Name: Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a utilizar culturas de neuroesferas primárias para estudar a biogênese e o tráfego de cílios primários em células-tronco neurais. Este método demonstra dissecação do ventrículo lateral e quantificação de cílios.

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O trabalho no laboratório de S.M. é financiado por bolsas de recrutamento do CPRIT (R1220) e do NIH (1R01GM113023-01).

1. Isolamento de neuroesferas a partir do cérebro do rato adulto <ol><li> Euthanize um rato adulto (cerca de 2 meses de idade) por uma overdose de isoflurano. Verifique que o rato parou de respirar e dissecar imediatamente após a morte. </li><li> Com uma tesoura, faça uma incisão na linha média para abrir o crânio. Remover o cérebro. </li><li> Coloque o cérebro em PBS frio num prato de 10 centímetros em gelo. Siga todo-mount o método de dissecação para obter o SVZ do ventrículo lateral 48. </li><li> Coloque o ventrículo lateral para um tubo de 1,5 mL, adicionar 500 mL de 0,05% de tripsina-EDTA em PBS, e incubar o tubo durante 15 minutos a 37 ° C em um banho de água. </li><li> Após 15 min, adicionar 500 mL de meio de parar e suavemente pipetar 20 - 30 vezes com um ml de uma ponta. Evitar a formação de bolhas de ar durante a pipetagem. NOTA: Este passo é fundamental para a sobrevivência da célula. </li><li> Girar as células a 500 xg durante 8 minutos. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 1 ml de PBS, e ressuspender tele células pipetando suavemente 5x com uma ponta de 1 mL. </li><li> Girar a 500 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante utilizando uma ponta 1 mL e adicionar 1 ml de meio basal. </li><li> (Opcional) Se os restos celulares são observados, passar as células através de um coador de células-70? M. </li><li> Contar o número de células com um hemocitómetro; em geral, cerca de 30.000 - são obtidos 60.000 células / SVZ. </li><li> Placa as células a partir de uma SVZ num prato de 10 cm, com 10 mL de NSC meio e cultura a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> (Opcional) Para evitar a fusão entre as esferas 49, colocar 1.000 células num único poço de uma placa de ligação de ultra-low-6 poços que é previamente enchido com 1,5 mL de NSC meio e cultura a 37 ° C com 5% de CO 2. NOTA: Depois de 5-7 dias, neuroesferas pode ser observado (Figura 2A). O perdo de cultivo pode variar com a idade de rato ou o fundo genético. </li><li> Adicionar 2 mL de meio de NSC cada 3-4 dias para manter a cultura(Não remova o meio existente). </li></ol> 2. Análise da capacidade de diferenciação de testes neurospheres e ciliogênese <ol><li> Para analisar a capacidade de diferenciação, analisar as neuroesferas sob condições aderentes em meio de diferenciação. </li><li> Esterilizar 12 mm lamelas redondos por autoclavagem ou com exposição a UV, antes da utilização. Para uma cultura de células aderentes, colocar uma tampa 12 milímetros de vidro redondo esterilizadas em um poço de uma placa de 24 poços sob condições assépticas. </li><li> Revestir a tampa de vidro durante 10 segundos com 500 mL de 0,002% de poli-L-lisina (PLL). Aspirar a solução e secá-la durante 10-15 min. </li><li> Adicionar 500 uL de solução de laminina (5 ug / mL). Incubar a tampa de vidro, durante 1 h a 37 ° C. </li><li> Aspirar a laminina e adicionar 500 mL de meio de diferenciação ou meio de NSC (controlo indiferenciado). </li><li> Para o ensaio de diferenciação, escolher-se um de 100 - 200? M esfera com uma ponta de 200 mL sob o microscópio. Adicionar5-10 neuroesferas para cada poço de uma placa de 24 poços e cultura durante 7-10 dias em meio de diferenciao. </li><li> Para analisar neuroesferas indiferenciadas, adicionar 5-10 neuroesferas a cada poço de uma placa de 24 poços e a cultura durante 1-2 dias em meio NSC. Neuroesferas ligados espalhar e crescer como uma monocamada (Figura 2B). </li><li> Depois de retirar cuidadosamente a forma, fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS durante 15 min à temperatura ambiente, e, em seguida, lava-se com PBS duas vezes durante 5 min à TA. A placa pode ser armazenada a 4 ° C durante 1-2 meses. NOTA: Para visualizar as células estaminais / progenitoras neurais em meio NSC e células diferenciadas em meio de diferenciação, realizar imunocoloração contra nestina (estaminal neuronal / marcador de células progenitoras), β-tubulina III (monoclonal TUJ1, marcador neuronal), GFAP (proteína glial