada 4 - 6 dias. Adiciona-se 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632 WHen descongelamento ou passagem das células.
3. Antes de semear as hPSCs, placas de cultura de pré-revestimento com 5 ug / ml (1 ml / 10 ^cm2) truncada forma humana recombinante de vitronectina (VTN) durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente (RT). Além disso, preparar o meio quimicamente definido completa por adição de suplemento no meio basal.
4. Remover o meio de cultura, lave as células uma vez com PBS sem Ca ²⁺ e Mg ^2+, e tratar as células com EDTA 0,5 mM durante ~ 2-5 min a RT.
5. Aspirar o EDTA antes das colônias têm destacado. Com pipetagem suave, dispersar as colónias HPSC em pedaços pequenos e voltar a suspender as células em meio completo.
6. Recolher os hPSCs dissociados e girar as células a 200 xg durante 5 min. Volte a suspender as hPSCs peletizadas no médio completo e semear as células em placas VTN-revestidos.

2. Geração de iCas9 HPSC Lines

1. Ordem e amplificar as seguintes plasmídeos: AAVS1-TALEN-L, AAVS1-TAlen-R, AAVS1-neo-M2rtTA, e AAVS1-puro-iCas9.
   NOTA: Para evitar casos de recombinação inesperados, utilização de células competentes de recombinação Stbl3 deficiente para a transformação e de amplificação dos plasmídeos a 30 ° C.
2. Normalmente, preparar os hPSCs em um 10 cm prato (~ 1 x 10 ⁷ células se ~ 80% confluentes) para uma experiência de segmentação.
   Observação: Uma vez que a electroporação geralmente provoca a morte celular significativa e o gene TALEN mediada segmentação no locus AAVS1 requer selecção antibiótico, um número relativamente grande de células têm de ser semeadas para identificar correctamente as células visadas. Optimização para as concentrações de droga é recomendado para cada linha celular e cada condição de cultura.
3. No Dia -1, (o dia antes de electroporação), adicionar inibidor ROCHA 10 uM durante a mudança de meio.
4. No Dia 0, (o dia da electroporação), para preparar as placas VTN-revestidos com antecedência.
5. Dissociar a hPSCs em células individuais USIng 1x reagente de dissociação (consulte o Material e Tabela Equipment). Resumidamente, remover o meio de cultura, lave as células uma vez com PBS sem Ca ²⁺ e Mg ^2+, e tratar as células com o reagente de dissociação 1x a 37 ° C durante ~ 3 min. Aspirar o reagente de dissociação antes de as células têm destacado. Com pipetagem suave, dispersar os hPSCs numa suspensão de uma única célula em 10,5 ml de meio completo.
6. Tome-0,5 mL de suspensão de células para contagem do número de células utilizando um contador de células automatizado. Agregar as hPSCs a 200 xg durante 5 min e ressuspender as células em frio (4 ° C) PBS a 12,5 x 10 ⁶ células / ml.
7. Adicionar os plasmídeos (ver Tabela 1) em 800 ul de suspensão HPSC (12,5 x 10 ⁶ células / ml) e misturar bem. Transferir a mistura para uma cuvete de electroporação de 0,4 cm e manter em gelo durante ~ 5 min.
8. Electroporate as células usando um sistema de electroporação a 250 V e 500 uF; os obs constante de tempoerved após a electroporação é geralmente 9 - 13 ms.
9. Após a electroporação, transferência das células para um tubo cónico de 15 mL com 5 mL de meio completo pré-aquecido. Crítico para a segmentação de sucesso: Use hPSCs proliferantes saudável e lidar com as células muito suavemente quando a transferência, ressuspensão, e plaqueamento das células após a eletroporação.
10. Agregar as células a 200 xg durante 5 min. Ressuspender as células em 10 mL de meio completo com 10 uM de inibidor ROCK e placa 1, 2,5, e 5 x 10 ⁶ células em cada um dos três pratos VTN-revestido, de 10 cm; isto assegura que, pelo menos, uma das placas terão número suficiente de colónias com uma densidade clonal de célula única colónia para colheita.
11. No Dia 1 (um dia após eletroporação), alterar o meio.
12. Nos Dias 2-5, começar a selecção de neomicina, quando as células são ~ 60% confluentes. Alterar a média diária com 500 ug de sulfato / mL G418; morte celular significativa devido à SelectioN se observa tipicamente 2 dias após selecção com G418.
13. No Dia 6, mudar o meio sem selecção de antibiótico.
14. Nos dias 7-9, iniciar a seleção puromicina. Mudar o meio dia, com 1 mg / mL dicloridrato puromicina; morte celular significativa devem ser observados no dia seguinte.
15. No dia 10, começam a mudar o meio dia, sem selecção de antibiótico até que as colónias de uma única célula HPSC chegar a 1 - 2 mm de diâmetro.
    NOTA: Normalmente, 50 colônias em cerca de 10 cm prato são observados com 2,5 x 10 ⁶ hPSCs banhado no Dia 0.
16. Escolha 12 - 24 colônias sob um microscópio estereoscópico. Mecanicamente desagregar as colónias HPSC em pedaços pequenos (~ 10 partes por colónia) utilizando uma agulha de 23-G (uma ponta de pipeta de 200 uL também é bom) e transferir as células directamente em placas de 24 poços revestidas com VTN.
17. Mudar o meio dia até as células se tornam confluentes. Passagem as células em cada poço das placas de 24 poços emduplicar os poços de placas de 6 poços.
18. Quando as células se tornavam confluentes em placas de 6 poços, usar um bem para um lote congelado e o outro bem para a extracção do ADN genómico para posterior caracterização.
19. Caracterizar e validar as linhas iCas9 estabelecidos por genotipagem PCR, transferência de Southern, análise de RT-qPCR, cariotipagem, e ensaio de pluripotência. Consulte Zhu et al. ²¹ para procedimentos experimentais detalhados.

