Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia

O cílio primário é um compartimento subcelular dinâmico baseado em microtúbulos que funciona como uma antena sensorial na coordenação de vias de sinalização celular, incluindo a via de Hedgehog Sonic (Shh), durante o desenvolvimento neuronal embrionário ^{1, 2,} e sinalização subcelular compartimentada em adulto função neuronal ^{3, 4} . Sinalização componentes destas vias, tais como o receptor de Shh Patched ^5; o activador via de Smoothened (Smo) ^6; e Gpr161 ^7, um receptor órfão de Proteína G-acoplada (GPCR) que regula negativamente a via de Shh, localizar aos cílios de uma forma dinâmica. Várias GPCRs têm sido relatados para localizar aos cílios em neurónios no cérebro ^{7, 8, 9, 10} sup>, ^{11, 12, 13, 14, 15, 16.} Defeitos no cílios e vias de sinalização gerada-cílios afectar vários tecidos e são conhecidos colectivamente como ciliopathies ^{17, 18, 19.} O espectro da doença ciliopathy inclui frequentemente defeitos do neurodesenvolvimento, tais como anomalias craniofaciais ^{20, 21, 22.} Além disso, cílios em neurónios hipotalâmicos regulam vias centrais de saciedade, e defeitos resultam em obesidade central ^23, o espelhamento da obesidade em ciliopathies sindrómicas tais como síndrome de Bardet Biedel ^24. Além disso, o receptor neuropéptido de sinalização em cílios regula central saciedade vias ^{11, 14.} Localização ciliar de adenililciclase III (ACIII) e os GPCRs, tais como o receptor de somatostatina 3 em neurónios do hipocampo resultar em defeitos de reconhecimento de objecto novos e défices de memória ^{25, 26} e paralelo a falta de integridade ciliar ^27. Os aspectos do desenvolvimento da sinalização gerada-cílios estão intimamente ligados a homeostase do tecido; em particular, os cílios são importantes para a progressão de meduloblastomas Shh para o subtipo que derivam de progenitores granulares do cerebelo em ^{28, 29.} Assim, cílios desempenham papéis importantes durante embrionário, pós-natal, e desenvolvimento neuronal adulto e função.

As células estaminais neurais (NSCs) residem na zona subventricular (SVZ) do ventrículo lateral, na zona subgranular do giro dentado do hipocampo, e azona ventricular do terceiro ventrículo no hipotálamo em mamíferos ^{30, 31, 32.} NSCs são multipotentes, possuem a capacidade de auto-renovação, e são importantes para o desenvolvimento do cérebro e da medicina regenerativa ^30. A maioria dos NSC no SVZ são quiescentes e possuem um cílio primário solitário que, em muitos casos, se estende para fora para o ventrículo lateral ^33. Os sinais cílio primários através da localização de vários receptores, a indução de respostas celulares a jusante, particularmente em relação a Shh, TGFp, e receptor de tirosina-quinase vias ^{2, 34, 35, 36.} Uma vez que os cílios se estender para o ventrículo lateral,-se a hipótese de que cílios detectar citoquinas no fluido cerebrospinal (CSF) para activar as NSC ^{37 38, 39, 40, 41.} No entanto, os mecanismos através dos quais comunica com CSF NSC e se cílios estão envolvidos não são conhecidos. NSC aderentes em cultura são ciliado; localizar os componentes da via, tais como Shh, Smo e Gpr161 em cílios; e são Shh responsivo ^42. Assim, NSC pode servir como um importante sistema modelo para o estudo da via de Shh, tráfico ciliar, e vias de diferenciação neuronal. Além disso, a partir de neurónios diferenciados NSC também podem ser utilizadas para ensaios de tráfico ciliar.

