Minimamente invasiva constrição aórtica transversal (MTAC) conserva o essencial da constrição aórtica transversal regulares (TAC), eliminando o uso de um ventilador com intubação traqueal. Ele revela-se um método altamente desejável para os estudos de alto rendimento sobre a sobrecarga do ventrículo esquerdo, particularmente em estudos translacionais.
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Artigo de método
Minimamente Invasiva transversal aórtica constrição em Ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Minimamente invasiva constrição da aorta transversal (MTAC) é um método mais conveniente para a constrição da aorta transversal em ratinhos que constrição padrão de tórax aberto transversal da aorta (TAC). Embora a constrição da aorta transversal é um método altamente funcional para a indução de alta pressão no ventrículo esquerdo, é um processo mais difícil e demorado devido ao seu uso de ventilação artificial com entubação traqueal. TAC é muitas vezes também menos de sobrevivência, como o método mais recente, MTAC, nem exige o corte das costelas e dos músculos intercostais nem intubação traqueal com uma configuração de ventilação. Em MTAC, por oposição ao de uma toracotomia para acesso à cavidade torácica, o arco aórtico é alcançado através de uma incisão na linha média anterior no pescoço. A tireóide é puxado para trás para revelar o entalhe esternal. O esterno é posteriormente reduzido para o segundo nível de costela, e o arco aórtico é alcançado simplesmente através da separação dos tecidos conjuntivos e timo. A partir deHá, um fio de sutura pode ser enrolado em torno do arco e amarrado com um espaçador, e em seguida, o corte do esterno e a pele pode ser fechada. MTAC é uma maneira muito mais rápida e menos invasiva para induzir hipertensão ventricular esquerda e permite a possibilidade de estudos de alto rendimento. O sucesso da constrição pode ser verificado usando-alta frequência ecocardiografia trans-torácica, especialmente Doppler colorido e pulsátil Doppler, para determinar as velocidades de fluxo do arco aórtico e à esquerda e artérias carótida direita, a dimensão dos vasos sanguíneos, e a função ventricular esquerda e morfologia. A constrição sucesso também irá desencadear alterações histopatológicas significativas, tais como hipertrofia das células do músculo cardíaco com fibrose intersticial e perivascular. Aqui, o procedimento de MTAC é descrita, demonstrando como as mudanças de fluxo resultantes nas artérias carótidas podem ser examinados com ecocardiografia, morfologia, e as alterações histopatológicas no coração.
Introdução
O objetivo geral deste artigo é demonstrar como transversal constrição aórtica (TAC) em ratos podem ser modificados para produzir uma cirurgia mais simples e mais conveniente. TAC foi introduzido pela primeira vez em 1991 1 e permitiu que os biólogos moleculares para estudar as vias celulares e moleculares que levam à hipertrofia no ventrículo esquerdo e insuficiência cardíaca, particularmente em pequenos animais com genomas manipuladas 2, 3, 4, 5, 6. Apesar da sua eficácia em produzir a sobrecarga de pressão desejado, em última análise, a técnica está limitada pela dificuldade em realizar o procedimento, e a sua baixa taxa de sobrevivência. Um cirurgião realização TAC devem ser capazes de realizar a entubação endotraqueal, toracotomia, e usar a ventilação artificial, a fim de evitar o colapso do pulmão 1.
