-Nervo poupadores Mid-obstrução uretral (Nemo) em fêmeas pequenos roedores

Resumo

modelagem tradicional de obstrução da saída da bexiga parcial em roedores é cheio com a mortalidade dos animais. Uma lesão desnervação de dissecção em torno da uretra proximal e do colo da bexiga também é de grande preocupação. Nós desenvolvido e avaliado um modelo de obstrução mid-uretral segura e confiável, evitando as deficiências do modelo tradicional.

Resumo

obstrução da saída da bexiga parcial (pBOO) tem alta prevalência, causas carga paciente significativa, e os custos de saúde imensos. O modelo animal mais comum para investigar remodelação da bexiga em pBOO são roedores do sexo feminino submetidos a obstrução parcial na uretra proximal. Variabilidade no grau de obstrução e a mortalidade dos animais são os principais preocupações com obstrução proximal. Além disso, dissecando em torno da uretra proximal e do colo da bexiga compromete inervação da bexiga.

Nós desenvolvemos um modelo de obstrução mid-uretral poupadores de nervo (Nemo) para pBOO evitando as desvantagens do modelo tradicional. Nós nos aproximamos da uretra apenas inferior à sínfise púbica, o que evitou a necessidade de laparotomia, bem como para dissecção nesta área; Também, o esfíncter uretral estriado permaneceu intacta. Foi realizada nemo em ratos Sprague-Dawley do sexo feminino (12 obstruções, 6 animais sham), bem como em ratinhos fêmea C57 / BL6 (20 obstruçãos, 18 animais sham). Depois de duas semanas, avaliamos a função da bexiga, a massa da bexiga, e massa corporal.

Nós não tivemos mortalidade entre ratas obstructed- ou operados por simulação; tal como descrito para o proximal tradicional pBOO-método, que amarrado a sutura em torno da uretra proximal e uma haste de metal colocado temporariamente 0,9 milímetros. Nemo induziu um aumento de 85% em massa da bexiga após duas semanas, o volume médio de urina residual foi de 0,4 mL em ratos parcialmente obstruída enquanto apenas 0,03 ml em animais sham. Em ratinhos, foram testados 3 tamanhos de cânulas que colocados ao longo da uretra quando atar o fio de sutura. Descobrimos que a utilização de uma cânula de calibre 27 resultou em mais de mortalidade dos animais 50%; colocação da cânula de calibre 25 não deu a resposta desejada no aumento da massa da bexiga; utilizando uma cânula de calibre 26, produziu resultados favoráveis ​​com a mortalidade mínima dos animais (1/8) ainda um aumento significativo de 2 vezes em massa da bexiga.

Introdução

Parcial obstrução da saída da bexiga (pBOO) tem uma prevalência elevada e pode resultar em disfunção da bexiga grave ^1; o espectro varia de malformações congénitas, tais como válvulas de uretra posterior ou hypospadias, mais de estreitamento uretral adquiridos a hiperplasia benigna da próstata. O último que afecta mais de 30% dos homens de sessenta anos e mais velhos ^2. Grande fardo paciente e os custos de saúde associados com imensas pBOO justificar o esforço de investigação considerável colocar em estudar a remodelação da bexiga em resposta à resistência aumentada saída ^3. De 2006 até 2015, mais de 220 PubMed indexados artigos foram publicados sobre o efeito de pBOO na bexiga urinária.

Embora os modelos animais para pBOO Elaboraram-se várias espécies, tais como ⁴ a ⁵ de rato, o coelho ^{6, 7} porco, e compue ^{8, 9,} sem dúvida, o modelo animal mais habitualmente utilizada, porém, são ratos do sexo feminino submetidos a obstrução parcial da uretra proximal; acesso ao abdómen dos animais, exteriorizante da bexiga, e dissecção em torno do pescoço da bexiga são inevitáveis ​​com esta técnica obstrução uretral proximal tradicional. Variabilidade no grau de obstrução e a mortalidade dos animais são apenas alguns dos problemas associados com este procedimento ^{10, 11;} mostrou-se que em animais de engano operados, dissecção em torno da uretra proximal leva a alterações fisiológicas que se correlacionam com perda de fibras nervosas no colo da bexiga ^12. Esta descoberta indica que o modelo animal pBOO mais utilizada, a qual envolve o acesso a uretra proximal em roedores do sexo feminino, conduz a uma lesão desnervação com alterações estruturais e funcionais associadas da bexiga, afectandofarsa e animais obstruídas. Por conseguinte, foi necessário um método alternativo evitar lesões desnervação. O nosso laboratório desenvolvidos e avaliada uma abordagem obstrução médio-uretral poupadores de Nervo (nemo), eficaz na indução de alterações associadas à obstrução esperada na bexiga, tais como aumento da massa do órgão e urina residual, enquanto que os animais operados de forma simulada foram indistinguíveis dos animais de controlo não operados . Além disso, o esfíncter uretral estriado permaneceu intacta como ela se encontra próximo do limite de dissecção. Além disso, a variabilidade no aumento induzido por obstrução em massa da bexiga foi significativamente menor do que na obstrução uretral proximal tradicional e a mortalidade dos animais foi zero.