3. Geração de HPSC Mutant Lines Usando o Sistema de iCRISPR

1. Geração de linhas knockout HPSC
   1. design e produção gRNA
      1. Escolha em regiões alvo do gene de interesse para maximizar a possibilidade de destruir a função da proteína de tipo selvagem. Para genes bem anotados, escolha uma região alvo a montante de um domínio funcional essencial. Alternativamente, gRNAs de design para atingir uma região a jusante do codão de iniciação. Escolha pelo menos 2 diferentesregiões para um gene de interesse.
      2. gRNAs de design usando a ferramenta de design CRISPR on-line (http://crispr.mit.edu). Para cada região-alvo, design 3 gRNAs com baixo potencial off-alvos e use aquele com a maior eficiência de segmentação para gerar a linhagem mutante clonal ^22.
         NOTA: De modo a atingir uma elevada eficiência genoma edição, recomenda-se a entregar gRNA como oligos de ARN em vez de ADN de plasmídeo em virtude da maior eficiência de transfecção de pequenos RNAs em comparação com os plasmídeos na experiência do passado.
      3. Por ordem de 120 nucleótidos (nt) oligos de ADN contendo a sequência do promotor de T7, a sequência variável de 20-nt crRNA reconhecimento (N) ₂₀ (não incluem a sequência de PAM), e a sequência de guia quimérico constante. Diluir os oligos a solução estoque 100-M em DDH ₂ O e preparar 250 nm como solução de trabalho.
         NOTA: TAATACGACTCACTATAGGG (N) ₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. Amplificar por PCR os oligos utilizando os primers de t7f e TracrR (ver Tabela 2) para produzir o ADN modelo de cadeia dupla (dsDNA) para gRNA transcrição in vitro (IVT). Utilizar 50 mL de mistura de reacção de PCR (ver Tabela 3) e condições de ciclos de PCR (ver Tabela 4).
      5. Usar um kit de transcrição de T7 de alto rendimento para a transcrição in vitro gRNA com o modelo amplificado por PCR em 20 ul, in vitro gRNA mistura de transcrição (ver Tabela 5) de acordo com as instruções do fabricante. Purifica-se os produtos gRNA utilizando o kit de limpeza de transcrição conforme as instruções do fabricante.
      6. Eluir gRNAs seguindo o protocolo de purificação de alto rendimento de acordo com as instruções do fabricante (tipicamente ~ 50 - 100 ug) em 100 ul de tampão de eluição. Ajuste a concentração para 320 ng / mL (10 mM), quando possível e armazenar a -80 &# 176; C até à sua utilização.
   2. PCR e Sanger projeto sequenciação
      1. Conceber e validar iniciadores de PCR amplificando a região alvo, com tamanhos de produtos tipicamente variando de ~ 500 - 1.000 pb.
      2. Sanger desenho iniciadores de sequenciação de ligação internamente para os produtos de PCR para permitir a sequenciação directa dos produtos de PCR sem purificação.
   3. gRNA transfecção em iCas9 hPSCs
      1. No Dia -1, o tratamento de células iCas9 com 2 ug / mL de doxiciclina 24 h antes da transfecção gRNA.
      2. No Dia 0 do gRNA transfecção, para preparar as placas VTN-revestidos com antecedência.
      3. Separar as células iCas9 em células individuais utilizando o reagente de dissociação 1x, tal como descrito na etapa 2.5.
      4. Agregar as hPSCs a 200 xg durante 5 min e ressuspender as células em ~ 0,5 x 10 ⁶ células / ml em meio completo suplementado com 2 ug / mL de doxiciclina e inibidor ROCHA 10 uM.
      5. Placa de 0,5 ml das células ressuspensas em poços individuais de placas de 24 poços. Prepare poços adicionais que servem como controlos não-transfectadas.
      6. Para cada gRNA, faça as seguintes misturas de transfecção: Misture A, 50 mL de meio de soro reduzido + 1 mL de gRNA (10 mM); Mistura B, 50 uL de meio de soro reduzido + 3 mL de reagente de transfecção.
      7. Combine Mix A e B para fazer 100 mL mistura. Incubar durante 5 min à TA. Adicionar 50 uL da mistura para as células em cavidades em duplicado das placas de 24 poços e misture bem.
      8. No Dia 1, executar uma segunda transfecção se necessário, para aumentar ainda mais a eficiência de segmentação. Caso contrário, altere o meio sem doxiciclina.
      9. Nos dias 2-3, alterar o meio dia.
      10. No Dia 4, extrai-se ADN genómico a partir de um poço de cada uma das células de controlo transfectadas e não transfectadas utilizando um estojo de extracção de ADN. Ajustar a concentração de 50 ng / μEU.
      11. Amplificar por PCR as regiões alvo que flanqueiam as sequências de direccionamento e gRNA estimar a eficiência de edição utilizando a endonuclease I de T7 digestão (T7EI) ou o ensaio de polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), como descrito anteriormente ^5.
   4. ensaio T7EI
      1. Amplificar por PCR a região alvo utilizando os primers concebidos e validados no passo 3.1.
      2. Preparar as misturas (ver Tabela 6) e efectuar a desnaturação do ADN e hibridação dos produtos de PCR, utilizando as condições descritas na Tabela 7.
         NOTA: Com base na nossa experiência, geralmente não é necessário purificar os produtos de PCR para o ensaio de T7EI quando utilizando nossas condições de PCR. No entanto, a purificação pode ser benéfica em outras condições.
      3. Executar uma digestão T7EI a 37 ° C durante 30 min, utilizando 10 uL de desnaturado e hibridizado produto de PCR e 0,2 mL (2 U) de T7E1 (10 U / ul).
      4. resolvPT As amostras de PCR T7E1-digeridos por eletroforese em gel. Use ImageJ para determinar as intensidades das bandas relativas de corte e DNA sem cortes. Calcular a frequência indel utilizando a fórmula: (1 - (√ (1- (b + c)) / (a + b + c))) x 100, onde a é a intensidade do produto de PCR digerido e b e c são as intensidades dos produtos T7E1-clivada.
   5. ensaio de RFLP
      NOTA: Nos casos em que um local de restrição está em estreita proximidade (<5 pb) a um local de clivagem Cas9 (3 pb 5 'da sequência de PAM), um ensaio de RFLP pode ser realizada para quantificar a frequência indel.
