Murino Linfócitos Rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em&gt; In Vivo</em&gt; Tráfico celular por PET / CT

Sabrina H. L. Hoffmann; Andreas Maurer; Dorothea I. Reck; Gerald Reischl; Bernd J. Pichler; Manfred Kneilling; Christoph M. Griessinger

doi:10.3791/55270

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Artigo de método

Murino Linfócitos Rotulagem por

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DOI:

10.3791/55270

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29 de abril de 2017

Sabrina H. L. Hoffmann¹ , Andreas Maurer¹ , Dorothea I. Reck¹ , Gerald Reischl¹ , Bernd J. Pichler¹ , Manfred Kneilling¹^,² , Christoph M. Griessinger¹

¹Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, ²Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

Neste artigo

Resumo

Seguindo a preparação de um anticorpo monoclonal ⁶⁴ Cu-modificados se ligar a um receptor de células T de murino transgico, as células T são radiomarcados in vivo, analisadas para a viabilidade, funcionalidade, estabilidade rotulagem e apoptose, e transferidas adoptivamente para ratinhos com uma via aérea hipersensibilidade de tipo retardado reacção para imagem não invasivo por tomografia de emissão de positrões / tomografia computadorizada (PET / CT).

Resumo

Este protocolo ilustra a produção de ⁶⁴ Cu e o quelante de conjugao / radiomarcação de um anticorpo monoclonal (mAb), seguido por cultura de células de linfócitos de murídeo e o receptor ⁶⁴ de Cu-anticorpo segmentação das células. Avaliação in vitro do marcador radioactivo e não-invasivo de rastreamento de células in vivo num modelo animal de uma via respiratória de tipo retardado de reacção de hipersensibilidade (DTHR) por PET / CT são descritos.

Em detalhe, a conjugação de um mAb com o quelante de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA) é mostrado. Após a produção de ⁶⁴ Cu radioactivos, marcação radioactiva do mAb DOTA-conjugado é descrito. Em seguida, a expansão de ovalbumina de galinha (Cova) CD4 ⁺ especï¿½ico interferão (IFN) -γ produtoras de células T auxiliares (Cova-TH1) e a radiomarcação subsequente das células Cova-TH1 estão representados. Várias técnicas in vitro são apresentados para avaliar a effects de ⁶⁴ Cu-radiomarcao sobre as células, tais como a determinação da viabilidade das células por exclusão do azul de tripano, a coloração para a apoptose com anexina V por citometria de fluxo, e a avaliação da funcionalidade por ensaio imunossorvente ligado a enzima de IFN-γ (ELISA) . Além disso, a determinação da incorporação radioactiva nas células e a estabilidade de marcação são descritos em detalhe. Este protocolo descreve ainda como realizar os estudos de seguimento de células em um modelo animal para uma DTHR das vias respiratórias e, por conseguinte, a indução de-induzida das vias respiratórias Cova DHTR aguda em ratinhos BALB / c está incluído. Finalmente, um fluxo de trabalho / CT robusta PET incluindo aquisição de imagem, reconstrução e análise é apresentada.

A abordagem de direccionamento do receptor ⁶⁴ de Cu-anticorpo com a internalização do receptor subsequente proporciona uma elevada especificidade e estabilidade, reduzida toxicidade celular, e as taxas de efluxo baixos em comparação com PET-traçadores comuns para marcação celular, por exemplo, ⁶⁴ Cu-pyruvaldehyde bis (N-4-metiltio-semicarbazona) ⁽⁶⁴ Cu-PTSM). Finalmente, a nossa abordagem permite não invasiva no rastreamento de células in vivo por PET / CT com uma óptima relação sinal-para-fundo durante 48 h. Esta abordagem experimental pode ser transferido para modelos animais e tipos de células diferentes com receptores ligados a membranas que são internalizados.

Introdução

Rastreamento de células não-invasiva é um instrumento versátil para monitorizar a função celular, migração e homing in vivo. Estudos recentes de rastreamento de células têm-se centrado no mesenquimais ^{^1,} ² ou da medula óssea derivadas de células estaminais ³ no contexto da medicina regenerativa, as células brancas do sangue perifico autogos em inflamação ou linfócitos T em terapias de células adoptivas contra cancro de ^{^3,} ^4. A elucidação dos locais de acção e os princípios subjacentes biológicos de terapias à base de c....