Nós também aplicado com sucesso nemo em ratinhos fêmea com uma mortalidade inferior a 10% nos animais obstruídos, enquanto que todos os modelos pBOO para ratinhos descritos até à data foram associadas com uma mortalidade de cerca de 50%. Estudar remodelação da bexiga no contexto de pBOO em ratos irá beneficiar de applicabildade de todo o espectro de modificações transgénicos.

Dissecando em torno do meio da uretra em roedores do sexo feminino não induz as alterações estruturais ou funcionais indesejáveis ​​e de confusão na bexiga urinária observado no modelo de obstrução proximal tradicional. No entanto, a indução de uma obstrução parcial no nível médio-uretral ainda induz a hipertrofia da bexiga e aumento da urina residual, como esperado a partir de um modelo animal para pBOO. Importante, realizando nemo em ratinhos abre investigação de remodelação da bexiga em pBOO a métodos transgénicos, que são praticamente inexistentes em roedores maiores.

Protocolo

O protocolo experimental seguinte foi aprovado pelo comitê de cuidados com os animais da instituição.

1. Nemo em ratas

1. Preparação
   1. Colocar um rato fêmea Sprague-Dawley pesando cerca de 200 g sob anestesia de isoflurano a 3%, peso do animal, e barbear e desinfectar a área pré-púbica 3 vezes utilizando uma limpeza cirúrgica iodo.
   2. Em uma almofada de aquecimento, fita membros posteriores e cauda para baixo e cateterização da bexiga com um angiocateter de calibre 20, que também é delicadamente gravada para baixo para evitar o deslizamento.
2. dissecação
   1. Usar um bisturi para efectuar uma incisão na pele 8 milímetros longitudinal a partir da sínfise púbica palpável para o meato uretral. Levantar a pele de ambos os lados para facilitar o fechamento da ferida mais tarde.
   2. Dissecar sem rodeios para identificar a uretra stent espalhando longitudinal com tesoura fina. Coloque ganchos pele fina auto-retenção para melhorar a exposiçãoda uretra.
   3. Executar alguma suave longitudinal espalhamento utilizando tesouras curvas dorsal para a uretra, para desenvolver o plano entre a uretra e da vagina. Então, sem rodeios passar uma sutura de seda 4-0 atrás da uretra e preparar o duplo lance do nó de um cirurgião.
3. Obstrução uretral parcial
   1. Remover o angiocateter, colocar uma haste de metal 0,9 milímetros paralela à uretra, e, em seguida, apertar o nó em torno da uretra e do metal da haste, de modo que o último ainda facilmente desliza para fora a partir daí.
   2. Fixar o nó com mais 3 lances usando tensão suave antes de retirar a haste. Cortar o fio de sutura termina cerca de 3 mm long, ou 4 mm se libertação posterior de obstrução faz parte da experiência.
4. fechamento da ferida
   1. Aproximar as glândulas uretrais usando um ponto único enterrado de absorvível trançado sutura 4-0.
   2. Feche a pele com um ponto colchão horizontal enterrado usando o mesmo sut absorvívelUre. Nota: Embora possa parecer pouco convencional usar uma sutura absorvível para um ponto de penetração cutânea, não encontramos complicações como infecções da ferida e que a remoção da sutura pode ser evitada.
5. Após o cuidado
   1. Injectar buprenorfina 0,1 mg / kg subcutaneamente antes de colocar o rato numa gaiola de recuperação.
   2. Oferecer alguma dieta macia da recuperação para as primeiras 24 h ao único rato alojado. Após este período, animais de casa novamente nos mesmos pares que antes do procedimento desde que eles estão indo bem e pertencem ao mesmo grupo de tratamento.
   3. Verifique diariamente os ratos quanto ao tamanho da bexiga e ao bem-estar geral; Registrar seu peso pelo menos uma vez por semana.