      1. Usar os mesmos produtos de PCR, tal como descrito no passo 3.1.4.1.
      2. Digerir o produto de PCR com uma enzima de restrição que contém um local de restrição em estreita proximidade com o local de clivagem Cas9.
      3. Resolver as amostras de PCR digerido por electroforese em gel. Use ImageJ para determinar as intensidades das bandas relativas de corte e DNA sem cortes. Calcula-se a indelfrequência utilizando a fórmula: a / (a + b + c) x 100, onde a é a intensidade do produto de PCR digerido e b e c são as intensidades dos produtos digeridos.
   6. Estabelecimento de linhas mutantes clonais
      NOTA: Genoma edição no hPSCs que utilizam o sistema iCRISPR com gRNA transfecção é altamente eficiente, e nenhuma seleção antibiótico é necessário. Para estabelecer linhas clonais, que é necessária para semear as células a uma densidade relativamente baixa para assegurar a formação de colónias derivadas de uma única célula.
      1. Identificar gRNAs com a maior eficiência edição (usando o T7EI ou ensaio RFLP) e com boa sobrevivência celular. Use a segunda via correspondente bem para clonal estabelecimento linhagem mutante.
      2. Dissociar a hPSCs em uma suspensão de uma única célula utilizando o reagente de dissociação 1x, tal como descrito na etapa 2.5. Replate 500, 1000, e 2000 células para cada uma das três pratos VTN-revestido, de 10 cm.
      3. Alterar o u diária médiaté o de uma única célula colónias atingir ~ 2 mm de diâmetro.
      4. Escolha 24 - 48 colónias para cada gRNA, dependendo da estimativa da eficiência pela segmentação T7EI e / ou ensaio de RFLP. Mecanicamente desagregar cada colónia em pedaços pequenos (~ 10 partes por colónia) utilizando uma agulha de 23-G (uma ponta de pipeta de 200 uL também é bom) e replate as células em duplicado VTN-revestidos, placas de 96 poços. Use uma placa para a extração de DNA genômico e sequenciamento Sanger e a outra placa para uma maior expansão.
      5. Quando as células em placas de 96 poços se tornaram confluentes, extrair o ADN genómico (sem extracção com fenol / clorofórmio), utilizando um protocolo simples, como descrito abaixo.
      6. Remover o meio e lava-se as células uma vez com PBS sem Ca ²⁺ e Mg ^2+. Adicionar 50 mL de tampão de lise (5 ul de proteinase K (10 mg / mL), 5 uL de tampão de PCR 10x, e 40? L de _ddH2O) a cada poço de uma placa de 96 poços. Selar a placa usando uma película adesiva e incubate durante a noite a 55 ° C.
      7. No dia seguinte, transferir os lisados ​​de células para uma placa de PCR de 96 poços e incubar durante 10 min a 99 ° C num termociclador para inactivar a proteinase K.
      8. Amplificar por PCR a região alvo utilizando os mesmos iniciadores que para a T7EI ou ensaio de RFLP, utilizando 1 mL de lisado de células como modelo.
      9. Use 1 uL do produto de PCR para a sequenciação de Sanger, com uma ligação internamente para o produto de PCR de iniciadores.
      10. Amplificar os clones com mutações InDel quadro de leitura para os estoques congelados. Além disso, amplificar um par de clones de tipo selvagem da mesma experiência segmentação para servir linhas de controle como isogênicos para novas experiências.
2. Geração de linhas mutantes com alterações de nucleótidos precisos
   NOTA: Em comparação com os mutantes gerados por knockout extremidade não-homóloga de união (NHEJ), a alteração de nucleótido preciso pode ser conseguido através de homologia dirigida-reparação (HDR) na presença de ADN repair modelos. Tais alterações de nucleótidos precisos permitir a geração de mutações específicas de pacientes em hPSCs de tipo selvagem e para a correcção de mutações em iPSCs derivadas de pacientes.
   1. Projeto de ssDNA como um modelo HDR
      1. Concepção e produzir 2 - 3 gRNAs em estreita proximidade com uma mutação específica para cada paciente, conforme descrito no passo 3.1.1.
      2. Design de um ADN de cadeia simples (ADNcs) contendo a mutação específica para cada paciente flanqueado por ~ 40 - 80 nt de homologia em cada lado como um modelo HDR.
      3. Para reduzir o corte adicional após a reparação correcta, introduzir uma mutação silenciosa para o molde de ADNcs na região dentro da sequência de reconhecimento gRNA e em estreita proximidade com a sequência de PAM ou na sequência de PAM em si, se possível.
      4. Se possível, conceber a mutação silenciosa para introduzir um local de digestão de restrição novo também de modo que ele pode ser usado para estimar a eficácia de reparação utilizando o ensaio de RFLP.
   2. Co-transfecção gRNA / ssDNA eo estabelecimento de linhas clonais
      1. Realizar a co-transfecção de gRNA / ADNcs em células iCas9, conforme descrito no passo 3.1.3, com misturas de transfecção A e B. Para cada gRNA e controlo não-transfectadas, transfectar as células em poços em duplicado de placas de 24 poços. Mistura A: 50? L de meio de soro reduzido + 1 uL de gRNA (10 uM) + 2 uL de ADNcs (10 uM). Mistura B: 50 uL de meio de soro reduzido + 3 mL de reagente de transfecção.
      2. Após a transfecção, extrair ADN genómico a partir de um poço de cada uma das células de controlo transfectadas e não transfectadas e estimar a eficácia de reparação utilizando a T7EI e / ou ensaio de RFLP.
      3. Identificar a mistura gRNA / ssDNA com a maior eficiência de reparação e sobrevivência celular bom. Use a segunda via correspondente bem para clonal estabelecimento linhagem mutante.
      4. Escolha 48 - 96 colónias, dependendo da estimativa da eficiência de segmentação pelo T7EI e / ou burro RFLPay. Em geral, a eficiência da mutação HDR mediada é inferior nocaute mutação e, portanto, mais colónias precisam de ser colhidos.
      5. Sequência, expandir e validar linhas clonais, conforme descrito no passo 3.1.6.

