Artigo de método

Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D

DOI:

10.3791/55304

⸱

16 de março de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

* These authors contributed equally

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Resumo

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Nós descrevemos métodos simples para o estudo da regulação da função intestinal transportador de serotonina (SERT) e de expressão, utilizando um modelo in vitro de células de cultura de células Caco-2 cultivadas em 3D e um modelo ex vivo de intestino de rato. Estes métodos são aplicáveis ​​para o estudo de outros transportadores epiteliais.

Resumo

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O epitélio intestinal tem importantes funções de transporte e de barreira que desempenham um papel-chave nas funções fisiológicas normais do corpo, proporcionando uma barreira para partículas estranhas. transporte epitelial prejudicada (íon, nutrientes, ou drogas) tem sido associada a muitas doenças e pode ter consequências que ultrapassam as funções fisiológicas normais dos transportadores, como por influenciar a integridade do epitélio e o microbioma intestinal. Compreendendo a função e a regulação das proteínas de transporte é crítico para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. O maior desafio no estudo do transporte epitelial é o desenvolvimento de um sistema modelo adequado que recapitula características importantes das células epiteliais intestinais nativas. Vários modelos in vitro de cultura de células, tais como células Caco-2, T-84, e células HT-29-Cl.19A são normalmente utilizados em pesquisa de transporte epitelial. Estas linhas celulares representam uma abordagem reducionista para modelar o epithelium e têm sido utilizados em vários estudos mecanicistas, incluindo o seu exame de interacções epiteliais-microbiana. No entanto, as monocamadas de células não reflectem com precisão as interacções célula-célula e o microambiente in vivo. As células cultivadas em 3D mostraram-se promissores modelos para estudos de permeabilidade de drogas. Mostra-se que as células Caco-2 em 3D podem ser utilizados para estudar os transportadores epiteliais. É também importante que os estudos em células Caco-2 são complementados com outros modelos para excluir efeitos específicos de células e para ter em conta a complexidade do intestino nativo. Vários métodos têm sido anteriormente utilizados para avaliar a funcionalidade de transportadores, como o saco evertido e absorção nas células epiteliais isolados ou em vesículas da membrana do plasma isoladas. Levando em consideração os desafios no campo com respeito a modelos ea medição da função de transporte, demonstramos aqui um protocolo para crescer células Caco-2 em 3D e descrevem o uso de uma câmara Ussing como umabordagem eficaz para medir o transporte da serotonina, como no epitélio intestinal polarizadas intactas.

Introdução

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O epitélio intestinal é equipado com várias proteínas de transporte (canais, ATPases, co-transportadores e trocadores) que realizam numerosas funções que vão desde a absorção de nutrientes, electrólitos, e medicamentos para a secreção de fluido e de iões no lúmen. proteínas de transporte gerar gradientes electroquímicos que permitem o movimento de iões ou moléculas de um modo vectorial. Isto é conseguido por as distribuições assimétricas de os sistemas de transporte nas membranas basolaterais e apicais de células epiteliais polarizadas. Além disso, as junções apertadas, que amarrar as células epiteliais adjacentes, desempenham um papel importante neste processo, servindo como uma barreira para a difusão dos componentes intramembranar entre os domínios de membrana apical e basolateral. Sistemas modelo adequado que mimetizam estas características do intestino nativo (isto é, a polaridade, a diferenciação e a integridade junção estanque) são críticos para o estudo da functionalidade de sistemas de transporte epiteliais.

No que diz respeito aos modelos, as linhas celulares típicas actualmente utilizadas na pesquisa de transporte epitelial intestinal Caco-2 são, de um modelo completamente diferenciado, absorventes de células epiteliais do intestino delgado; e células T84 ou HT-29 subclones, modelos de grandes células epiteliais intestinais derivado 1-crypt. Convencionalmente, estas linhas de células são crescidas como monocamadas em superfícies de plástico ou em inserções Transwell revestidas. Trans poços de cultura de células inserções em certa medida, assemelhar-se ao ambiente in vivo, permitindo que as células polarizadas para alimentar basolateralmente. No entanto, uma limitação dos sistemas de cultura 2D convencionais é que as células são forçadas a se adaptar a uma superfície artificial, plana e rígida. Assim, a complexidade fisiológica do epitélio nativa não é reflectida de forma adequada num sistema 2D. Esta limitação foi superada através de métodos de cultivar células em 3D em um microambiente específico, como MIXTUR proteína gelatinosaE, contendo uma variedade de componentes da matriz extracelular 2, 3. No entanto, as culturas in vitro não pode simular a complexidade do epitélio intestinal, o que tem vários tipos de células e a arquitectura específica da região no intestino. Assim, os estudos utilizando modelos de cultura celular exigir uma validação adicional no intestino nativo. Utilizando a cultura de células in vitro 3D e da mucosa intestinal do rato, que descrevem aqui métodos simples para estudar a regulação do transportador de serotonina intestinal (SLC6A4, SERT).

