Artigo de método

Avaliando o efeito de substâncias químicas ambientais em Honey Bee Desenvolvimento do indivíduo para Colony Nível

DOI:

10.3791/55296

⸱

1 de abril de 2017

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

Neste artigo

Resumo

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Apresentamos aqui um método para alimentar pesticida alimentos contaminados se tanto a um indivíduo abelha do mel e uma colónia colmeia. O procedimento avalia o efeito pesticida em abelhas de mel individuais por alimentação in vivo de dieta da larva de base e também na condição natural da colónia colmeia.

Resumo

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A presença de pesticidas no ambiente apícola é um dos problemas mais sérios que impactam a vida de uma abelha. Os pesticidas podem ser trazidos de volta à colmeia depois que as abelhas se alimentarem de flores que foram pulverizadas com pesticidas. Alimentos contaminados com pesticidas podem ser trocados entre operárias que alimentam larvas e, portanto, podem afetar potencialmente o desenvolvimento das abelhas. Assim, pesticidas residuais no meio ambiente podem se tornar um fator prejudicial crônico para as populações de abelhas e gradualmente levar ao colapso das colônias. No protocolo apresentado, os métodos de alimentação das abelhas são descritos e aplicados a uma abelha individual ou a uma colônia. Aqui, o regulador de crescimento de insetos (IGR) piriproxifeno (PPN), que é amplamente utilizado para controlar insetos-praga e é prejudicial ao desenvolvimento de larvas e pupas de abelhas, é usado como pesticida. O procedimento de apresentação pode ser aplicado a outros produtos químicos potencialmente nocivos ou patógenos de abelhas para estudos posteriores.

Introdução

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A presença de pesticidas no meio ambiente é um dos problemas mais graves que os impactos a vida de uma abelha do mel 1, 2, 3. Vários estudos têm demonstrado a presença de resíduos de pesticidas comum em colónias de abelhas e produtos das abelhas. Em Taiwan, a aplicação média de pesticidas foi 11-12 kg / ha a cada ano (de 2005 a 2013). A quantidade de pesticidas utilizados em Taiwan é maior do que a dos países da UE e os países da América Latina 4, 5. Em outras palavras, o ambiente apícola está sofrendo sério estresse de pesticidas, especialmente em Taiwan e possivelmente em outros países.

O mel de abelha Apis mellifera é um dos principais polinizadores em sistemas agrícolas 6 e também produz produtos valiosos, como mel. No entanto, as abelhas são exposed para vários pesticidas e estes pesticidas podem ser trazidos de volta para colmeias depois das pastagens em flores que foram pulverizados com pesticidas ao recolher néctar e pólen 7, 8. Eles também podem ser expostos a pesticidas pelos apicultores-se com o objetivo de controlar os problemas de pragas dentro das colmeias 9, 10, 11. Porque as larvas de abelhas de mel são alimentados por abelhas enfermeira para o seu desenvolvimento, larvas, parasitas e mesmo a rainha podem ser expostos a estas néctares contaminados com pesticidas e pólen 12. A toxicidade de vários pesticidas para as abelhas precisa ser tratada 13.

Muitos esforços têm sido feitos para avaliar as questões de resíduos de pesticidas ambientais. Yang et al. testado a influência do inseticida imidacloprid neurotóxicos no desenvolvimento de larvas de abelhas mel nocolmeia e relataram que uma dose sub-letal de imidacloprid resultou num comportamento associativo olfactiva das abelhas adultas 14. Além disso, Urlacher et al. examinaram os efeitos sub-letais de um dos pesticidas organofosforados, clorpirifos, sobre o desempenho de aprendizagem de um trabalhador da abelha do mel, em condições laboratoriais 15. No nosso estudo anterior, foi avaliado o impacto de um regulador de crescimento de insectos (IGR), piriproxifeno (PPN), em abelhas de mel larvais 16.

Neste artigo, apresentamos métodos para avaliar os impactos químicos sobre o desenvolvimento das abelhas. métodos de alimentação de abelhas de mel foram descritos e aplicada quer abelhas produtoras de mel individuais ou a uma colónia. No primeiro, testaram-se diferentes concentrações de dieta da larva básica contaminada-pesticida (BLD) em larvas nas colónias para avaliar o impacto do pesticida em abelhas de mel individuais in vivo. Passamos então para simular o Condit naturaisiões do pesticida usando xarope contaminado-pesticida dentro de colmeias. Neste método, PPN, que é amplamente utilizado contra pragas de insectos 17 e é prejudicial para o desenvolvimento de larvas e pupas da abelha do mel 16, 18, 19, será um indicador para representar o efeito negativo do pesticida no campo.