4. In Vitro HPSC diferenciação em células beta pancreáticas em glucose-responsivo

NOTA: Na diferenciação in vitro de mutantes HPSC em tipos de células doença relevante fornece uma plataforma para modelagem de doença em um prato. O protocolo seguinte centra-se na diferenciação in vitro de hPSCs em células beta do pâncreas de glicose-responsivos para estudos de desenvolvimento e diabéticos pancreáticas ^{9, 16, 17.}

1. diferenciação HPSC em endoderme definitiva
   1. Manter mutantes HPSC e linhas de controle do tipo selvagem na condição química definida e alimentador de graça, como descreverd no passo 1.
   2. Para preparar as hPSCs para a diferenciação, dissociar os hPSCs utilizando o reagente de dissociação 1x e dispersá-los em suspensão de célula única em meio completo.
   3. Agregar as células a 200 xg durante 5 minutos e re-suspender as células em meio completo com 10 uM de inibidor ROCHA. Contar o número de células e semear as células em ~ 1,4 x 10 ⁵ células / ^cm2 em placas VTN-revestidos.
   4. Alterar o meio de 24 h após a semeadura.
   5. No Dia 0, iniciar a diferenciação após 48 h, quando as células atingiram 80% de confluência ~.
      NOTA: Para atingir alta eficiência de diferenciação do pâncreas, otimizando a densidade de semeadura e nível de confluência às 48 horas é recomendado para cada linha individual.
   6. Aspirar o meio e HPSC Lavar as células uma vez com PBS sem Ca ²⁺ e Mg ^2+.
   7. Mudar o meio-dia 0 médio (d0) diferenciação.
   8. Nos dias 1-2, altere o differentiation médio diário, de acordo com as receitas na Tabela 8.
   9. No dia 3, examinar os marcadores endoderme definitivas Sox17, Foxa2 e CXCR4 por coloração de imunofluorescência e citometria de fluxo.
2. Diferenciação endoderme definitiva em progenitor pancreático
   1. Nos Dias 3-9, continuar a diferenciação endoderme definitivo para a linhagem pancreático, alterando a forma diário, de acordo com as receitas na Tabela 9.
   2. No dia 7, examinar o progenitor pancreático (PP1) marcador Pdx1 cedo pela coloração de imunofluorescência e citometria de fluxo.
   3. No dia 10, examinar a tarde progenitor pancreático (PP2) marcadores Pdx1 e NKX6.1. Enquanto isso, prepare-se para transferir células PP2 a interface ar-líquido para posterior diferenciação em células endócrinas pancreáticas.
3. Endócrino pancreático diferemciação na interface ar-líquido
   1. Tratar as células PP2 com inibidor ROCHA 10 mM 4 h antes de dissociação.
   2. Remover o meio e lave as células uma vez com PBS sem Ca ²⁺ e Mg ^2+.
   3. Adicione 2 ml de reagente de dissociação de células 1x PP2 em um prato de 10 cm e incuba-se a 37 ° C durante 2-3 min.
   4. Aspirar o reagente de dissociação antes de as células têm destacado. Adicionar 10 ml de meio blar e dispersar as células PP2 em células individuais cuidado pipetando para cima e para baixo.
   5. Recolha a suspensão de uma única célula. Contar o número de células e pelete a 200 xg durante 5 min.
   6. Ressuspender o sedimento de células em ~ 0,5 x 10 ⁵ células meio de diferenciação / mL em S5 e manchar 5 - 10 mL de células por mancha num filtro Transwell Insert. Coloque 10 - 15 pontos em uma inserção de 6 poços e ~ 100 pontos em uma inserção de 10 cm.
   7. Adicionar meio S5 para o fundo de cada inserto Transwell, ~ 1,5 mL para inserções de 6 poços e ~ 8 mL de fou inserções de 10 cm.
   8. Alterar a média diária com as receitas da Tabela 10.
   9. Examine pancreático marcadores endócrinas Pdx1, NKX6.1 NEUROD1, NKX2.2, insulina, e glucagon no dia 34 de coloração de imunofluorescência e citometria de fluxo ^17.
   10. Examinar a função de células-β como HPSC-determinada com um ensaio de secreção de insulina estimulada por glucose (GSIS) ^{16, 17.}

Results

HPSC química definida e sem Alimentador Cultura Adaptação e Manutenção

hPSCs cultivadas em alimentadores IMEF pode ser rapidamente adaptado para placas VTN-revestidos na condição de cultura sem alimentação. A mesma razão de divisão como cultura alimentador IMEF normal pode ser utilizado durante a adaptação. A Figura 1A mostra morfologias típicas de hPSCs sobre alimentadores IMEF em meio à base de KSR e sobre uma superfície VTN-revestidas em meio isento de alimentador. A Figura 1B mostra uma alteração morfológica típica e o crescimento de colónias HPSC durante a primeira passagem de adaptação (4 dias). As células podem ser passadas mais ou congelado para experiências futuras. Realizar 2 - 3 passagens da cultura de adaptação antes de iniciar experimentos de diferenciação. Cariótipo também é recomendado após a adaptação, embora não se tenha observado anormalidades do cariótipo durante a fase de adaptação.

"Fo: manter-together.within-page =" 1 "> AAVS1 Geração de iCas9 HPSC linhas através TALEN mediada Segmentação

Como mostrado anteriormente, hPSCs foram electroporadas com um par de plasmídeos AAVS1 TALEN e Cas9 e M2rtTA plasmídeos ^5. A Figura 2A e B mostra o vector doador detalhada segmentação de criação e todo o procedimento para gerar linhas clonais iCas9 HPSC. Após a seleção de antibióticos, os clones derivados de uma única célula que apresentam tamanho adequado e morfologia típica HPSC estavam prontos para serem colhidos (10 - 12 dias após a eletroporação, Figura 2C). Normalmente ~ 50% dos clones estão corretamente direcionados sem integrações aleatórias, como verificado por Southern blot (Figura 2D) ^5. integração aleatória pode causar expressão gotejante de Cas9 na ausência de tratamento doxiciclina.

Eficiente Genetic MODIFICAÇÃO em hPSCs usando a plataforma iCRISPR

Em estabelecida iCas9 hPSCs, Cas9 é expressa com o tratamento doxiciclina e guiado para seu locus alvo pelos gRNAs transfectadas, onde ele gera LAP. Na ausência de um modelo de reparação, reparação do ADN através de NHEJ gera indels, que muitas vezes resultam em ruptura do gene ou nocaute. Na presença de um modelo de reparação (por exemplo, um doador de ADNcs), HDR pode ser empregue para alterações genéticas precisas, tais como a geração de uma mutação específica para cada paciente em um fundo HPSC de tipo selvagem ou corrigir uma variante genética associada à doença em paciente- iPSCs derivados (Figura 3A). Leva ~ 1 mês para gerar linhas mutantes clonais que utilizam o sistema iCRISPR. Após a indução iCas9 e gRNA transfecção, ensaios T7EI e / ou RFLP foram usadas para avaliar a eficiência de corte Cas9, e as células transfectadas foram depois semeadas como células individuais em placas de 10 cm a uma densidade baixa (~ 500 - 2 000células / prato de 10 cm). 10 - 12 dias mais tarde, os clones derivados de uma única célula foram colocadas nos poços de uma placa de 96 poços para expansão e caracterização adicional (ou seja, a genotipagem e Western blotting) (Figura 3B). Uma vez que o gene knockout iCRISPR mediada é altamente eficiente, nenhum processo de selecção é envolvida, e geralmente 20-50% mutantes bialélicos pode ser facilmente alcançada (Figura 3C) ^5. Para alterações genéticas eficientes e precisas, gRNAs são co-transfectadas com um doador de ADNcs carregando a alteração de sequência específica (por um pequeno mas específica alteração da sequência do genoma). Muitas vezes, para evitar a re-corte em alelos modificados, recomenda-se para incluir uma mutação silenciosa em estreita proximidade com, ou na sequência de PAM (Figura 3D). Com este sistema, ~ 10% dos clones que transportam a modificação do genoma mediada por HDR desejado sem alterações adicionais em ambos os alelos são alcançados (Figuras 3E). A rápida e pmodificação recise do genoma HPSC usando a plataforma iCRISPR nos permite fazer rapidamente e eficientemente linhas HPSC que servem como modelos para o estudo do desenvolvimento humano e da doença.

