Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D

Summary

Nós descrevemos métodos simples para o estudo da regulação da função intestinal transportador de serotonina (SERT) e de expressão, utilizando um modelo in vitro de células de cultura de células Caco-2 cultivadas em 3D e um modelo ex vivo de intestino de rato. Estes métodos são aplicáveis ​​para o estudo de outros transportadores epiteliais.

Abstract

O epitélio intestinal tem importantes funções de transporte e de barreira que desempenham um papel-chave nas funções fisiológicas normais do corpo, proporcionando uma barreira para partículas estranhas. transporte epitelial prejudicada (íon, nutrientes, ou drogas) tem sido associada a muitas doenças e pode ter consequências que ultrapassam as funções fisiológicas normais dos transportadores, como por influenciar a integridade do epitélio e o microbioma intestinal. Compreendendo a função e a regulação das proteínas de transporte é crítico para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. O maior desafio no estudo do transporte epitelial é o desenvolvimento de um sistema modelo adequado que recapitula características importantes das células epiteliais intestinais nativas. Vários modelos in vitro de cultura de células, tais como células Caco-2, T-84, e células HT-29-Cl.19A são normalmente utilizados em pesquisa de transporte epitelial. Estas linhas celulares representam uma abordagem reducionista para modelar o epithelium e têm sido utilizados em vários estudos mecanicistas, incluindo o seu exame de interacções epiteliais-microbiana. No entanto, as monocamadas de células não reflectem com precisão as interacções célula-célula e o microambiente in vivo. As células cultivadas em 3D mostraram-se promissores modelos para estudos de permeabilidade de drogas. Mostra-se que as células Caco-2 em 3D podem ser utilizados para estudar os transportadores epiteliais. É também importante que os estudos em células Caco-2 são complementados com outros modelos para excluir efeitos específicos de células e para ter em conta a complexidade do intestino nativo. Vários métodos têm sido anteriormente utilizados para avaliar a funcionalidade de transportadores, como o saco evertido e absorção nas células epiteliais isolados ou em vesículas da membrana do plasma isoladas. Levando em consideração os desafios no campo com respeito a modelos ea medição da função de transporte, demonstramos aqui um protocolo para crescer células Caco-2 em 3D e descrevem o uso de uma câmara Ussing como umabordagem eficaz para medir o transporte da serotonina, como no epitélio intestinal polarizadas intactas.

Introduction

O epitélio intestinal é equipado com várias proteínas de transporte (canais, ATPases, co-transportadores e trocadores) que realizam numerosas funções que vão desde a absorção de nutrientes, electrólitos, e medicamentos para a secreção de fluido e de iões no lúmen. proteínas de transporte gerar gradientes electroquímicos que permitem o movimento de iões ou moléculas de um modo vectorial. Isto é conseguido por as distribuições assimétricas de os sistemas de transporte nas membranas basolaterais e apicais de células epiteliais polarizadas. Além disso, as junções apertadas, que amarrar as células epiteliais adjacentes, desempenham um papel importante neste processo, serv....

Protocol

1. Estudo de intestinal transportador num sistema de cultura 3D de Caco-2: Cultivo Cultura de Células Caco-2 3D sobre uma mistura de proteína gelatinoso

1. factor de crescimento reduzida Descongelar mistura gelatinosa proteína em gelo durante 8 h (ou O / N) a 4 ° C. Uma vez descongelada, fazer 1 mL ou 500 mL alíquotas para uso ou armazenar a -20 ° C para uso posterior.
2. No dia da cultura, as placas de cultura pré-resfriamento (para extracção de ARN e proteína) ou lâminas de câmaras (por imunocoloração) em gelo. Adicionar 30 uL de mistura de proteína gelatinosa a cada poço de uma corrediça de vidro compartimentado oito poços (ou 120 uL por poço de uma....

Results

A imunocoloração em 3D Caco-2 cistos é mostrado na Figura 1. Uma imagem representativa de um plano XY mostrando lúmen bem demarcadas do cisto 3D coradas com faloidina actina é representado na Figura 1A. O lado voltado para o lúmen denota o lado apical. As células epiteliais de cultura em resultado ambiente 3D num fenótipo epitelial robusto. Diferentes células Caco-2 cistos no dia 12, quando a actina e SERT foram co-corados, são mostradas na Figur.......

Discussion

As monocamadas de células Caco-2 completamente diferenciadas foram utilizados extensivamente como monocamadas epiteliais polarizadas para estudar o transporte intestinal ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} No entanto, para imitar a organização fisiológico das células epiteliais intestinais, tem havido um interesse considerável no desenv.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	ATCC	ATCC® HTB&tímido; 37™	Células
10x PBS	Carl Zeiss		Microsope para Imagem Confocal
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	Células de cultura para microscopia
5-HT	Gibco	70013-032	Não é uma substância perigosa
95% O2- 5% CO2 cilindro	KPL	71-00-27	Não é uma substância perigosa
Ágar (para placas de ágar)	Fischer	BP151-100	Toxicidade aguda, Ora
Ágar (para eletrodo)	Sigma	G7126-1KG	Não é uma substância perigosa
Alexa Fluor Faloidina	Sigma	C3867-1VL	Não é uma substância perigosa
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	P6148-500G	Nocivo se ingerido ou inalado
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	Não é uma substância perigosa
Células Caco-2 Sigma		A8806-5G	Não é uma substância perigosa
Tampão de lise celular	Fischer	BP337-100	Não é um substância perigosa
Lâminas Chabered	Sigma	S5886-1KG	Não é uma substância perigosa
Solução de colágeno tipo 1	Sigma	S8045-500G
Eletrodos	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco da Life Technologies	25200-056
Soro fetal bovino (FBS)	Corning	356234	usado como matriz extracelular
Fluoxetina	Qiagen	74104
Gentamicina	ATCC	30-2003 Mídia de	Cultura
Sinalização Celular de Glicina	, Danvers, MA
Hepes	Roche	11836145001
Indometacina	Gibco da Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco da Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco da Life Technologies	15630-080
Ácido L-ascórbico	líquida 10082147		da Gibco by Life
Technologies	Gibco by Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments, San Diego, CA	EM-CSYS-8
de Manitol	, San Diego, CA	P2304
Matrigel	Physiologic Instruments, San Diego, CA	VCC MC8
MgCl2	Physiologic Instruments, San Diego, CA	DM MC6
Multicanal Tensão/corrente Clamp	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2300
NaCl	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Soro de cabra normal (NGS, 10%)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldeído (PFA)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Reagente de ensaio de proteína	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Coquetel de inibidor de proteinase	MEDOX, Chicago, IL	estilo G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Módulo de Entrada de Eletrodo de Canal Único	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Controles deslizantes para câmaras snapwell	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Fosfato de sódio (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Hidróxido de sódio (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-β 1	Perkin-Elmer, Waltham, MA	NFT1167250UC
Triton X-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Tripsina EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hércules, CA	5000006
Câmara de Ussing (somente câmara)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Sistemas de Câmara Ussing	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296