As neuroesferas são constituídos por aglomerados de células flutuantes resultantes da proliferação de neural células estaminais / progenitoras que crescem na presença de factores de crescimento específicos e superfícies não adesivos ^{43, 44.} As neuroesferas servir como importante em modelos de cultura in vitro para estudar as células estaminais / progenitoras neurais em desenvolvimento normal e doença ^{31, 45, 46, 47.} Aqui, descrevemos um ensaio baseado em neuroesfera para a cultura de células estaminais / progenitoras neuronais e para a diferenciação em neurónios / glia. Nós particularmente enfatizar o tráfico de sinalização componentes aos cílios de estaminal neuronal / células progenitoras e neurónios diferenciados (Figura 1). Em oposição a cultura de neurónios primários, neuroesferas primárias são relativamente fáceis de cultura, são passíveis de várias passagens e congelamento-descongelamento ciclos, e pode ser submetida a diferenciação em neurónios / glia. Importante, determinou-se que neural derivada-neuroesferaas células estaminais / progenitoras e neurónios diferenciados são ciliadas em cultura e localizar moléculas de sinalização importantes para a função ciliar nestes compartimentos. métodos de cultivo baseadas em Neurosphere pode servir como um sistema modelo ideal para estudar ciliogênese e ciliar tráfico de NSC e neurônios diferenciados.

1. Isolamento de neuroesferas a partir do cérebro do rato adulto

1. Euthanize um rato adulto (cerca de 2 meses de idade) por uma overdose de isoflurano. Verifique que o rato parou de respirar e dissecar imediatamente após a morte.
2. Com uma tesoura, faça uma incisão na linha média para abrir o crânio. Remover o cérebro.
3. Coloque o cérebro em PBS frio num prato de 10 centímetros em gelo. Siga todo-mount o método de dissecação para obter o SVZ do ventrículo lateral ^48.
4. Coloque o ventrículo lateral para um tubo de 1,5 mL, adicionar 500 mL de 0,05% de tripsina-EDTA em PBS, e incubar o tubo durante 15 minutos a 37 ° C em um banho de água.
5. Após 15 min, adicionar 500 mL de meio de parar e suavemente pipetar 20 - 30 vezes com um ml de uma ponta. Evitar a formação de bolhas de ar durante a pipetagem.
   NOTA: Este passo é fundamental para a sobrevivência da célula.
6. Girar as células a 500 xg durante 8 minutos. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 1 ml de PBS, e ressuspender tele células pipetando suavemente 5x com uma ponta de 1 mL.
7. Girar a 500 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante utilizando uma ponta 1 mL e adicionar 1 ml de meio basal.
8. (Opcional) Se os restos celulares são observados, passar as células através de um coador de células-70? M.
9. Contar o número de células com um hemocitómetro; em geral, cerca de 30.000 - são obtidos 60.000 células / SVZ.
10. Placa as células a partir de uma SVZ num prato de 10 cm, com 10 mL de NSC meio e cultura a 37 ° C com 5% de CO _2.
11. (Opcional) Para evitar a fusão entre as esferas ^49, colocar 1.000 células num único poço de uma placa de ligação de ultra-low-6 poços que é previamente enchido com 1,5 mL de NSC meio e cultura a 37 ° C com 5% de CO _2.
    NOTA: Depois de 5-7 dias, neuroesferas pode ser observado (Figura 2A). O perdo de cultivo pode variar com a idade de rato ou o fundo genético.
12. Adicionar 2 mL de meio de NSC cada 3-4 dias para manter a cultura(Não remova o meio existente).