O transportador SERT regula a disponibilidade extracelular de uma hormona importante neurotransmissor e, 5-hidroxitriptamina (5-HT), transportando-o através de uma rápida Na + / Cl - dependente de processo. SERT é um alvo conhecido dos anti-depressivos e surgiu recentemente como um novo alvo terapêutico de distúrbios gastrointestinais, como diarréia e inflamação intestinal.Métodos para investigar absorção de 5-HT, em células epiteliais intestinais foram anteriormente descritos. Por exemplo, Caco-2 células cultivadas em suportes de plástico ou inserções permeáveis têm mostrado exibir absorção 3 H-5-HT fluoxetina e minúsculas em ambos os domínios basolaterais e apicais 4. A medida da função SERT em escova isolado beira da Membrana As vesículas (BBMVs) preparado a partir de doadores de órgãos humanos intestino delgado, também foi descrita por 5 nós. 3 absorção de H-5-HT em BBVMs humanos mostrou-se fluoxetina-sensível e Na + / Cl - dependente, e exibiu uma cinética de saturação com um K m de 300 nM 5. Utilizando métodos semelhantes, também medido anteriormente função de SERT como 3 absorção de H-5-HT no rato BBMVs intestinais 6. No entanto, a preparação de vesículas de membrana de plasma puro requer uma grande quantidade de tecido de mucosa. Outros métodos, tais como o radiographic visualização de locais de recaptação 3 H-5-HT, têm também sido mostrado anteriormente na cobaia e de ratazana intestino delgado 7.

A câmara Ussing proporciona um sistema mais fisiológico para medir o transporte de iões, nutrientes, e medicamentos através de vários tecidos epiteliais. A principal vantagem da técnica de câmara Ussing é que ele permite a medição precisa dos parâmetros eléctricos e de transporte de intacta, epitélio intestinal polarizada. Além disso, para minimizar a influência do sistema neuromuscular intrínseca, de decapagem seromuscular da mucosa intestinal pode ser realizada para investigar a regulação dos transportadores no epitélio 8.

Nós demonstramos que as células Caco-2 cultivadas em 3D na proteína gelatinosa formar um lúmen oco que expressam marcadores apical e basolateral distintas. Estas células apresentam maior expressão de SERT do que as células Caco-2 2D. Métodos para cultivar células em 3D e perform imunocoloração ou extração de RNA e de proteínas são descritos. Além disso, descrevemos métodos para estudar a função SERT e regulação dos TGF-β1, uma citocina pleiotropic, na mucosa do intestino delgado, utilizando uma técnica de câmara de Ussing.

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Protocolo

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1. Estudo de intestinal transportador num sistema de cultura 3D de Caco-2: Cultivo Cultura de Células Caco-2 3D sobre uma mistura de proteína gelatinoso

  1. factor de crescimento reduzida Descongelar mistura gelatinosa proteína em gelo durante 8 h (ou O / N) a 4 ° C. Uma vez descongelada, fazer 1 mL ou 500 mL alíquotas para uso ou armazenar a -20 ° C para uso posterior.
  2. No dia da cultura, as placas de cultura pré-resfriamento (para extracção de ARN e proteína) ou lâminas de câmaras (por imunocoloração) em gelo. Adicionar 30 uL de mistura de proteína gelatinosa a cada poço de uma corrediça de vidro compartimentado oito poços (ou 120 uL por poço de uma placa de 6 poços) e espalhar uniformemente. Tome cuidado para não gerar bolhas de ar durante o processo.
  3. Colocar as lâminas / placas dentro de uma incubadora de cultura de células a 37 ° C durante 15-30 min e permitir que a mistura de proteína gelatinoso para solidificar.
  4. Enquanto a mistura de proteínas é gelatinoso solidificando, trypsinize um frasco confluente de células Caco-2.
  5. Contar o númerode células e colocá-los a 500 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. Re-suspender o sedimento de células em 3D Caco-2 médio, conforme necessário.
  6. Semear as lâminas de câmara de vidro e 4.000 células por poço (para placas, 20.000 por poço). Permitir que as células a crescer numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C. Alterar médio a cada 3 - 4 d.