A diferenciação eficiente de hPSCs em relação às células-p, como glicose-responsivo

O progresso recente na diferenciação de pâncreas HPSC tem permitido o desenvolvimento de protocolos que recapitulam de perto o desenvolvimento embrionário de pâncreas. HPSCs indiferenciadas primeira diferenciada, em endoderme definitiva, em seguida, em Pdx1 + progenitoras pancreáticas precoces (PP1) e células progenitoras pancreáticas posteriores (PP2) Pdx1 + NKX6.1 +, e, finalmente, em glicose-responsive células ^{16, 17, 19 β-like, 20 , 23, 24.} estes PROTOCóis foram optimizadas para gerar de forma confiável beta-como células de glicose-responsive ⁹ Pdx1 + NKX6.1 + progenitoras pancreáticas e. A Figura 4A mostra os suplementos química detalhada utilizadas em cada fase de diferenciação. Normalmente, aproximadamente 80% de confluência de 2 dias após o plaqueamento de células inicial é ideal para iniciar a diferenciação de HUES8 hPSCs (Figura 4B). Testando várias densidades de semeadura diferentes é altamente recomendado para descobrir a condição otimizada para cada linha celular específica. Normalmente, pelo menos 75% Foxa2 Sox17 + + células na fase e 40% Pdx1 ED + + NKX6.1 células na fase PP2 pode ser conseguida (Figura 4C). Na etapa S5, a presença de uma forma semelhante a aura em torno do agregado de células é um indicador para a boa sobrevivência das células, o que é importante para uma maior diferenciação de células p-glucose como CPEP +-responsivo NKX6.1 + (Figura 4D ). Este protocolo é útil para estudar pancreático d humana evelopment e doença em um prato.

Figura 1. HPSC química definida e Manutenção livre de Alimentador e Cultura Adaptação de IMEF alimentadores. (A) Imagens representativas de hPSCs cultivadas no alimentador IMEF ou em VTN no dia 4, pronta para ser dividido. (B) a morfologia típica de hPSCs durante a primeira passagem da adaptação em cultura sem alimentador de um alimentador IMEF. Dia 4 hPSCs cultivadas em alimentadores IMEF foram divididas e colocadas em placas VTN-revestidas em meio definido quimicamente com inibidor de ROCK. A razão de divisão era a mesma que a razão de divisão habitual para a cultura em condições de alimentação IMEF. O meio foi trocado a cada dia sem inibidor de ROCK. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ve_content "fo: manter-together.within-page =" 1 ">
Figura 2. Geração de iCas9 HPSC Lines. (A) estratégia de segmentação para a geração de linhas iCas9 HPSC. Puro-Cas9 doadores e Neo-M2rtTA doadores foram alvo no locus AAVS1 humana por um par de AAVS1 TALENS. (B) Esquemas de todo o processo de segmentação, incluindo eletroporação, seleção de antibiótico, colônia colheita e expansão, e caracterização da linha celular. (C) clone de uma única célula Representante prontos para serem colhidos em cerca de 10-12 dias após a eletroporação. (D) exemplos Southern blot para identificar clones corretamente direcionados sem a integração adicional de dois plasmídeos doadores. clones corretos são marcadas em vermelho. (A) e (D) foram adaptados a partir de 5 de Referência, com a permissão.ig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Modificação Genética Eficiente em hPSCs Utilizar o sistema de iCRISPR. Esquemas (A) para a geração de mutantes knockout de genes ou modificação genética precisa usar o sistema iCRISPR. (B) Procedimento de Segmentação e criação de linha clonal. Eficiência knockout (C) Gene através NHEJ em hPSCs ^9. (D) Projeto de um ssDNA carregando uma modificação de nucleotídeos específica. P, em vermelho: mutação específica do paciente; X, em verde: mutação silenciosa. (E) Eficiência da modificação de nucleotídeos precisa HDR-mediada. Uma mutação R456C preciso (causada por um nucleótido específico C> mutação T) no locus GATA6 foi introduzido usando o sistema iCRISPR.(Consulte a Referência 5 para informações mais detalhadas). (C) e (E) foram adaptados a partir de Referência 9 e de referência 5, respectivamente, com as permissões. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Directed HPSC diferenciação em células beta-pancreáticas como glucose-responsivo. Esquema (A) do protocolo de diferenciação detalhada, com produtos químicos suplementadas em cada fase de diferenciação. vias de sinalização que são ativados ou inibidos durante a diferenciação são destacadas em verde ou vermelho, respectivamente. CHIR: inibidor de GSK3; factor de crescimento ou diferenciação da miostatina 8, um membro da família de proteínas TGF-beta;: GDF8 HH: Hedgehog; DE: endoderme definitivo; PP1:Pdx1 + progenitor pancreático precoce; PP2: Pdx1 + NKX6.1 + depois progenitor pancreático. (B) confluência típica (70 - 80%) de hPSCs 48 h após a sementeira, quando pronto para a iniciação da diferenciação. (C) imagens coloração de imunofluorescência mostrando a diferenciação representativos bem sucedido na endoderme definitivo (DE) fase (Foxa2 e co-coloração Sox17), fase progenitoras pancreático (PP2: Pdx1 e NKX6.1 co-coloração), e glucose-responsivo β- como estágio de célula (NKX6.1 e co-coloração c-peptídeo). Em geral, para conseguir mais do que 10% CPEP + + NKX6.1 células na fase de célula-β como, pelo menos 75% + células DE Sox17 Foxa2 + e + 40% Pdx1 células NKX6.1 PP2 + são necessárias nas fases correspondentes. (D) a morfologia típica de um agregado de células na fase S5 sobre uma membrana de filtro de inserção na cultura de interface ar-líquido. As células sobreviventes migraram para o centro do agregado (no escuro) e deixou-aura uma estrutura como na borda. (A (D) foram adaptados a partir de Referência 9 com permissões. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

plasmídeo	Montante
AAVS1-L-TALEN	5 ug
AAVS1-TALEN-R	5 ug
AAVS1-puro-iCas9	40 ug
AAVS1-Neo-M2rtTA	40 ug

tabela 1

cartilha	Seqüência
t7f	TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR	AAAAGCACCGACTCGGTGCC

mesa 2

tabela 3

Componente	Montante
ddH2O	35,5 mL
5x tampão de reacção de PCR	10 ul
de mistura de dNTP (25 mM)	0,5 ul
T7f (10 uM)	1,25 mL
TracrR (10 uM)	1,25 mL
T7-gRNA modelo de IVT (250 nM)	1 uL
DNA polimerase	0,5 ul
Total de mistura de reacção de PCR	50 ul