2. Análise da capacidade de diferenciação de testes neurospheres e ciliogênese

1. Para analisar a capacidade de diferenciação, analisar as neuroesferas sob condições aderentes em meio de diferenciação.
2. Esterilizar 12 mm lamelas redondos por autoclavagem ou com exposição a UV, antes da utilização. Para uma cultura de células aderentes, colocar uma tampa 12 milímetros de vidro redondo esterilizadas em um poço de uma placa de 24 poços sob condições assépticas.
3. Revestir a tampa de vidro durante 10 segundos com 500 mL de 0,002% de poli-L-lisina (PLL). Aspirar a solução e secá-la durante 10-15 min.
4. Adicionar 500 uL de solução de laminina (5 ug / mL). Incubar a tampa de vidro, durante 1 h a 37 ° C.
5. Aspirar a laminina e adicionar 500 mL de meio de diferenciação ou meio de NSC (controlo indiferenciado).
6. Para o ensaio de diferenciação, escolher-se um de 100 - 200? M esfera com uma ponta de 200 mL sob o microscópio. Adicionar5-10 neuroesferas para cada poço de uma placa de 24 poços e cultura durante 7-10 dias em meio de diferenciao.
7. Para analisar neuroesferas indiferenciadas, adicionar 5-10 neuroesferas a cada poço de uma placa de 24 poços e a cultura durante 1-2 dias em meio NSC. Neuroesferas ligados espalhar e crescer como uma monocamada (Figura 2B).
8. Depois de retirar cuidadosamente a forma, fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS durante 15 min à temperatura ambiente, e, em seguida, lava-se com PBS duas vezes durante 5 min à TA. A placa pode ser armazenada a 4 ° C durante 1-2 meses.
   NOTA: Para visualizar as células estaminais / progenitoras neurais em meio NSC e células diferenciadas em meio de diferenciação, realizar imunocoloração contra nestina (estaminal neuronal / marcador de células progenitoras), β-tubulina III (monoclonal TUJ1, marcador neuronal), GFAP (proteína glial fibrilar ácida , marcador de astrócitos), e O4 (marcador de oligodendrócitos) (Figura 2B-e). Para analisar os cílios, realizar imunocoloração contra Arl13b (ci primárialia marker) e Gpr161 (GPCR ciliar) (Figura 3).
9. Montar o vidro de cobertura com uma solução a montagem em uma lâmina de vidro. Inclinar a lâmina de vidro para remover o excesso de solução.

3. Análise da ciliogênese em neuroesferas

1. Para analisar as células em neuroesferas intactas por imunocoloração, transferência 1 mL de meio de cultura contendo múltiplos neuroesferas para um tubo de 1,5 ml e girar a 500 xg durante 8 minutos. Fixar as esferas com 4% (PFA) após a remoção do meio durante 15 minutos e lavar com PBS. Girar as esferas a 500 xg durante 8 minutos, remover o sobrenadante, e incuba-se as esferas de O / N com 30% de sacarose a 4 ° C.
2. Descartar o sobrenadante utilizando uma ponta 1 ml e adicionar 500 uL de solução de outubro utilizando uma ponta de corte de 1 mL. Cortar a extremidade da ponta para alargar a abertura, como OCT é viscosa.
3. Transferir a solução de outubro contendo as neuroesferas num molde de plástico descartável de congelação (10 mm x 10 mm x 5 mm).
4. Congelar a midade em gelo seco durante pelo menos 15 min.
5. (Opcional) Parar a experiência e armazenar o molde num congelador de -80 ° C durante até 1 ano.
6. Corte as secções com um criostato; a espessura das secções deve ser de 15-30 | im.
7. Para visualizar o cílios num neuroesfera, realizar imunocoloração contra Arl13b (Figura 4).