2. Imunofluorescência coloração para epitelial Transportadores em 3D Caco-2 Cells: Dia 1

  1. Aspirar o meio e fixar as células com 400 uL de 2% de paraformaldeído (PFA) (em PBS com o pH ajustado para 8,5 com NaOH) durante 30 min à TA.
    NOTA: solução PFA não devem ser armazenados durante mais de 1 semana a 4 ° C, e frescos solução pode ser utilizada. CUIDADO: PFA é altamente tóxico e potencialmente cancerígeno. Sempre lidar com isso com cuidado em uma capa química e uso de equipamentos de proteção individual.
  2. Lavar as cavidades duas vezes com PBS 1x e armazenar as lâminas a 4 ° C em PBS (400 ul /bem). Uma vez fixo, armazená-los a 4 ° C durante até uma semana.
  3. Aquecer as lâminas de câmara para RT (isso vai endurecer a cama mistura de proteína gelatinosa e torná-lo fácil para aspirar durante as etapas de lavagem).
  4. Permeabilizar as células com 0,5% de Triton em PBS durante não mais do que 15 min.
  5. Preparar tampão PBS-glicina (130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de NaH 2 PO 4, e 100 mM de glicina). Lavar 3x com PBS 1x-glicina durante 10 minutos cada à temperatura ambiente.
  6. Preparar tampão de imunofluorescência (IF): 130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de NaH 2 PO 4, glicina 100 mM, NaN 7,7 3, 0,1% de BSA, 0,2% Triton X-100, e 0,05% de Tween-20 .
  7. Lavar 3x em tampão IF durante 10 minutos cada à temperatura ambiente. Bloco em 5% normal Goat Serum (NGS) em tampão IF. Incubar com anticorpo primário diluído em soro de cabra + 1% de SE, 200 uL / ​​poço, durante 1 - 2 h à TA. Lave com tampão IF 3x durante 10 minutos cada um.
  8. Incube com anti secundáriocorpo (1: 200) diluída em SE + 1% de NGS, 200 uL / ​​poço, durante 1 h, à RT.
  9. Lave com tampão IF três vezes durante 10 minutos cada. Mantenha os slides no escuro a partir deste passo. Levante as câmaras de plástico dos lâminas de vidro, colocando o slide câmara em um suporte preto e deslizando um levantador branca através do suporte até que seus contatos de borda a borda dos poços. Gentilmente puxar para cima as câmaras (o titular eo levantador deve vir com os slides de cultura).
  10. Montagem com meio anti-fade lento e deixe-a secar por 10 minutos em temperatura ambiente.
  11. Uma vez completamente seco, selar as lâminas com unha polonês e imagem-los com a microscopia confocal. Armazenar as lâminas a 4 ° C durante duas semanas ou a -20 ° C durante vários meses.

3. RNA e extração de proteínas de 3D Caco-2 células

  1. Tratar as células cultivadas na mistura gelatinosa proteína de 12 - 14 d, com um agente de teste, tais como TGF- β1 (10 ng / mL, 1 h).
  2. Após o tratamento, lavar as células com umax PBS. Manter as células em gelo durante 30 min para se liquefazer a mistura de proteína gelatinosa.
  3. Lavar os poços com PBS gelada e recolher as células em tubos de centrífuga individuais. Recolher as células através de centrifugação a baixa velocidade a 500 xg e 4 ° C durante 10 min. Extrai-se a ARN utilizando procedimentos padrão e utilizar em tempo real de RT-PCR.
  4. Para a extracção de proteínas, a lise das células utilizando tampão de lise celular 1x suplementado com inibidor de protease 1x cocktail. Após a adição de tampão de lise de células para o sedimento, a lise das células por ultra-sons e remover os restos celulares por centrifugação a 7500 xg e 4 ° C durante 10 min.

