lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.
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Artigo de método
Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel
Neste artigo
Resumo
Resumo
Durante a lesões crónicas do fígado, células progenitoras expandir num processo chamado de reacção ductular, o que também implica o aparecimento de infiltrado celular inflamatório e a activação da célula epitelial. A população de células progenitoras durante essas reações inflamatórias tem sido principalmente investigado utilizando marcadores de superfície individuais, quer por análise histológica, ou por fluxo de técnicas baseadas em citometria. No entanto, os novos marcadores de superfície identificados vários subconjuntos funcionalmente distintas dentro do progenitor fígado / haste compartimento da célula. O método aqui apresentado descreve o isolamento e análise de citometria de fluxo detalhado de subconjuntos progenitoras usando combinações novo marcador de superfície. Além disso, demonstra como os vários subconjuntos de células progenitoras pode ser isolado com pureza elevada utilizando métodos automatizados magnética e separação por FACS com base em. Importante, novos e enzimática simplificado dissociação do fígado permite o isolamento destas populações de células raras com uma alta viabilidadeque é superior em comparação com outros métodos existentes. Isto é especialmente relevante para o estudo de mais células progenitoras in vitro ou para o isolamento de ARN de alta qualidade para analisar o perfil de expressão do gene.
Introdução
A regeneração hepática é geralmente associada com a capacidade de auto-renovação de hepatócitos. No entanto, as lesões crónicas do fígado ocorrem com a activação de células progenitoras e de expansão, que têm sido associadas com a sua capacidade de se diferenciar em hepatócitos e cholangiocytes 1, 2, 3, 4. Isto é especialmente relevante porque, durante a lesões crónicas, a proliferação de hepatócitos não é eficaz. Apesar de vários estudos de rastreamento genético visando células progenitoras, o seu papel na regeneração hepática permanece co....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação dos Comitês de Ética e de cuidados de animais da Universidade de Homburg Medical Center.
1. Preparação de Materiais e buffers
- Recém preparar todos os buffers necessários para a digestão do fígado utilizando componentes estéreis e uma capa laminar para evitar a contaminação bacteriana.
- Preparar o tampão de recolha (CB) através da mistura de 49,5 mL de meio RPMI e 0,5 mL de soro bovino fetal (FBS; baixa endotoxina, inactivado pelo calor) para conseguir uma solução a 1% (v / v). Guardar a solução em gelo até posterior utilização.
NOTA: Cerca de ....
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Resultados
O procedimento aqui apresentado para a digestão do fígado utilizando uma nova mistura de enzimas resulta numa suspensão de uma única célula contendo parenquimatosa do fígado e células não-parenquimatosas (Figuras 1 e 2a). Após a lise ACK-de células vermelhas do sangue, o fluxo directo análise de citometria da suspensão de célula única é possível (Figuras 1 e 2). A estratégia envolve a propagação de exclusão de dupletos e.......
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Discussão
Inflamação do fígado e lesões de diferentes origens desencadear processos regenerativos no fígado que são acompanhados pela expansão de células progenitoras e ativação 2, 3. Estas células progenitoras do fígado possuem características de células-tronco e provavelmente desempenham um papel importante no mecanismo patológico de várias doenças do fígado.
A heterogeneidade das células progenitoras do fígado tem sido sugerida. A reavaliaç.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Alexander von Humboldt Foundation Award Sofja Kovalevskaja a VLK.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| sem vermelho de fenol DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Colagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | ||
| ACK que lida | tecnologias | A10492-01 | |
| HBSS da vida do | HBSS | ||
| D8537 | |||
| Sigma-Aldrich | S2002 | prepara a solução conservada em estoque 10 | |
| % BSA Miltenyi | Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Solução de enxágue | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | adicione 0,5% (v/v) de BSA e armazene no gelo |
| Livre de vermelho de fenol DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| contagem de contas Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| Reagente de bloqueio FcR | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Kit de Remoção de Células Mortas | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotina MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purificado | BioLegend | 139302 | Diluição: 1:100 |
| CD16/32 Diluição | purificada do 101302 | BioLegend | 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | Diluição | 103116 | : 1:200, marca as células hematopoéticas |
| CD31 Biotina BioLegend | 102504 | Diluição: 1:200, marca as células endoteliais | |
| ASGPR1 Purificado | Bio-Techne | AF2755-SP | Diluição: 1:100, marca os hepatócitos |
| Podoplanina APC | BioLegend | 127410 | Diluição: 1:1.400, marca células progenitoras |
| Podoplanina Biotina BioLegend | 127404 | Diluição: 1:1.400 | |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µ L, marcas células progenitoras |
| CD133 Biotina | BioLegend | 141206 | Diluição: 1:100 |
| CD34 Biotina | eBioScience | 13-0341-81 | Diluição: 1:100 |
| CD90.2 Pacific | Blue BioLegend | 140306 | Diluição: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Diluição: 1:600 |
| EpCAM Violeta Brilhante 421 | BioLegend | 118225 | Diluição: 1:100 |
| Sca-1 Biotina | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µ L |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rato IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rato IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rato IgG2a, κ Biotina | BioLegend | 400504 | |
| Rato IgG2a, κ Violeta Brilhante 421 | BioLegend | 400535 | |
| Hamster Sírio IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Hamster Sírio IgG Biotina BioLegend | 402004 | ||
| Controle Normal de IgG de Cabra Purificado | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Burro anti-Cabra IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Diluição: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Diluição: 1:400 |
| 100 µ m Malha de filtro | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Coluna | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Separador QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separador | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Polipropileno Tubo inferior redondo | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT tampão de lise está incluído |
Referências
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J ....
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Reimpressões e permissões