4. Cultura e Passagem de neuroesferas e NSC aderentes

1. Passagem as neuroesferas enquanto o tamanho da esfera situa-se entre 100-200? M; quando as neuroesferas são muito grandes (300 mm ou acima), eles não são ideais para experimentos.
2. Transferir as neuroesferas num tubo de 50 mL utilizando uma ponta 1 mL e girar a 500 xg durante 8 minutos.
3. Descartar o sobrenadante utilizando um aspirador, adicionar 500 mL de 0,05% de tripsina-EDTA em PBS, e incubar durante 5 min a 37 ° C. A quantidade de tripsina varia dependendo do número de esferas.
4. Adicionar 500 uL de meio com soro e suavemente tubot 20 vezes com um ml de uma ponta.
5. Girar a 500 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante utilizando uma ponta 1 mL e adicionar 1 ml de meio basal.
6. (Opcional) Se os restos celulares ou sem dissociar neuroesferas são vistas, passar as células através de um coador de células-70? M.
7. Passagem as células em um prato de 10 centímetros a uma densidade de 10.000 células / ^cm2 em meio de NSC; as células estará pronto para a próxima passagem depois de uma semana.
8. (Opcional) Para congelar as células, adicionar meio de congelação para gerar 500.000 a 1.000.000 de células / mL de suspensão. Congelar as células utilizando recipientes de congelamento de crio; neurospheres sem dissociar também pode ser congelado.
9. Para a cultura aderente, dillute as células a 50.000 células / ^cm2 em PLL- e lamelas com meio de cultura e NSC, Laminina-revestidos durante 1-2 dias.

5. A fome e Análise de Cilia

1. Prepare meio de privação (Tabela 1).
2. 1-2 dias após o pl inicialating de células aderentes após dissociação, mudança para meio NSC em um poço (controlo) e em meio de privação outro poço (experimento).
3. Cultura das células aderentes para 24 h.
4. Fixar as células com PFA a 4% em PBS durante 15 min à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente.
5. (Opcional) Parar a experiência e armazenar as placas de 24 cavidades com lamelas em PBS a 4 ° C durante 1-2 meses.
6. Executar um protocolo para a coloração de imunofluorescência ^{7, 50.}
7. Montar as lamelas utilizando solução de montagem. Seca-se a lâmina de vidro O / N à temperatura ambiente no escuro.
8. Adquirir imagens de um microscópio composto na ampliação necessário. Usar um microscópio, uma câmara e objectivos (40X / 1,3 óleo e 63X / 1,4 óleo), controlada usando o software acompanhada. Tome-z secções suficientes no 0,5-0,8? M intervalos (Figura 5).
9. Para a análise quantitativa de localização em ciliarcélulas aderentes, pilhas de adquirir imagens de 3-8 campos consecutivos com células confluentes por olhando para dentro do canal DAPI. Quantificar o número de cílios utilizando o ImageJ / Fiji. Normalmente, use o "Contador de células" ferramenta no ImageJ Plugins> caixa de diálogo para contar as células com cílios GPCR positivo Analisar; projecções máximas de pilhas de imagens também podem ser exportadas a partir de ImageJ / Fiji.Use semelhante intensidade da imagem e parâmetros de contraste para todas as imagens da mesma experiência para fins de exportação e contagem.

6. Transfecção de neuroesferas

1. Aderem dissociado células para lamelas durante 24 h. Usar uma densidade celular tipicamente entre 75.000 e 150.000 células em meio de 500 mL de NSC num único poço de uma placa de 24 poços.
2. Misturar 25? L de meio de soro reduzido e 1,5 mL de reagente de transfecção em um mL microtubo de 0,5 em vortex durante 5 segundos.
3. Adicionar 2,5 ug de ADN de plasmídeo isento de endotoxina a um 0,5 mL microtub separadoe contendo 25 uL de meio de soro reduzido e misturar em vortex durante 5 segundos.
4. Adicionar 1 mL de reagente de transfecção para o segundo ADN microtubo contendo e misturar em vortex durante 5 segundos.
5. Adicionar a mistura a partir do tubo que contém ADN para o primeiro microtubo e misturar por pipetagem.
6. Incubar a mistura durante 10-15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicionar gota a gota cuidadosamente a mistura de transfecção às cavidades no topo do meio de NSC (500 / po).
7. Mudar a forma 24 h pós-transfecção para controlar o meio (meio NSC) ou meio de fome (500 / po).
8. Fixar as células, alterando a forma de PFA a 4% após 24 h e executar imunocoloração; tipicamente, até uma eficiência de transfecção de 10% é obtido usando este protocolo.