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Protocolo

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1. Preparações

  1. Adicione 1 L de 50% de xarope de açúcar. Dissolve-se 1 kg de sacarose em 1 L de ddH 2 O.
  2. Preparar a soluo de piriproxifeno (PPN) em BLD. Adicione 1,1 L de solução de estoque de 10000 ppm PPN e diluir 100 mL de solução de PPN em 1 L esterilizados ddH 2 O. Armazenar a 4 ° C.
  3. Dilui-se a solução estoque PPN para concentrações finais de 0,1, 1, 10 e 100 mg / kg (ppm) no BLD para a experiência seguinte.
  4. Faça PPN-xarope (para o nível de colônia). Dilui-se a estoque PPN para concentrações finais de 10 e 100 ppm em 50% de xarope de açúcar para a experiência seguinte.
  5. Mel criação de abelha.
    Nota: Aqui, a localização experimental é o apiário Universidade Nacional Ilan (NIU), Yi-Lan City, Taiwan; (Coordenadas GPS: N24.747278, E121.746200).
    1. Verificar mel de abelha (Apis mellifera L.) colónias semanal para a quantidade de alimentos e alimentos para animais com 1 litro de 50% de xarope de açúcar, se necessário (a área de armazenamento de mel está vazio). Definir uma saudávelcolónia como 9 quadros de favos de mel de abelha, em cada colónia com uma rainha postura dos ovos normalmente.
  6. Preparar 100 mL de dieta da larva de base (BLD). Dissolve-se 6% de D-glucose, 6% de frutose, e 1% de extracto de levedura em água desionizada destilada esterilizada (ddH2O) e completar com 50% a geleia real. Armazenar a 4 ° C, mas não mais de 3 dias.
    Nota: Pré-quente a 35 ° C antes da experiência e utilizar no prazo de 3 dias.

2. In Vivo método de alimentação

Nota: In vivo método de alimentação foi modificado a partir de Hanley et al. 20

  1. Mel de abelha selecção larvas e rotulagem.
    1. Inserir um excluidora para dividir 9 quadros de uma colónia saudável para 4 quadros e quadros 5, limitando a rainha para a secção de armação 4. Deixe pelo menos uma moldura vazia na seção 4 moldura para colocar ovos.
    2. Após a rainha de pôr ovos por 1 dia, Veja os quadros para o aparecimento de ovos e manter os ovos no interior das colmeias de 72 h (a 4 ° dia) até 1 dia de idade larvas eclodem. Tomar um dos quadros contendo larvas trabalhador com 1 dia de idade (tracejado dentro de 24 h) para fora a partir do ramo de teste pela mão e remover os trabalhadores da abelha do mel a partir da estrutura com uma escova de abelha.
    3. Cobrir o quadro com uma lâmina transparente (tamanho = comprimento x largura x espessura = 29,7 milímetros x 21 mm x 0.1 mm) e pregar a lâmina transparente na extremidade da armação com percevejos (Figura 1A).
    4. Para cada tratamento, seleccionar aleatoriamente 50 um dia de idade, as larvas (a 4 ° dia) e marcar cada célula ninhada utilizando canetas permanentes na transparente corrediça (Figuras 1A e 1B).
      Nota: Adicione a informação de cada tratamento sobre a armação e corrediça transparente assim usando canetas permanentes para evitar a confusão entre os diferentes tratamentos. Remova os slides marcados e manter para o in vivo </ Em> alimentação e observação.
  2. Na alimentação in vivo.
    1. Adicionar diferentes concentrações de PPN-BLD (0,1, 1, 10 e 100 ppm) para cada célula ninhada marcado por pipetagem no dia 1, 2 e 3 com 10 mL, 10 mL e 20 mL, respectivamente, de acordo com a quantidade de admissão do idade larvas. Adicionar a mesma quantidade de BLD (sem PPN) a um grupo de controlo. Desse modo, a dose total de PPN-BLD em cada célula de cria marcado acumula-se 4, 40, 400, e 4000 pg.
      NOTA: Reconhecer as células de cria rotulados pelas lâminas transparentes marcados e remover as lâminas transparentes marcados após a alimentação. Use fresco BLD para alimentar para prevenir a limpeza das células de cria pelas abelhas obreiras.
    2. Devolver os quadros-tratados PPN para as colónias originais para observações adicionais.
      NOTA: Cada tratamento tem quatro repetições biológicas em quatro colônias.
  3. Observação de larvas tratadas no dia 7.
    1. Para observar the PPN-tratada larvas, retornar os slides transparentes etiquetados para os quadros para gravar a mortalidade e taxa máxima nas células de cria rotulados.
  4. Observação de taxas de eclosão e de pupa tratados no dia 13.
    1. Remova a cera de abelha de células criação selada.
    2. Coloque as pinças macio derrubado na célula de cria e prender o pupas muito ligeiramente em seguida, tomar pupas suavemente.
    3. Transferir as pupas em placas de 24 cavidades de cultura de tecido com uma camada dupla de tecidos de laboratório sob cada poço. Grave o dano e mortalidade durante a transferência de pupa.
    4. Manter as placas de 24 cavidades de cultura de tecidos em uma incubadora a 34 ° C e 70% de humidade relativa até emergência (cerca de 8 dias).
    5. Observar e registar a pupas e abelhas surgiram.
  5. Estatisticas
    1. Calculam-se os dados gravados e presente como uma média ± SD
    2. Analisar os dados utilizando análise de variância (ANOVA), SAS e usar o teste de diferença mínima significativa (LSD) para analisar as diferenças entre os dois meios de diferentes tratamentos. Definir estatisticamente significativa como P -valor <0,05. Letras diferentes na mesma coluna da tabela mostraram um efeito significativo, a análise estatística.