Condições dos ciclos de PCR
número do ciclo	Desnaturar	recozer	Ampliar
1	94 ºC, 2 min
2-31	94 ºC, 20 s	60 ºC, 20 s	72 ° C, 1 min
32			72 ºC, 2 min

tabela 4

Componente
T7 ATP	2 uL
T7 CTP	2 uL
T7 GTP	2 uL
T7 UTP	2 uL
tampão T7 10x	2 uL
T7 mistura de enzima	2 uL
PCR modelo amplificado	8 uL
In vitro gRNA mix total de transcrição	20 ul
Incubar a 37 ° C por 6 h durante a noite

tabela 5

Componente	Quantidade (mL)
Unpurified Produto PCR	8
Tampão 2 10x	2
Água destilada (dH2O)	10

tabela 6

Desnaturação e hibridação de ADN condições de ciclização
Temperatura	Duração	condições termociclador
95 ° C	10 min
85 ° C	1 minuto	Rampa de 85 ° C a 2 ° C / s
75 ° C	1 minuto	Rampa de 75 ° C a 0,3 ° C / s
65 ° C	1 minuto	Rampa de 65 ° C a 0,3 ° C / s
55 ° C	1 minuto	Rampa de 55 ° C a 0,3 ° C / s
45 ° C	1 minuto	Rampa de 45 ° C a 0,3 ° C / s
35 ° C	1 minuto	Rampa de 35 ° C a 0,3 ° C / s
25 ° C	1 minuto	Rampa de 25 ° C a 0,3 ° C / s
4 ° C	Aguarde

tabela 7

Etapa	Dia	meios de comunicação	Suplemento
S1	d0	S1	GDF8 100 ng / mL	CHIR-99021 3 uM
	d1	S1	GDF8 100 ng / mL	CHIR-99021 0,3 uM
	d2	S1	GDF8 100 ng / mL
Meios S1: MCDB 131 + 1x suplemento de L-glutamina + 0,5% de BSA + 1,5 g / L de NaHCO3 + 10 mM de glucose

Quadro 8

Etapa	Dia	meios de comunicação	Suplemento
S2	D3-D4	S1	LAA 0,25 mM	FGF7 50 ng / mL	IWP-2 2,5 uM
S3	D5-d6	S3	LAA 0,25 mM	FGF7 50 ng / mL	SANT-1 0,25 uM	RA 1 uM	LDN 100 nM	TPB 200 nM	ITS-X 1: 200
S4	D7-D9	S3	LAA 0,25 mM	FGF7 2 ng / mL	SANT-1 0,25 uM	RA 0,1 uM	LDN 200 nM	TPB 100 nM	ITS-X 1: 200	IWP-2 2,5 uM
Meios S3: MCDB 131 + 1x suplemento de L-glutamina + 2% BSA + 2,5 g / l de NaHCO 3 + 10 mM de glucose

tabela 9

Etapa	Dia	meios de comunicação	Suplemento
S5	D10-D12	S5	T3 1 uM	ALK5i II 10 uM	Sant-1 0,25 mM	RA 0,05 uM	LDN 100 nM	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 uM	A heparina 10 ng / mL
S6	d19 d13-	S5	T3 1 uM	ALK5i II 10 uM	GSiXX 100 nM		LDN 100 nM	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 uM	A heparina 10 ng / mL
S7	d33 d20-	S5	T3 1 uM	ALK5i II 10 uM	N-Cys 1 mM	Trolox 10 uM	R428 2 uM	ZnSO4 10 uM	A heparina 10 ng / mL
Meios S5: blar + 1x suplemento de L-glutamina + 2% BSA + 1,5 g / L de NaHCO3 a 20 mM + Glicose

ITS-X 1: 200

tabela 10

Discussion

Considerações de tempo para gerar mutantes Lines

Embora as abordagens recentes baseados em sistemas / Cas CRISPR para edição genoma levaram a segmentação bem sucedida, uma plataforma mais eficaz e universal seria preferível em maior escala análises da função do gene. A plataforma iCRISPR oferece um método rápido e eficiente para introduzir mutações a qualquer gene de interesse ^{5, 9.} Em primeiro lugar, o método de síntese gRNA com base em PCR permite a produção de centenas de gRNAs em formato dispostos em um dia sem os passos de clonagem que consomem tempo. Em segundo lugar, com expressão indutível Cas9 doxiciclina em iCas9 hPSCs, o passo que envolve a transfecção gRNA requer apenas uma quantidade mínima de trabalho, e assim, as experiências de segmentação múltipla gRNA podem ser realizadas simultaneamente. Em terceiro lugar, devido à alta eficiência de segmentação atingíveis com o nosso sistema, a análise de ~ 24 - 48 colónias por gRNA transfectadas devem ser suficient para estabelecer múltiplos monoalélicos e linhas mutantes bialélicos para um único gene, embora as eficiências variam dependendo do locus alvo. Uma vez que é possível que um indivíduo treinado para apanhar mecanicamente 384 colónias (placas de 4 x 96 poços) de uma só vez, o que deve levar ~ 4 h, sob um microscópio de dissecação, um indivíduo treinado pode ser esperado para gerar linhas mutantes que afectam a 12 genes dentro 1 - 2 meses. A geração de mutantes simplificada HPSC num curto espaço de tempo permite a análise sistemática de uma série de factores de transcrição e / ou componentes da via de sinalização, que interagem uns com os outros, regulando o processo de desenvolvimento ^9. Além disso, eficiente segmentação gene multiplexada também abre a porta para investigar interacções genéticas subjacentes características humanas complexas.