Depois de plaqueamento das células a partir do SVZ em meio NSC durante uma semana, neuroesferas flutuantes foram observados (Figura 2A). Os tamanhos das esferas variou entre 50 e 200 um. Para examinar se as esferas foram derivados a partir de células estaminais / progenitoras neurais, as neuroesferas foram plaqueadas em lamelas e PLL- em meio NSC Laminina-revestido durante 2 dias. Eles foram então imunocoradas em relação ao marcador / células progenitoras estaminais neurais, nestina. Foram necessários dois dias para permitir que as esferas para anexar as lamelas e crescer como uma monocamada de células. A monocamada de células foi positiva para a nestina (Figura 2B). Para examinar a capacidade de diferenciação das neuroesferas, que chapeada deles seguindo os passos delineados na secção 2 para PLL- e lamelas em meio de diferenciação Laminina-revestido sem dissociação durante 7-10 dias. É preciso pelo menos uma semana para a diferenciação. Os neurospheres ligado às lamelas e expandirEd a crescer como uma monocamada de células. Fixamos as células e histoquímica contra neurônio, astrócitos e oligodendrócitos marcadores. Observamos neuroesferas aderentes que se diferenciaram em neurónios β-tubulina III-positivas, astritos GFAP-positivos, e oligodendrócitos O4-positivas (figura 2C-E). Assim, neuroesferas multipotentes podem ser derivados de SVZ adulto rato.

Para determinar se neuroesferas aderentes e neurónios diferenciados têm cílios, que imunocoradas contra Arl13b (marcador cílio primária) e 51 Gpr161 (GPCR localizada-ciliar) 7. Na nossa experiência, em modelos de rato disponíveis que expressam ARL13B-mCherry, e em estudos com o desenvolvimento de córtex de rato, a maior parte (se não todos) os cílios neuronal no cérebro expressar Arl13b, enquanto que todos os neurónios não são ACIII-positivo 52, 53, 54. quis, que se baseiam principalmente na Arl13b para detectar cílios neuronal. Detectamos cílios e a localização de Gpr161 aos cílios de células progenitoras em neuroesferas aderido (Figura 3a) e em neurónios diferenciados (Figura 3B). Assim, neuroesferas aderentes e linhagens diferenciadas são ciliadas em cultura e localizar moléculas sinalizadoras.

Para determinar se neuroesferas flutuantes têm cílios, que criosseccionada neuroesferas flutuante após a fixação, como descrito na secção 3. Observou-se cílios em células estaminais / progenitoras neurais nas neuroesferas seccionados (Figura 4A-B). É importante para adquirir Z-seções através dos neurospheres para visualizar totalmente cílios, porque é difícil para examinar os cílios primária em um único plano z. Em resumo, as neuroesferas indiferenciadas têm populações heterogéneas de células ciliadas e não ciliadas.

(Figura 5A-B). Além disso, observou-se um aumento do número de cílios Gpr161-positivo sobre a fome (% cílios Gpr161-positivo / cílios Arl13b-positivo) (Figura 5A-B). Curiosamente, um estudo anterior, utilizando linhas de células estaminais embrionárias humanas indiferenciadas demonstrado que as células estaminais embrionárias humanas em cultura também possuem cílios 55. O número e comprimento de aumento cílios sobre privação de soro nestas linhas celulares, e estas cílios também possuem componentes da maquinaria de Shh.

Nós também transfectadas aderentes neural tronco / progenitor células, como descrito na secção 6. Normalmente, detectada uma eficiência de transfecção de até 10%, semelhante ao primárias de neurónios culturas no laboratório (Figura 6).

Tabela 1: Receita de Soluções.