4. Medição do 5-HT A captação do rato íleo Utilizando uma Câmara de Ussing: Preparação intestinal e seromuscular Decapagem

  1. Após a eutanásia, dissecar os ratos e remover o intestino delgado (após o estômago e antes do ceco). Dividir o intestino delgado em três partes. Descartar o terço médio, use o terço proximalcomo jejuno, e usar o terço distal como íleo. Evitar puxar o intestino a partir da sua ligação mesentérica para evitar danos ao epitélio. Manter o frio secção de tecido cobrindo-o com gelado bicarbonato de Krebs-Ringer tampão (KBR).
  2. Abra o intestino longitudinalmente com uma tesoura. Incubar secções intestinais recentemente excisadas em gelada, gaseamento KBR contendo 1 uM de indometacina durante 10 min antes da seromuscular decapagem.
  3. Pin a secção intestinal (~ 1 cm de comprimento) da mucosa voltada para baixo para uma placa contendo 7% de agarose ou de elastómero de silicone curado (0,5 cm de espessura).
  4. Tira as camadas seromuscular sob um microscópio estereoscópico de dissecação com iluminação de fundo. Cortar a camada seromuscular usando uma lâmina de bisturi pena. Utilize uma pinça fina para obter o bordo da camada ao longo do eixo longitudinal do intestino.
    NOTA: Durante o processo de extracção, a iluminação de fundo do microscópio estereoscópico ajuda a identificar e evitar áreas com placa de Peyeres.
  5. Após a conclusão da operação de stripping seromuscular, montar a mucosa cuidadosamente sobre os pinos de uma meia-câmara Ussing. Durante todo o processo, tome cuidado para segurar o tecido da mucosa despojado pelas bordas, para evitar que se rasgue.

5. A equilibração e o tratamento dos tecidos

  1. Preparar a solução de Kreb: NaCl 115 mM, NaHCO3 25, 2,4 mM de K 2 HPO 4, CaCl2 1,2, MgCl2 1,2, e 0,4 mM de KH 2 PO 4 a pH 7,4, gaseificado com 95% O2 / 5% CO 2 a 37 ° C. Adicionar 10 mM de glucose para o banho de seroso para servir como um substrato energético e manitol 10 mM ao banho mucoso para manter o equilíbrio osmótico.
    Nota: A solução de Krebs é suplementada com ácido L-ascórbico (100 uM) e pargilina (100 uM, inibidor de monoamina-oxidase) para evitar a degradação intracelular de 5-HT.
  2. Insira o controle deslizante para a câmara para expor tanto a si (luminal) apicale de o (seroso) lado basolateral do tecido a uma solução de Kreb.
  3. Após um período de equilibração de 10 min, o pré-tratamento do tecido do íleo com fluoxetina (10 uM) durante 30 min no lado apical para o MS de fluxo (J-a-mucosa da serosa).
  4. Tratar o tecido com TGF-β1 (10 ng / mL) durante 1 h no lado basolateral e depois incubar com 3 [H] -5-HT (20 nM) durante 30 min sobre o lado apical.

6. A quantificação da mucosa a serosa fluxo (J ms) e 3 [H] -5-HT acumulação no tecido

  1. Recolhe 0,75 mL alíquotas do reservatório seroso (total de 5 ml) para medir a radioactividade num contador de cintilação líquida e para calcular mucosa-a serosa (J ms) taxas de fluxo; sensíveis fluoxetina-flux representa SERT mediada por 3 a absorção de [H] -5-HT.
  2. Para evitar diferenças de pressão hidrostática através da mucosa durante um período de fluxo, recolher amostras do lado da serosa e recolocá-los com volumes iguais de meio de banho.
    NOTA: O cálculo do fluxo corrige para a diluição final da amostra (4,25 ml / 5 ml = 0,85).
  3. Para a quantificação de 3 [H] -5-HT acumulada no tecido, desmontar a mucosa do cursor, lavar uma vez com tampão KRB gelada, e colocá-lo em tubos de cultura de vidro.
  4. Incubar a mucosa em 0,5 mL de KOH a 10% durante a noite a 37 ° C. Medir a radioactividade em 150 ul de aliquotas dos lisados ​​(em triplicado), utilizando um contador de cintilação líquida.
  5. Utilizar-se aliquotas (3-5 ul) dos lisados ​​para medir a concentração de proteína utilizando o método de Bradford.
    NOTA: 10 ml de meio de incubação contendo serotonina radioactivos é usada como um padrão. 5-HT retidos no tecido é expressa em pmol / mg de proteína / min.

