Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D

Arivarasu N. Anabazhagan; Ishita Chatterjee; Shubha Priyamvada; Anoop Kumar; Sangeeta Tyagi; Seema Saksena; Waddah A. Alrefai; Pradeep K. Dudeja; Ravinder K. Gill

doi:10.3791/55304

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Artigo de método

Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D

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DOI:

10.3791/55304

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16 de março de 2017

Arivarasu N. Anabazhagan^*¹ , Ishita Chatterjee^*¹ , Shubha Priyamvada¹ , Anoop Kumar¹ , Sangeeta Tyagi¹ , Seema Saksena¹^,² , Waddah A. Alrefai¹^,² , Pradeep K. Dudeja¹^,² , Ravinder K. Gill¹

¹Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, ²Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

^* These authors contributed equally

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Resumo

Nós descrevemos métodos simples para o estudo da regulação da função intestinal transportador de serotonina (SERT) e de expressão, utilizando um modelo in vitro de células de cultura de células Caco-2 cultivadas em 3D e um modelo ex vivo de intestino de rato. Estes métodos são aplicáveis para o estudo de outros transportadores epiteliais.

Resumo

O epitélio intestinal tem importantes funções de transporte e de barreira que desempenham um papel-chave nas funções fisiológicas normais do corpo, proporcionando uma barreira para partículas estranhas. transporte epitelial prejudicada (íon, nutrientes, ou drogas) tem sido associada a muitas doenças e pode ter consequências que ultrapassam as funções fisiológicas normais dos transportadores, como por influenciar a integridade do epitélio e o microbioma intestinal. Compreendendo a função e a regulação das proteínas de transporte é crítico para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. O maior desafio no estudo do transporte epitelial é o desenvolvimento de um sistema modelo adequado que recapitula características importantes das células epiteliais intestinais nativas. Vários modelos in vitro de cultura de células, tais como células Caco-2, T-84, e células HT-29-Cl.19A são normalmente utilizados em pesquisa de transporte epitelial. Estas linhas celulares representam uma abordagem reducionista para modelar o epithelium e têm sido utilizados em vários estudos mecanicistas, incluindo o seu exame de interacções epiteliais-microbiana. No entanto, as monocamadas de células não reflectem com precisão as interacções célula-célula e o microambiente in vivo. As células cultivadas em 3D mostraram-se promissores modelos para estudos de permeabilidade de drogas. Mostra-se que as células Caco-2 em 3D podem ser utilizados para estudar os transportadores epiteliais. É também importante que os estudos em células Caco-2 são complementados com outros modelos para excluir efeitos específicos de células e para ter em conta a complexidade do intestino nativo. Vários métodos têm sido anteriormente utilizados para avaliar a funcionalidade de transportadores, como o saco evertido e absorção nas células epiteliais isolados ou em vesículas da membrana do plasma isoladas. Levando em consideração os desafios no campo com respeito a modelos ea medição da função de transporte, demonstramos aqui um protocolo para crescer células Caco-2 em 3D e descrevem o uso de uma câmara Ussing como umabordagem eficaz para medir o transporte da serotonina, como no epitélio intestinal polarizadas intactas.

Introdução

O epitélio intestinal é equipado com várias proteínas de transporte (canais, ATPases, co-transportadores e trocadores) que realizam numerosas funções que vão desde a absorção de nutrientes, electrólitos, e medicamentos para a secreção de fluido e de iões no lúmen. proteínas de transporte gerar gradientes electroquímicos que permitem o movimento de iões ou moléculas de um modo vectorial. Isto é conseguido por as distribuições assimétricas de os sistemas de transporte nas membranas basolaterais e apicais de células epiteliais polarizadas. Além disso, as junções apertadas, que amarrar as células epiteliais adjacentes, desempenham um papel importante neste processo, serv....