Figura 2: As neuroesferas exposições Diferenciação Capacidade. (A) neuroesferas representativos são mostrados. (B) As neuroesferas foram plaqueadas em lamelas e PLL- Laminina-revestidas em meio NSC durante 2 dias e foram imunocoradas contra nestina (marcador de células estaminais / progenitoras neurais). (CE) As neuroesferas foram plaqueadas seguindo as etapas descritas na secção 2 para PLL- e lamelas em meio de diferenciação Laminina-revestido durante 7 dias without dissociação; fixo; e imunocoradas contra β-tubulina III (marcador neuronal), GFAP (marcador de astrócitos), e O4 (marcador de oligodendrócitos). Os núcleos foram coradas por DAPI. Barra de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: As neuroesferas e neurónios em Aderente Diferenciadas As neuroesferas são ciliado. (A) não dissociado neuroesferas foram plaqueadas em lamelas revestidas em meio NSC de 2 d; fixo; e imunocoradas contra Gpr161 (verde), Arl13b (vermelho), e ADN (azul). (B) neurónios diferenciados foram imunocoradas contra Gpr161 (verde), Arl13b (vermelho, A) ou β-tubulina III (vermelho, B), e ADN (azul). setas brancas indicam Gpr161 localização em cílios.Os painéis à direita em (A) são vistas ampliadas do cílio primário indicado pela seta branca. O cílio Gpr161-positiva no neurónio branco-box é mostrada no lado direito em (B). Escala = 10 um (A); 50 um (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: flutuação, indiferenciado neuroesferas Possuir células ciliadas. neuroesferas flutuantes foram fixados, embebidos em OCT, criosseccionada, e processado por imunofluorescência contra Arl13b (vermelho) e de ADN. cílios Arl13b-positiva num neuroesfera são mostrados. O painel em (A) é uma projecção de intensidade máxima de 14 z-secções em intervalos de 0,8? M a partir de uma neuroesfera. Os painéis em (b) mostra a vista ampliada de ccélulas iliated na região branco-box em (A). A imagem de projecção máxima de todos os z secções é mostrado como uma pilha, enquanto que os números de 1 a 14 indicam-z secções individuais. As setas brancas indicam cílios. Escala da barra = 50 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A inanição Induz ciliogênese em Caule Dissociated Aderente Neural / células progenitoras. As células dissociadas (A) foram plaqueadas em lamelas de cobertura revestidas em NSC, ou em meio de fome durante 24 h; fixo; e imunocoradas contra Gpr161 (verde), Arl13b (vermelho), e ADN (azul). cílios Gpr161-positivo são observados em células em jejum (direita) de controlo (esquerda) e. Os pains inferiores s vistas ampliadas das caixas brancas indicado na respectivapainéis superiores. As setas brancas e pontas de seta indicam cílios Gpr161 positivos e negativos, respectivamente. Barra de escala = 100 pm. (B) Quantificao de culas positivas Arl13b-ciliadas (gráfico da esquerda) e Gpr161 localizar no cílios Arl13b-positivo (direito do gráfico) no controle e células esfomeados. As percentagens de ambas as células ciliadas Arl13b-positivos e Gpr161 localizar no cílios Arl13b-positivo aumentado por inanição. A quantificação foi realizada a partir de dois campos de visão a partir de cada duas repetições técnicos de uma única experiência. Os dados são representados como a média de todos os campos de visão 4 ± o desvio padrão. *, P <0,05; **, P <0,01. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: A transfecção emCaule dissociado Aderente Neural / células progenitoras. As células dissociadas plaqueadas em lamelas revestidas foram transfectadas com um LAP-TULP3 N-terminal (aa 1-183) mut12 construção que não se liga ao núcleo IFT-se um complexo 56. O meio foi mudado para meio de privação 24 h pós-transfecção. As células foram fixadas após 24 h e imunocoradas contra GFP (verde), Gpr161 (vermelho), Arl13b (magenta) e de ADN (azul). Uma célula transfectada com e Gpr161- Arl13b-positivo cílio é marcado por uma seta branca, ao passo que uma célula transfectada sem cílios é mostrado com uma seta branca. As setas amarelas e pontas de seta apontam para células não transfectadas, com ou sem Gpr161 / Arl13b, respectivamente. Escala da barra = 10 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.