Geração de modificações genéticas precisas

A derivação de iPSCs específicas no doente, desde tipo de célula somática facilmente acessível s e a diferenciação em tipos de células doença relevantes fornecem uma grande oportunidade para a validação funcional de mutações associadas à doença. No entanto, devido à variabilidade considerável no fundo genética entre os indivíduos, as comparações directas entre iPSCs de doentes e de dadores saudáveis ​​podem não permitem distinguir fenótipos da doença a partir de efeitos de fundo. Portanto, é necessário gerar iPSCs isogénicas controlo corrigindo a mutação da doença de volta para a sequência do tipo selvagem ou para introduzir as mutações específicas de pacientes em um fundo HPSC de tipo selvagem, tal como proposto por outros ^{25, 26.} Além disso a (null) mutações de perda de função, pode-se agora dissecar mais precisamente os mecanismos da doença por meio da introdução de uma alteração de sequência específicos do paciente no locus endógeno em hPSCs, incluindo paciente hipermórficos, hipomórfico, neomorphic, ou dominante negativo mutações.

ntent "> modificação genética precisa emprega HDR para reparação de DSB, na presença de um modelo de reparação. Uma vez que é muito menos eficiente do que a reparação de NHEJ de ADN mediada por, um plasmídeo dador contendo a mutação específica para cada paciente, uma cassete de selecção de droga, e os braços de homologia tenha sido previamente utilizado como o modelo de reparação ^2. Após a selecção de drogas e de verificação da mutação específica para cada paciente, um segundo passo é geralmente necessária para remover a cassete de selecção de droga. Embora os sistemas Cre-loxP e FLP-FRT mais amplamente usados deixar para trás sequência residual no locus endógeno, o uso de piggyBac transposão tem permitido a remoção contínua da cassete de selecção de droga ^27. Mais recentemente, os modelos de ADNcs curtas também foram exibidas para suportar HDR eficiente com as endonucleases de ADN modificadas ^28. Comparado com um plasmídeo dador , ADNcs podem ser directamente sintetizados e, portanto, evita o passo de clonagem demorado. Aqui, tem serPT mostraram que, por co-transfecção de gRNA e um molde de ADNcs para induzir a reparação dirigida por homologia, iCRISPR pode ser utilizada para introduzir modificações de nucleótidos específicos com elevada eficiência. Isto é crítico, não só para dissecar o papel dos nucleótidos essenciais dentro de domínios funcionais de proteínas, mas também para a modelagem de mutações de doenças humanas e potencialmente corrigir estas mutações associadas à doença para a intervenção terapêutica. Devido ao grande número de loci de susceptibilidade que estão cada um associado com várias variantes de sequência, modelar doenças complexas e multigénicos tais como diabetes tem sido um desafio para os geneticistas. À medida que a plataforma iCRISPR é permissiva para a rápida geração de uma série de alelos ou para direccionamento do gene multiplexable, que pode facilitar a investigação de múltiplos loci associados à doença, quer individualmente ou em combinação com fundos isogénicas.

Segmentação Eficiências e efeitos fora do alvo

Nós temos encontrado uma boa correlação entre a T7E1 e os resultados do ensaio de RFLP e o número de linhas mutantes identificados por sequenciação. Isso enfatiza a importância da realização destes ensaios em paralelo com o estabelecimento de linhas clonais. Embora as eficiências de segmentação obtidos podem variar de acordo com os loci genómico, na maior parte das experiências individuais de direccionamento de gene, a 20 - 60% dos clones foram encontrados com ambos os alelos mutados (incluindo em grelha e mutações frameshift) ^9. Nos casos em que a segmentação gene multiplexado foi realizada, clones mutantes bialélicos triplos com 5-10% de eficiência foram obtidos ^5. ADNcs mediada por HDR de vários genes foram também realizados para obter alterações genéticas precisas, com as eficiências de obtenção homozigótica knock-in clones variando de 1 - 10% ^5. Trabalhando com CRISPR / Cas em hPSCs, quaisquer mutações em potenciais locais fora do alvo que não compartilham a mesma sequência alvo gRNA estão ainda a ser detectadolass = "xref"> ^{5, 9, 12.} Sequenciamento de genoma completo realizado em um estudo recente também não conseguiu identificar mutações off-alvo substanciais em linhas HPSC clonais gerado usando CRISPR / Cas ^29. No entanto, para minimizar qualquer efeito potencial de confundir os fenótipos introduzidos por mutações em locais de efeitos fora do alvo, sugere-se para gerar linhas mutantes independentes utilizando, pelo menos, duas sequências de direccionamento gRNAs independentes diferentes dentro do mesmo gene. fenótipos semelhantes observadas em várias linhas gerada utilizando diferentes gRNAs poderia descartar principalmente a possibilidade de que o fenótipo trata de um efeito fora do alvo.

-Feeder dependente versus cultura independente e Segmentação

Os métodos tradicionais de cultura HPSC envolvem a sua manutenção e expansão de células de alimentação em meios contendo soro ou substituição de soro que inclui prod animaistos, tais como albumina de soro bovino. células alimentadoras, soro, de substituição de soro, e albumina todos contêm componentes complexos, indefinidos e mostrar considerável variabilidade lote. Adaptar-se a condição de livre de alimentação e química definida reduz significativamente os esforços para a manutenção HPSC e, mais importante, aumenta a consistência dos experimentos de diferenciação. Actualmente, existem muito poucos estudos que descrevem procedimentos de edição de genoma sobre hPSCs cultivadas em condições de cultura totalmente definidos ^30. Encontramos maior CRISPR visando eficiência quando gRNA transfecção e deposição clonal foram realizadas em condições livres de alimentação em comparação com condições de cultura dependentes de alimentação. Acreditamos que este é devido ao aumento da sobrevivência das células após a transfecção e propagação de uma única célula para formação de colónias. Além disso, as células alimentadoras foram anteriormente mostrado para sequestrar os reagentes de transfecção, diminuindo assim a eficiência da transfecção.

combinandoEdição genoma com Directed Diferenciação

Protocolos de diferenciação anteriores produziram apenas uma pequena fracção das células de insulina positivas, a maioria das quais eram polyhormonal e assemelhava-se células fetais endócrinas ^23. O progresso recente tem permitido a diferenciação de hPSCs em células mais maduras de glicose-responsive beta-like ^{16, 17, 19, 20.} Podemos rotineiramente obter pelo menos 75% de células da endoderme definitivo, 40% células beta como glicose-responsive Pdx1 + NKX6.1 + progenitoras pancreáticas, e cerca de 20% NKX6.1 + CPEP + usando HUES8 hPSCs ^9. Quando combinado com o sistema de edição genoma iCRISPR, este protocolo de diferenciação mais robusto tem facilitado a análise de fatores de transcrição que são cruciais para as pancreáticas progenitoras e endócrinos estágios de diferenciação do pâncreas. Isso fará com queSerá possível, em estudos futuros, para examinar um grande número de genes de doenças candidato para a validação funcional e investigação sobre os mecanismos que estão por trás diabetes ^9.