fibrilar ácida , marcador de astrócitos), e O4 (marcador de oligodendrócitos) (Figura 2B-e). Para analisar os cílios, realizar imunocoloração contra Arl13b (ci primárialia marker) e Gpr161 (GPCR ciliar) (Figura 3). </li><li> Montar o vidro de cobertura com uma solução a montagem em uma lâmina de vidro. Inclinar a lâmina de vidro para remover o excesso de solução. </li></ol> 3. Análise da ciliogênese em neuroesferas <ol><li> Para analisar as células em neuroesferas intactas por imunocoloração, transferência 1 mL de meio de cultura contendo múltiplos neuroesferas para um tubo de 1,5 ml e girar a 500 xg durante 8 minutos. Fixar as esferas com 4% (PFA) após a remoção do meio durante 15 minutos e lavar com PBS. Girar as esferas a 500 xg durante 8 minutos, remover o sobrenadante, e incuba-se as esferas de O / N com 30% de sacarose a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante utilizando uma ponta 1 ml e adicionar 500 uL de solução de outubro utilizando uma ponta de corte de 1 mL. Cortar a extremidade da ponta para alargar a abertura, como OCT é viscosa. </li><li> Transferir a solução de outubro contendo as neuroesferas num molde de plástico descartável de congelação (10 mm x 10 mm x 5 mm). </li><li> Congelar a midade em gelo seco durante pelo menos 15 min. </li><li> (Opcional) Parar a experiência e armazenar o molde num congelador de -80 ° C durante até 1 ano. </li><li> Corte as secções com um criostato; a espessura das secções deve ser de 15-30 | im. </li><li> Para visualizar o cílios num neuroesfera, realizar imunocoloração contra Arl13b (Figura 4). </li></ol> 4. Cultura e Passagem de neuroesferas e NSC aderentes <ol><li> Passagem as neuroesferas enquanto o tamanho da esfera situa-se entre 100-200? M; quando as neuroesferas são muito grandes (300 mm ou acima), eles não são ideais para experimentos. </li><li> Transferir as neuroesferas num tubo de 50 mL utilizando uma ponta 1 mL e girar a 500 xg durante 8 minutos. </li><li> Descartar o sobrenadante utilizando um aspirador, adicionar 500 mL de 0,05% de tripsina-EDTA em PBS, e incubar durante 5 min a 37 ° C. A quantidade de tripsina varia dependendo do número de esferas. </li><li> Adicionar 500 uL de meio com soro e suavemente tubot 20 vezes com um ml de uma ponta. </li><li> Girar a 500 xg durante 8 minutos. Descartar o sobrenadante utilizando uma ponta 1 mL e adicionar 1 ml de meio basal. </li><li> (Opcional) Se os restos celulares ou sem dissociar neuroesferas são vistas, passar as células através de um coador de células-70? M. </li><li> Passagem as células em um prato de 10 centímetros a uma densidade de 10.000 células / cm2 em meio de NSC; as células estará pronto para a próxima passagem depois de uma semana. </li><li> (Opcional) Para congelar as células, adicionar meio de congelação para gerar 500.000 a 1.000.000 de células / mL de suspensão. Congelar as células utilizando recipientes de congelamento de crio; neurospheres sem dissociar também pode ser congelado. </li><li> Para a cultura aderente, dillute as células a 50.000 células / cm2 em PLL- e lamelas com meio de cultura e NSC, Laminina-revestidos durante 1-2 dias. </li></ol> 5. A fome e Análise de Cilia <ol><li> Prepare meio de privação (Tabela 1). </li><li> 1-2 dias após o pl inicialating de células aderentes após dissociação, mudança para meio NSC em um poço (controlo) e em meio de privação outro poço (experimento). </li><li> Cultura das células aderentes para 24 h. </li><li> Fixar as células com PFA a 4% em PBS durante 15 min à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com PBS durante 5 minutos cada à temperatura ambiente. </li><li> (Opcional) Parar a experiência e armazenar as placas de 24 cavidades com lamelas em PBS a 4 ° C durante 1-2 meses. </li><li> Executar um protocolo para a coloração de imunofluorescência 7, 50. </li><li> Montar as lamelas utilizando solução de montagem. Seca-se a lâmina de vidro O / N à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adquirir imagens de um microscópio composto na ampliação necessário. Usar um microscópio, uma câmara e objectivos (40X / 1,3 óleo e 63X / 1,4 óleo), controlada usando o software acompanhada. Tome-z secções suficientes no 0,5-0,8? M intervalos (Figura 5). </li><li> Para a análise quantitativa de localização em ciliarcélulas aderentes, pilhas de adquirir imagens de 3-8 campos consecutivos com células confluentes por olhando para dentro do canal DAPI. Quantificar o número de cílios