3. A toxicidade de PPN na Colony Nível em colmeia

  1. Configure os grupos de abelhas.
    1. Inserir um excluidora verticalmente para dividir 9 quadros de uma colónia saudável para 4 quadros (Parte A) e 5 quadros (Parte B), enquanto que limitam a rainha para a secção de armação 4. Deixar, pelo menos, um quadro vazio na secção 4-quadro para a postura dos ovos.
      Nota: Dito de outra rainha Excluder o em cima da parte rainha para evitar a rainha de se mover entre as partes.
    2. Após a rainha de pôr ovos por 1 dia, verifique os quadros para o aparecimento de ovos. Pegue os quadros apropriados contendo ovos para fora da parte A com a mão e retirar os trabalhadores da abelha do mela partir da moldura com uma escova de abelha.
    3. Cobrir o quadro com corrediça transparente e pregar a lâmina transparente para a borda do quadro com tachas.
    4. Aleatoriamente selecionar 100 células de cria contendo ovos e marcar cada célula de cria usando marcador permanente sobre a lâmina transparente. Atribuir estes 100 células de cria como Grupo 1. Adicione a informação de cada tratamento sobre a armação e corrediça transparente usando o marcador permanente para evitar a confusão entre os diferentes tratamentos.
    5. Devolver o quadro rotulado a parte A, durante 3 dias e depois transferir a rainha a parte B para colocar ovos.
    6. Após 1 dia, veja os quadros de parte B, escolher uma estrutura apropriada e rotular 100 células de cria contendo ovos, tal como descrito no passo 3.1.4. Atribuir esses 100 células de cria como Grupo 2.
    7. Devolver o quadro rotulado com a parte B por 3 dias e, em seguida, transferir a rainha à parte A para pôr ovos.
    8. Repetir a troca rainha entre a parte A e parte B mais 6 vezes e atribuir grupos numericamente,respectivamente (Figura 2). Deve haver total de 9 grupos.
  2. T mel reat colónia de abelhas com PPN xarope de açúcar no dia 13 (Figura 2).
    1. Adicionar 1 L 50% PPN xarope de açúcar contendo 10 ou 100 ppm em uma caixa de plástico alimentador de abelha (W x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) e colocar a caixa no topo dos quadros nas colónias experimentais.
      Nota: O Grupo 1 não receber o PPN em 13 dias, como as células de cria foram selados.
    2. Alimentar o grupo de controlo com 1 L de 50% de xarope de açúcar (não PPN) como descrito na etapa 2.2.
  3. Contagem de larvas de um dia de idade e ficha como a taxa de eclosão de ovos de 100 células de cria marcadas para cada grupo no dia 5 (figura 2). Mel ovos de abelhas costumam levar 3 dias para eclodir em 0 larvas dia; portanto, verificar e rotular 100 ovos células contendo ninhada no dia 1 e contar o número de larvas de um dia de idade para cada grupo no dia 5 para se obter a percentagem de taxa de eclosão.
  4. Count as células criação selada e ficha como a taxa de nivelamento larvar de 100 células de cria marcadas para cada grupo no dia 11 (Figura 2). 6 a 7 de células de cria larval dia de idade serão cobertas com cera de abelha por trabalhadores de abelhas para pupating larvas.
  5. Observar pupas maturação e registar a taxa de eclosão de 100 células de cria marcadas para cada grupo no dia 17 (Figura 2).
    1. Remova a cera de abelha de células criação selada e tomar pupas com uma pinça com ponta macia suavemente. Transferir as pupas para uma placas de cultura de tecidos de 24 cavidades com uma camada dupla de tecidos de laboratório sob cada poço.
    2. Manter as placas de 24 cavidades de cultura de tecidos em uma incubadora a 34 ° C e 70% de humidade relativa até emergência.
    3. Observar e registar a pupas e emergiu abelhas para cada grupo até Grupo 9 (49 dias experimentais).
      Nota: Cada tratamento tem quatro repetições biológicas.
  6. Estatisticas
    1. Calculam-se os dados gravados e presente como a mia± SD.
    2. Analisar as diferenças significativas entre os pares de tratamentos (por exemplo, 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm e 0 ppm / 100 ppm) em cada grupo através da utilização de duas caudas teste t de Student. Definir como estatisticamente significativa se P -valor <0,05.