Aplicações futuras ou Directions

Nosso sistema iCRISPR pode facilitar a geração de modificações genômicas mais complexas, tais como a criação de alelos repórter através do gene alvo usando modelos de DNA longo doadores marcas que codifica a proteína ou repórteres fluorescentes ¹² HDR-mediada. Mostrámos que, devido à alta eficiência de segmentação CRISPR obtidos no sistema, este processo pode ser realizado em hPSCs, sem a necessidade de seleccionar mais ^de um fármaco ^12. Além disso, o gene multiplexado segmentação pode ser usado para investigar interacções genéticas doença humana complexa subjacente, como mostrado em nosso estudo recente, o que acreditamos ser o primeiro exemplo desse trabalho ^31. iCRISPR também pode ser utilizada para compreender o controlo regulador do gene através da criação de deleções em qualquer ARN não codificadoras ou em regiões reguladoras do gene, tais como promotores e intensificadores. Para gerar mutantes reguladoras eficientemente usando iCRISPR, gRNAs pode ser concebido para interromper o local de ligação de uma proteína de ligação de ADN, incluindo, mas não se restringindo à maquinaria de transcrição basal, ou um factor de transcrição específico de tecido. ADNcs HDR mediada por molde pode também ser utilizada para mutar locais específicos de ligação a proteínas. Finalmente, prevemos que uma maior optimização possa permitir a utilização da plataforma iCRISPR em hPSCs superiores para as análises genéticas de rendimento de fenótipos pluripotência ou fenótipos da doença quando combinado com um protocolo de diferenciação in vitro, em. Estes estudos mediada por iCRISPR pode permitir a identificação mais rápida de genes candidatos e os estudos da sua relevância funcional associada à doença.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Meio quimicamente definido (E8)	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Essential 8 meio basal e suplemento Essential 8 incluídos
Forma humana recombinante truncada de vitronectina	Thermo Fisher Scientific	A14700
Inibidor de ROCK Y-27632	Selleck Chemicals	S1049
Reagente de dissociação (enzima TrypLE Select)	Thermo Fisher Scientific	12563029	1x, livre de origem animal, enzima recombinante
G418 Sulfato	Thermo Fisher Scientific	10131035	Geneticin Antibiótico Seletivo
Dicloridrato de Puromicina	Sigma-Aldrich	P8833	Antibiótico Seletivo Puromicina
DNA Polimerase (Herculase II Fusion)	Agilent Technologies	Kit de	PCR
600679 MEGAshortscript T7 Transcrição kit	Thermo Fisher Scientific	AM1354
MEGAclear Kit de Limpeza de Transcrição	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Hidrato de doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891
Opti-MEM médio	Thermo Fisher Scientific	31985062	Soro Reduzido
Lipofectamina RNAiMAX Reagente de Transfecção	Thermo Fisher Scientific
DNeasy Blood & Kit de lenços	QIAGEN	69504	Kit de extração de DNA genômico
Proteinase K	Roche	3115879001
MCDB 131 meio	Thermo Fisher Scientific	10372-019
Meio BLAR	Thermo Fisher Scientific		Feito sob medida com uma formulação publicada (Rezania et al., 2014)
Suplemento de L-glutamina (GlutaMAX)	Thermo Fisher Scientific	35050061
NaHCO3	Thermo Fisher Scientific	144-55-8
Glicose	Sigma-Aldrich	G8769
BSA	LAMPIRE Biological Laboratories	7500855	Livre de ácidos graxos
GDF8	PeproTech	120-00
CHIR-99021	Stemgent	04-0004	Inibidor de GSK-3
Ácido L-ascórbico	Sigma-Aldrich	A4544	Vitamina C
FGF7	R & D Systems	251-KG
SANT1	Tocris Bioscience	1974	Inibidor de ouriço
RA	Sigma-Aldrich	R2625	Ácido retinóico
LDN	Stemgent	04-0019	Inibidor de BMP
IWP-2	Tocris Bioscience	3533	Antagonista Wnt
ITS-X	Thermo Fisher Scientific	51500-056
TPB	EMD Millipore	565740-1MG	Ativador PKC
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
ALK5i II	Enzo Life Sciences	ALX-270-445	ALK5 inibidor II
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z0251
Heparina	Sigma-Aldrich	H3149
GSiXX	EMD Millipore	565789	Inibidor da gama secretase XX, inibidor de sinalização NOTCH
N-Cys (N-acetilcisteína)	Sigma-Aldrich	A9165
Trolox	EMD Millipore	648471	Vitamina E análogo
R428	Selleck Chemicals	S2841	AXL receptor tirosina quinase inibidor
24 mm Transwell com inserto	Corning Life Sciences	3414
Gene Pulser Xcell Sistema de Eletroporação	Bio-Rad	1652660
0,4 cm Cuvetes de Eletroporação	Bio-Rad	1652081
AAVS1-TALEN-L	Addgene	59025
AAVS1-TALEN-R	Addgene	59026
AAVS1-Neo-M2rtTA	Addgene	60843
AAVS1-Puro-iCas9	Addgene	58409
T7 Endonuclease I	NEB	M0302L
Tampão 2	NEB	B7002S	NEBuffer 2
Oligonucleotídeo longo	Eton Bioscience ou anticorpo IDT
SOX17	R& D Systems	AF1924	1:500
FOXA2 anticorpo	Millipore	07-633	1:100
CXCR4-APC anticorpo	R& D Systems	FAB170A	1:25
PDX1 anticorpo	R& D Systems	AF2419	1:500
NKX6.1 anticorpo	DSHB	F55A12	1:500
NKX2.2 anticorpo	DSHB	74.5A5	1:100
NEUROD1	Santa Cruz Biotechnology	sc-1084	1:100
Anticorpo de insulina	Dako	A0564	1:2.000
anticorpo peptídico C	DSHB	GN-ID4-c	1:2.000
Anticorpo glucagon	Sigma-Aldrich	G2654	1:1.000