conteúdo "> Muitas vezes, um método simples e menos invasiva é desejada. Como consequência, minimamente invasiva constrição da aorta transversal (MTAC) foi concebido 3. Embora o resultado (especificamente, hipertrofia do ventrículo esquerdo) é o mesmo, o procedimento envolve um número significativamente menor aparelhos e menos danos para o animal. MTAC revela-se um método conveniente que tem uma taxa de sobrevivência maior, acima de 90%, e tem um tempo de operação de apenas 15 a 25 min. os raros casos de morte após cirurgia bem sucedida pode ser atribuída ao excesso constrição -tight do arco aórtico, resultando em sobrecarga ventricular esquerda tremenda e redução fatal de fornecimento de sangue para os órgãos críticos, tais como os rins.Após o processo é completado, a ecocardiografia pode ser usado para avaliar o sucesso de bandas e a morfologia e da função cardíaca. Um sistema de ultra-som de alta frequência pode ser utilizado para medir o diâmetro e as alterações no fluxo na esquerda e direitaartérias carótidas, para visualizar o arco aórtico constrição para medições de pico de velocidade de fluxo, e para determinar a espessura da parede do ventrículo esquerdo e parâmetros funcionais 7, 8. Após a eutanásia, os órgãos também podem ser recolhidos para estudos histopatológicos com hematoxilina e eosina e colágeno coloração Picrosirius, sendo este último particularmente útil para a observação de fibrose.
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Protocolo
O protocolo segue as orientações da Comissão sobre o Uso de Animais Vivos em Ensino e Pesquisa (CULATR) da Universidade de Hong Kong.
1. Operação Preparação do Site
- Desinfectar o local da operação com álcool isopropílico 75%. Ajustar a temperatura da almofada de aquecimento a 37 ° C para evitar alterações no coração e taxas respiratórias do indivíduo animal.
- Use instrumentos cirúrgicos esterilizados num esterilizador gravidade deslocamento a 121 ° C durante 30 min ou por outros métodos apropriados.
- Aqui 2 - 4 agulhas de calibre 30 e curva-los com um suporte de agulha, como pode ser visto na Figura 1, para fazer uma ferramenta para a ligação e separação do tecido e para o uso como um retractor. Montar a agulha agora curvada sobre um aplicador de algodão para uso em cirurgia.
- Blunt uma agulha de calibre 27 e curvá-lo 90º com o suporte da agulha. Suavizar a ponta, esfregando uma superfície dura para fazer um espaçador de 0,4 mm na etapa ligadura.
2. Preparação animal
- Anestesiar a 2 meses de idade, do sexo masculino, 22-25 g rato C57BL / 6N com uma cetamina apropriado e mistura de xilazina em relação ao peso corporal: 100 mg / kg + 10 mg / kg ip Confirme a anestesia com a pitada reflex cauda negativa .
- Remova o cabelo na região anterior do pescoço e no peito com uma aplicação de 2 a 3 min de creme depilatório. Retire o creme com água morna e um aplicador de algodão.
- Aplicar pomada oftálmica ou gel para os olhos do animal para evitar a secagem da córnea.
- Colocar o animal em uma almofada de aquecimento na posição supina e realizar monitoramento intra-operatório, tendo a certeza de manter a documentação apropriada a cada intervalo de 15 min.
- Use fita de papel cirúrgica para fixar as extremidades para a almofada de aquecimento, a fim de manter o animal na posição correcta durante a cirurgia.
- Desinfectar a pele alternadamente com álcool e solução de iodo-povidona três vezes.
- Use um dr estérilmacaco com um campo de funcionamento exposto a evitar a contaminação. Utilizar novas luvas estéreis para cada rato e, se necessário.
3. Ligadura Procedimento
- Abra a pele do rato na posição de linha média do pescoço e peito com um bisturi.
- Puxe a glândula tireóide para a cabeça, separando gentilmente tecidos conjuntivos com uma tesoura sem corte.
- Separar a camada muscular na traqueia na linha média em relação ambos os lados com as agulhas curvas.
- Usando a tesoura sem corte, corte do esterno para a segunda nervura (aproximadamente 5 mm). Abra o corte com uma válvula ou uma pinça curva.
- Separa-se os lóbulos timo um do outro e da parede torácica inferior, separando o tecido conjuntivo com a agulha curvada; o arco aórtico e duas artérias carótidas será claramente visível neste ponto.
- Coloque a agulha curvada sob o arco e perfurar entre a parede do vaso e do tecido conjuntivo, do outro lado por purulentahing a cabeça curvada para fora.
- Usando a agulha curva, puxar o fio de sutura 6-0 de monofilamento sob o arco aórtico.
