Artigo de método

Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia

DOI:

10.3791/55315

⸱

14 de abril de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O cílio primário é fundamentalmente importante na proliferação de células progenitoras neurais, a diferenciação neuronal, e função neuronal adulta. Aqui, descrevemos um método para estudar ciliogênese e o tráfico de proteínas de sinalização para os cílios em células estaminais / progenitoras neuronais e neurónios diferenciados utilizando culturas primárias de neuroesferas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O cílio primário é fundamentalmente importante para a proliferação de células-tronco neurais/progenitoras e para a diferenciação neuronal durante a vida embrionária, pós-natal e adulta. Além disso, a maioria dos neurônios diferenciados possui cílios primários que abrigam receptores de sinalização, como receptores acoplados à proteína G, e moléculas de sinalização, como adenilil ciclases. O cílio primário determina a atividade de múltiplas vias de desenvolvimento, incluindo a via do ouriço sônico durante o desenvolvimento neuronal embrionário, e também funciona na promoção da sinalização subcelular compartimentada durante a função neuronal adulta. Sem surpresa, defeitos na biogênese e função primária do cílio têm sido associados a anomalias de desenvolvimento do cérebro, obesidade central e déficits de aprendizagem e memória. Assim, é imperativo estudar a biogênese primária do cílio e o tráfego ciliar no contexto de células-tronco neurais/progenitoras e neurônios diferenciados. No entanto, os métodos de cultura para neurônios primários requerem experiência considerável e não são passíveis de ciclos de congelamento e descongelamento. Neste protocolo, discutimos métodos de cultura para populações mistas de células-tronco neurais/progenitoras usando neuroesferas primárias. Os métodos de cultura baseados em neuroesferas fornecem os benefícios combinados do estudo de células-tronco neurais primárias / progenitoras: receptividade a múltiplas passagens e ciclos de congelamento e descongelamento, potencial de diferenciação em neurônios / glia e transfectabilidade. É importante ressaltar que determinamos que as células-tronco / progenitoras neurais derivadas da neuroesfera e os neurônios diferenciados são ciliados em cultura e localizam moléculas de sinalização relevantes para a função ciliar nesses compartimentos. Utilizando essas culturas, descrevemos ainda métodos para estudar a ciliogênese e o tráfego ciliar em células-tronco neurais / progenitoras e neurônios diferenciados. Esses métodos baseados na neuroesfera nos permitem estudar as vias celulares reguladas pelos cílios, incluindo o receptor acoplado à proteína G e a sinalização sônica do ouriço, no contexto de células-tronco neurais / progenitoras e neurônios diferenciados.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O cílio primário é um compartimento subcelular dinâmico baseado em microtúbulos que funciona como uma antena sensorial na coordenação de vias de sinalização celular, incluindo a via de Hedgehog Sonic (Shh), durante o desenvolvimento neuronal embrionário 1, 2, e sinalização subcelular compartimentada em adulto função neuronal 3, 4 . Sinalização componentes destas vias, tais como o receptor de Shh Patched 5; o activador via de Smoothened (Smo) 6; e Gpr161 7, um receptor órfão de Pro....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolamento de neuroesferas a partir do cérebro do rato adulto