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Resultados

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Para o teste de campo da abelha do mel, uma rainha foi limitado à secção 4-quadro para a postura dos ovos. Este passo poderia aumentar a densidade de ninhada em um quadro e facilitar observações subsequentes. Cada tratamento foi rotulado, e desenvolvimento das abelhas foi claramente observado através de um slide transparente. Na alimentação in vivo de PPN-BLD para as larvas de abelhas na colmeia foi realizada para avaliar com precisão a influência de PPN sobre o desenvo...

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Discussão

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O método de postura de ovos limitados-rainha e método de permuta rainha são etapas críticas para a criação de grupos de abelhas para testes de campo dentro deste protocolo. O método de postura de ovos limitados-rainha permite a sincronização do ciclo de vida das abelhas de mel. Consequentemente, os pesquisadores podem selecionar um dia de idade larvas da mesma idade para o tratamento com diferentes doses de pesticidas. Para o método de permuta rainha, a rainha foi trocada entre a parte A (4 frames) e B (5 quadros) para ...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada por Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 do Bureau of Animal e Inspeção de Saúde de Plantas e Quarentena, o Conselho de Agricultura, Yuan Executivo e Grant 103-2313-B-197-002-MY3 do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Caixa de abelhasSAN-YI Honey FactoryW1266Abelhas criando
Rainha excluder (entre quadros)SAN-YI Honey FactoryI1575Limitação da Rainha 
Exclusão de rainha (no topo)SAN-YI Honey FactoryI1566Limitação de rainha no topo 
Escova de abelhaSAN-YI Honey Factory, TaiwanW1414limpa as abelhas na estrutura suavemente
Alimentador de abelhaSAN-YI Honey Factory, TaiwanP0219alimenta xarope de açúcar para a colônia
Lâmina transparenteWan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)1139Marque a área larval nas armações (Material: Polietileno Tereftalato, PET) (Tamanho = Comprimento*Largura*espessura = 29,7 mm * 21 mm * 0,1 mm)
Placa de cultura de 24 poçosGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., LtdTCP011024Criação de pupas de extração
AutoclaveTomin medical equipmenco., LTD.TM-321Faça água destilada destilada esterilizada (ddH2O)
P20 pipetmanGilsonF123600Adicione PPN à piscina de alimentos para larvas de abelhas
Incubadora Fornecedor:Yihder Co., Ltd.LE-550RDCriação de pupas de extração
KimwipesCOW LUNG INSTRUMENT CO., LTDCriação de pupas de extração
Geléia realNational Ilan University (NIU)NIUFaça dieta larval básica (BLD)
D- (+) -GlicoseSigmaG8270Faça dieta larval básica (BLD)
D- (-) -FrutoseSigmaF0127Faça dieta larval básica ( BLD)
Extrato de leveduraCONDA, pronadisa1702Faça dieta larval básica (BLD)
SacaroseTaiwan açúcar coporationE01071010Faça xarope de açúcar para alimentos apícolas
Piriproxifeno (11%)LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD.Registro nº 1937Regulador de crescimento de insetos (IGR) usado no experimento
KCS34155

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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