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Resultados

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A imunocoloração em 3D Caco-2 cistos é mostrado na Figura 1. Uma imagem representativa de um plano XY mostrando lúmen bem demarcadas do cisto 3D coradas com faloidina actina é representado na Figura 1A. O lado voltado para o lúmen denota o lado apical. As células epiteliais de cultura em resultado ambiente 3D num fenótipo epitelial robusto. Diferentes células Caco-2 cistos no dia 12, quando a actina e SERT foram co-corados, são mostradas na Figur...

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Discussão

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As monocamadas de células Caco-2 completamente diferenciadas foram utilizados extensivamente como monocamadas epiteliais polarizadas para estudar o transporte intestinal 10, 11, 12, 13, 14, 15. No entanto, para imitar a organização fisiológico das células epiteliais intestinais, tem havido um interesse considerável no desenv...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos ao Sr. Christopher Manzella, estudante de MD/PhD no laboratório RKG, por ajudar a editar e revisar nosso manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x PBSATCCATCC® HTB&tímido; 37™Células
10x PBSCarl ZeissMicrosope para Imagem Confocal
3[H]-5-HT LabtekII152453Células de cultura para microscopia
5-HT Gibco70013-032Não é uma substância perigosa
95% O2- 5% CO2 cilindroKPL71-00-27Não é uma substância perigosa
Ágar (para placas de ágar)FischerBP151-100Toxicidade aguda, Ora
Ágar (para eletrodo)SigmaG7126-1KGNão é uma substância perigosa
Alexa Fluor FaloidinaSigmaC3867-1VLNão é uma substância perigosa
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaP6148-500GNocivo se ingerido ou inalado
CaCl2LifeTechnologiesA12380Não é uma substância perigosa
Células Caco-2 SigmaA8806-5GNão é uma substância perigosa
Tampão de lise celularFischerBP337-100Não é um substância perigosa
Lâminas ChaberedSigmaS5886-1KGNão é uma substância perigosa
Solução de colágeno tipo 1SigmaS8045-500G
EletrodosSigmaS-0876
EMEMGibco da Life Technologies25200-056
Soro fetal bovino (FBS)Corning356234usado como matriz extracelular
FluoxetinaQiagen74104
GentamicinaATCC30-2003 Mídia deCultura
Sinalização Celular de Glicina, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
IndometacinaGibco da Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco da Life Technologies15710-064
KOHGibco da Life Technologies15630-080
Ácido L-ascórbico líquida 10082147da Gibco by Life
Technologies Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
de Manitol, San Diego, CA P2304
MatrigelPhysiologic Instruments, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2Physiologic Instruments, San Diego, CA DM MC6
Multicanal Tensão/corrente ClampPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2300
NaClPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St Louis, MOS5886
Soro de cabra normal (NGS, 10%)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
Paraformaldeído (PFA)Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Pen-StrpSigma-Aldrich, St Louis, MOC3881
Reagente de ensaio de proteínaSigma-Aldrich, St Louis, MO10420
Coquetel de inibidor de proteinaseMEDOX, Chicago, IL estilo G- 12300
RNA easy Mini kitSigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
Módulo de Entrada de Eletrodo de Canal Único Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
Controles deslizantes para câmaras snapwellSigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
Fosfato de sódio (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
Hidróxido de sódio (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β 1Perkin-Elmer, Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Tripsina EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratories, Hércules, CA5000006
Câmara de Ussing (somente câmara)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Sistemas de Câmara UssingSigma-Aldrich, St Louis, MOA1296
de CélulasContador de cintilação Instrumentos Fisiológicos

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Reimpressões e permissões

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Errata

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Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

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Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

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