  1. Euthanize um rato adulto (cerca de 2 meses de idade) por uma overdose de isoflurano. Verifique que o rato parou de respirar e dissecar imediatamente após a morte.
  2. Com uma tesoura, faça uma incisão na linha média para abrir o crânio. Remover o cérebro.
  3. Coloque o cérebro em PBS frio num prato de 10 centímetros em gelo. Siga todo-mount o método de dissecação para obter o SVZ do ventrículo lateral 48.
  4. Coloque o ventrículo lateral para um tubo de 1,5 mL, adicionar 500 mL de 0,05% de tripsina-EDTA em PBS, e incubar o tubo durante 15 minutos a 37....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Depois de plaqueamento das células a partir do SVZ em meio NSC durante uma semana, neuroesferas flutuantes foram observados (Figura 2A). Os tamanhos das esferas variou entre 50 e 200 um. Para examinar se as esferas foram derivados a partir de células estaminais / progenitoras neurais, as neuroesferas foram plaqueadas em lamelas e PLL- em meio NSC Laminina-revestido durante 2 dias. Eles foram então imunocoradas em relação ao marcador / células progenitoras estaminais neur.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um método para gerar e manter culturas de neuroesferas de SVZ adulto mouse. Alguns pontos pertinentes sobre as culturas são as seguintes. Em primeiro lugar, as dimensões das esferas estão tipicamente entre 50-200? M. Em nossa experiência, quando um neurosphere fica maior do que 300 mm de diâmetro, o tempo ideal para passaging foi perdida. Estas esferas maiores contêm células mortas no núcleo. Em segundo lugar, como neuroesferas são comumente usados ​​para estudar as células estaminais / progenitoras ne.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O trabalho no laboratório de S.M. é financiado por bolsas de recrutamento do CPRIT (R1220) e do NIH (1R01GM113023-01).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tampa de vidro redonda de 12 mmFisherbrand12-545-80 
Placa de 24 poçosFalcon353047
paraformaldeído a 4% (PFA)Affymetrix19943
Tubo de 50 mLPlaca deFalcon 352098
95 mm x 15 mm, tampa deslizávelFisherbrandFB0875714Gprato de 10 cm
70 µ filtro de células mFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 anticorpo secundário
Arl13B, Clone N295B / 66NeuromabAB_11000053
B-27 Suplemento (50X), sem soroThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeFrasco40R
Corning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovinoSigmaD5025-15KUDnase I
Dimetilsulfóxido SigmaD8418-100MLDMSO
Moldes de Espécime de Vinil DescartávelSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modificado, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de célulasSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 FórcepsFerramentas de ciência fina11254-20
Soro Fetal Bovino (FBS)SigmaF9026-500ML
SoluçãoFluoromount-GSouthern Biotech0100-01solução de montagem
GFAPDAKOZ0334
Cabra anti camundongo IgG1 Anticorpo secundário, Alexa Fluor 555 conjugadoThermoFisher ScientificA-21127Cabra anti camundongo IgG1, Alexa 555 anticorpo secundário
Cabra anti camundongo IgG2a Anticorpo secundário, Alexa Fluor 555 conjugadoThermoFisher ScientificA-21137Cabra anti camundongo IgG2a, Alexa 555 anticorpo secundário
Gpr161caseiroN/A
humano bFGFSigmaF0291FGF
hemocitômetroHausser Scientific0,100 mm de profundidademelhorado neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorano
Laminina da membrana basal do sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm SigmaL2020Laminina
L-Glutamina (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Reagente de TransfecçãoThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
Suplemento N-2 (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Meio neurobasalGibco21103-049
Soro de burro normalJackson ImmunoResearch017-000-121
Composto de outubroSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicilina-estreptomicinaSigmaP4333-100ML
de Poli-L-lisina (PLL)SigmaP4707
,sistemas CF R e D236-EG-200EGF
TesouraFerramentas de ciência fina14060-10
Superfrost mais lâmina de microscópioFisher scientific12-550-15slides
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Solução de tripsina-EDTA (10X)SigmaT4174-100Tripsina
COSTAR Placa de 6 poços, com tampa Fundo plano Ultra-baixa Superfície de fixação Poliestireno, EstérilCorning3471placa de 6 poços de ligação ultrabaixa
β-tubulina IIICovanceMMS-435PTUJ1
Petri criogênico científico Thermo ST Proteína EGF humana recombinante

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

C lulas tronco neuraiscultura de neuroesferasbiog nese ciliartr fego ciliarimunomarca omarcador ARL13Blocaliza o de GPR161disseca o da zona subventricularmicroscopia confocal

Artigos relacionados