2. NeMO em Ratos Femininos

1. Preparação
   1. Coloque um rato C57bl / 6 fêmea pesando cerca de 18 g e proceda como detalhado no passo 1.1.1.
   2. Proceder conforme detalhado no passo 1.1.2, exceto usar umiocatheter.
2. dissecação
   1. Usar um bisturi para fazer uma incisão na pele de seis milímetros longitudinal a partir da sínfise púbica palpável para o meato uretral.
   2. Dissecar sem rodeios para identificar a uretra stent espalhando longitudinal com tesoura fina. Levantar o feixe neuro-vasculares execução ventralmente na uretra por dissecção romba análogo.
   3. Executar alguma suave longitudinal espalhamento utilizando tesouras curvas dorsal para a uretra, para desenvolver o plano entre a uretra e da vagina. Então, sem rodeios passar uma sutura 5-0 não absorvível trançado atrás da uretra e preparar o duplo lance do nó de um cirurgião.
3. Obstrução uretral parcial
   1. Ligue o angiocateter com uma seringa de 1 ml e injectar 0,1 ml de solução salina normal para a bexiga.
   2. Coloque uma cânula de calibre 26, paralela à uretra. Aperte levemente o nó em torno da uretra e cânula enquanto puxa de volta o angiocaº.
   3. Fixar o nó com mais 3 lances usando tensão suave antes de retirar a cânula.
   4. Teste para a urina que aparece no meato mediante uma pressão suave sobre a bexiga do animal; afrouxar o laço se incapaz de expressar urina. Caso contrário, o corte da sutura termina cerca de 3 mm long.
4. fechamento da ferida
   1. Feche a pele com um ponto colchão horizontal enterrado usando uma sutura absorvível 5-0 trançado.
5. após o cuidado
   1. Injectar 0,1 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea, antes de colocar o rato em uma gaiola de recuperação.
   2. Oferecer alguma dieta de recuperação suave para as primeiras 48 h para o mouse Alojado única. Após este período, animais da casa novamente nos mesmos grupos que antes do procedimento, desde que estão fazendo bem e pertencem ao mesmo grupo de tratamento.
      NOTA: Os ratos com uma palpável distendido bexiga 24 h após o procedimento que não anulará quando manuseado são over-obstruída e vai morrer dentro do next 1 - 2 dias a menos que levado de volta sob anestesia para a remoção da ligadura obstructivo.
   3. Verificar os ratinhos diariamente para o tamanho da bexiga e bem-estar geral; registar o seu peso pelo menos semanalmente.

Resultados

-Nervo poupadores Mid-obstrução uretral (Nemo) em ratas

Mortalidade

Foi realizada uma obstrução mid-uretral em mais de 40 ratas tão longe e não tinha mortalidades.

massa da bexiga

Média massa bexiga relativa (bexi...

Discussão

A mortalidade dos animais é uma das principais preocupações do modelo tradicional de pBOO na uretra proximal, em 15% ou mais em muitos relatórios ^{10, 11, 13.} Nemo parece ter mortalidade mínima quando aplicado em ratos fêmeas. obstrução uretral proximal em murganhos é tecnicamente mais exigente do que em ratos e, portanto, ainda mais propensos a complicações. Utilizando uma cânula de calibre 26 como um espaço re...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Rato fêmea	Rato de Dawley Charles-River Canada	(Crl:SD); Código da cepa: 400	cerca de 200 g
Vaporizador de isoflorano	Benson medical industries inc.	Isoflurano TEC III; código do produto: 53-T3ISO
Isoflorano	Fresenius Kabi Saúde Animal	Isoflorano; código do produto CP0406V2	Frasco de 250 mL
Bisturi descartável	Ted Pella, Inc.	# 15 Bisturis estéreis de aço inoxidável; número de catálogo 549-9-15S
Pinça de microscopia	Ted Pella, Inc.	Pinça de Microscopia Aesculap, Finepoint, 115mm; número do produto 5443
Pinça Adson	Ted Pella, Inc.	Pinça de Dissecção Aesculap Adson, Curva, 120mm; número do produto 5002-9
Tesoura cirúrgica curva	Ted Pella, Inc.	Tesoura Cirúrgica, Curva, S/S, 105mm; número de catálogo 1376
0,9 mm haste de metal inox	goodfellow.com	Aço Inoxidável - AISI 316L Diâmetro do fio:0,9mm; código de encomenda 911-684-65
Ganchos de pele - auto-fabricados em aço inox	goodfellow.com	Aço Inoxidável - AISI 316L Diâmetro do fio:0,9mm; código de encomenda 911-684-65
4-0 Sutura de seda	esutures.com	4-0 Sofsilk preto 98" fio; número do produto LS640
5-0 Vicry sutura	esutures.com	5-0 Vicryl não tingido 27" RB-1 taper; número do produto J213H
Porta-agulha	Medsupplier.com	Integra Miltex Carb-N-Sert Baumgartner Porta-agulhas - 5 1/2"; código do produto SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC SKU NEE4484-8-40TC
Temgesic (Buprenorfina)	primeiro suprimento veterinário	Buprenex 0.3MG/ml em amperes; item #075701
Seringa de 1 mL com agulha de 27 G	Fisher Scientific	BD  Seringa Tuberculina, BD 309623
20 G Angiocath	Fisher Scientific	Andwin Scientific  ANGIOCATH 20 GA; Nº de catálogo.
Dieta de recuperação	clearh2o	DietGel 31M; 72-08-5022
C57Bl / 6 camundongos fêmeas	Charles-River Canada	C57BL / 6 Mouse (C57BL / 6NCrI); Código da cepa: 027	cerca de 18 g
24 G angiocath	Fisher Scientific	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc. IV CATH ANGIOCATH 24GX3/4IN; Nº de catálogo.
5-0 Ethibond	esutures.com	5-0 Ethibond verde 30" RB-1 cone; número do produto X550H
26 G agulha de seringa	Sigma-Aldrich	BD Precisionglide, Calibre 26; z192392
Solução salina normal	Baxter	0,9% Cloreto de sódio injetável, USP, 100 mL MINI-BAG; código do produto 2B0043

NC9561906NC9814340 Agulha de seringa