- Coloque o espaçador no circuito e fixar a sutura no lugar com um duplo nó. Remover o espaçador suavemente.
- Confirmar uma constrição bem sucedida com a posição nó e cortar as extremidades da sutura.
- Feche a parede torácica utilizando 6/0 fio de seda com um padrão de sutura simples interrompido. Fechar a pele com uma sutura 6/0 mono filamento num teste padrão de sutura contínua.
Cuidados 4. Pós-operatório
- Aplicar a solução de iodo-povidona para o local de sutura e colocar o animal em uma gaiola pré-aquecido para a recuperação e acompanhamento pós-operatório.
- Injectar buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg sc a cada 12 h) após o animal ter recuperado a consciência para aliviar a dor e proporcionar o mouse com alimentos moles apropriado.
- Devolver o animal para uma criança de 12 h de luz / quarto ciclo escuro após a recuperação completa.
5.Ecocardiografia: Confirmação da ligadura de sucesso e Medidas
- Depois de uma semana, anestesiar o rato previamente em tiras com 3-5% de isoflurano, por indução, e 1-1,5%, para manutenção, com uma taxa de 1 L / min de fluxo de oxigénio.
- Remova o cabelo do peito usando creme depilatório. Completamente remover o creme com água morna e um aplicador de algodão.
- Garantir o mouse na posição supina para a plataforma de manipulação animal, mantida a 37 ° C. Aplique gel eletrodo para as patas e gravá-los para o bloco com eletrodos.
- Aplique o gel de ultra-som para o peito do rato. Com uma sonda de 40 MHz MS550D e um sistema de ultra-som de alta frequência, realizar Doppler colorido e pulsátil Doppler de varrimento sobre as artérias carótidas direita e esquerda, bem como sobre o arco aórtico.
- Usando B-Mode, localize o ventrículo esquerdo. Usando M-Mode, as pressões sistólica e diastólica espessura da parede pode ser medido. Use Cine loja e quadro de loja para guardar dados e imagens conforme necessário.
- vocêcantar B-Mode, localizar a artéria carótida comum esquerda antes do ponto de ramificação. Use pulsada de onda e Doppler colorido para avaliar o fluxo. Repita com a artéria carótida direita em um ponto similar. Salvar as imagens no Cine loja e modos Quadro loja para analisar mais tarde.
- Inclinar a plataforma de manipulação de animais para a esquerda para que o mouse está na posição de decúbito esquerdo. Coloque a sonda no mouse, a 30 ° compensados a partir de uma posição paralela à cabeça na posição para-esternal e manipular X e Y para encontrar o arco aórtico.
- Localize a constrição. Usar um modo de Doppler a cores para fazer o local da constrição mais visível, como o sangue será que flui através de um canal estreito entre o ponto onde as duas artérias carótidas ramificar-se do arco aórtico.
- Use pulsada de onda e Doppler colorido para medir a velocidade do fluxo de pico. Use Cine loja e quadro de loja para guardar dados e imagens conforme necessário.
- Permitir que o animal se recuperar em uma almofada de aquecimento na posição prona.Devolver o animal para a gaiola original em um 12 horas de luz / quarto ciclo escuro depois que ele se recuperou totalmente da anestesia.
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Resultados
MTAC permite a indução da hipertensão significativa no ventrículo esquerdo de uma forma atempada.
Como visto na Figura 1, a preparação das ferramentas principais para o procedimento é simples e mínima, requerendo apenas 2-4 agulhas de calibre 30 para ser dobradas e mantidas no lugar com um tubo de poliuretano. O próprio procedimento cirúrgico também é menos complicado, como comparado a TAC, e pode ser realizad...
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Discussão
Rockman e colegas desenvolveu o primeiro método para bandagem aórtica como um método para estudar sobrecarga de pressão no coração. Esta pesquisa permitiu começar a descobrir as conseqüências celulares e moleculares da hipertensão e insuficiência cardíaca 1. Um método melhorado, minimamente invasiva constrição da aorta transversal (MTAC), fornece um método passível, dependente do tempo para a indução de sobrecarga de pressão ventricular esquerda e insuficiência cardíaca, sem os inconvenientes da ...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Gostaríamos de reconhecer o Mecanismo de Pesquisa da Universidade de Ciências da Vida (ULS) do Hong Kong Polytechnic University para a prestação de Vevo 2100 sistema de ultra-som. Um agradecimento especial ao Dr. Chunyi Wen da Divisão Interdisciplinar de Engenharia Biomédica, Hong Kong Polytechnic University, de formação e de facilitação. Este trabalho foi apoiado pelo governo HK RGC Grant GRF 17127215, 764812 e HKU6 / CRF / 11G para Billy KC Chow.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 polegada 30 Gauge Needles | BD, Franklin Lakes, NJ 07417, EUA. | 305128 | Curvo como no procedimento e Figura 1 |
| 27 Agulha de calibre | BD, Franklin Lakes, NJ 07417, EUA. | 301629 | Faça sem corte e liso para espaçador |
| 6/0 Dafilon | B. Braun, 34212 Melsungen, Hessen, Alemanha. | C0933066 | |
| 6/0 Silkam | B. Braun, 34212 Melsungen, Hessen, Alemanha. | C0762067 | |
| Luvas estéreis | A.R. Medicom, Inc (Ásia), Hong Kong. | ||
| < aplicador > algodão forte< / forte > | Mannings, Quarry Bay, Hong Kong. | Local Shopping Center | |
| Creme Depilatório | Veet (Hong Kong), Kwun Tong, Kowloon, Hong Kong | Local Shopping Center | |
| Lexer-Baby Scissor | FST, Colúmbia Britânica V7H 0A6, Canadá. | 14078-10 | |
| Curved Iris Forcep | FST, Colúmbia Britânica V7H 0A6, Canadá. | 11065-07 | |
| Micro Olsen-Hegar Porta-Agulhas | WPI, Sarasota, FL 34240, EUA. | 501989 | |
| Stereo Micrioscope | WPI, Sarasota, FL 34240, EUA. | PZMIII-BS | |
| strong>GenTeal Eye Gel | Novartis, East Hanover, NJ 07936, EUA. | Farmácia Local | |
| Almofada de Aquecimento | Kent Scientific Corporation, Torrington, CT 06790, EUA. | DCT-20 | |
| Fita cirúrgica | Unidade de animais | ||
| Cetamina e xilazina | Unidade | ||
| Betadina | Unidade de animais de | ||
| Buprenorfina | Unidade | de animais de laboratório |
Referências
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- de Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
- Hu, P., et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (3), H1261-H1269 (2003).
- Shimizu, I., et al. Excessive cardiac insulin signaling exacerbates systolic dysfunction induced by pressure overload in rodents. J Clin Invest. 120 (5), 1506-1514 (2010).
- Tarnavski, O. Mouse surgical models in cardiovascular research. Methods Mol Biol. 573, 115-137 (2009).
- Zhang, X., et al. A modified murine model for the study of reverse cardiac remodelling. Exp Clin Cardiol. 18 (2), e115-e117 (2013).
- Hartley, C. J., et al. Doppler estimation of reduced coronary flow reserve in mice with pressure overload cardiac hypertrophy. Ultrasound Med Biol. 34 (6), 892-901 (2008).
- Scherrer-Crosbie, M., Thibault, H. B. Echocardiography in translational research: of mice and men. J Am Soc Echocardiogr. 21 (10), 1083-1092 (2008).
- Faerber, G., et al. Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: reduced peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator levels and mitochondrial dysfunction. J Thorac Cardiovasc Surg. 141 (2), 492-500 (2011).
- Li, L., et al. Assessment of Cardiac Morphological and Functional Changes in Mouse Model of Transverse Aortic Constriction by Echocardiographic Imaging. J Vis Exp. (112), (2016).
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Reimpressões e permissões