utilizando o ImageJ / Fiji. Normalmente, use o &quot;Contador de células&quot; ferramenta no ImageJ Plugins&gt; caixa de diálogo para contar as células com cílios GPCR positivo Analisar; projecções máximas de pilhas de imagens também podem ser exportadas a partir de ImageJ / Fiji.Use semelhante intensidade da imagem e parâmetros de contraste para todas as imagens da mesma experiência para fins de exportação e contagem. </li></ol> 6. Transfecção de neuroesferas <ol><li> Aderem dissociado células para lamelas durante 24 h. Usar uma densidade celular tipicamente entre 75.000 e 150.000 células em meio de 500 mL de NSC num único poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Misturar 25? L de meio de soro reduzido e 1,5 mL de reagente de transfecção em um mL microtubo de 0,5 em vortex durante 5 segundos. </li><li> Adicionar 2,5 ug de ADN de plasmídeo isento de endotoxina a um 0,5 mL microtub separadoe contendo 25 uL de meio de soro reduzido e misturar em vortex durante 5 segundos. </li><li> Adicionar 1 mL de reagente de transfecção para o segundo ADN microtubo contendo e misturar em vortex durante 5 segundos. </li><li> Adicionar a mistura a partir do tubo que contém ADN para o primeiro microtubo e misturar por pipetagem. </li><li> Incubar a mistura durante 10-15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, adicionar gota a gota cuidadosamente a mistura de transfecção às cavidades no topo do meio de NSC (500 / po). </li><li> Mudar a forma 24 h pós-transfecção para controlar o meio (meio NSC) ou meio de fome (500 / po). </li><li> Fixar as células, alterando a forma de PFA a 4% após 24 h e executar imunocoloração; tipicamente, até uma eficiência de transfecção de 10% é obtido usando este protocolo. </li></ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Aqui, descrevemos um método para gerar e manter culturas de neuroesferas de SVZ adulto mouse. Alguns pontos pertinentes sobre as culturas são as seguintes. Em primeiro lugar, as dimensões das esferas estão tipicamente entre 50-200? M. Em nossa experiência, quando um neurosphere fica maior do que 300 mm de diâmetro, o tempo ideal para passaging foi perdida. Estas esferas maiores contêm células mortas no núcleo. Em segundo lugar, como neuroesferas são comumente usados ​​para estudar as células estaminais / progenitoras ne...

O cílio primário é um compartimento subcelular dinâmico baseado em microtúbulos que funciona como uma antena sensorial na coordenação de vias de sinalização celular, incluindo a via de Hedgehog Sonic (Shh), durante o desenvolvimento neuronal embrionário 1, 2, e sinalização subcelular compartimentada em adulto função neuronal 3, 4 . Sinalização componentes destas vias, tais como o receptor de Shh Patched 5; o activador via de Smoothened (Smo) 6; e Gpr161 7, um receptor órfão de Proteína G-acoplada (GPCR) que regula negativamente a via de Shh, localizar aos cílios de uma forma dinâmica. Várias GPCRs têm sido relatados para localizar aos cílios em neurónios no cérebro 7, 8, 9, 10 </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defeitos no cílios e vias de sinalização gerada-cílios afectar vários tecidos e são conhecidos colectivamente como ciliopathies 17, 18, 19. O espectro da doença ciliopathy inclui frequentemente defeitos do neurodesenvolvimento, tais como anomalias craniofaciais 20, 21, 22. Além disso, cílios em neurónios hipotalâmicos regulam vias centrais de saciedade, e defeitos resultam em obesidade central 23, o espelhamento da obesidade em ciliopathies sindrómicas tais como síndrome de Bardet Biedel 24. Além disso, o receptor neuropéptido de sinalização em cílios regula central saciedade vias 11, 14. Localização ciliar de adenililciclase III (ACIII) e os GPCRs, tais como o receptor de somatostatina 3 em neurónios do hipocampo resultar em defeitos de reconhecimento de objecto novos e défices de memória 25, 26 e paralelo a falta de integridade ciliar 27. Os aspectos do desenvolvimento da sinalização gerada-cílios estão intimamente ligados a homeostase do tecido; em particular, os cílios são importantes para a progressão de meduloblastomas Shh para o subtipo que derivam de progenitores granulares do cerebelo em 28, 29. Assim, cílios desempenham papéis importantes durante embrionário, pós-natal, e desenvolvimento neuronal adulto e função. As células estaminais neurais (NSCs) residem na zona subventricular (SVZ) do ventrículo lateral, na zona subgranular do giro dentado do hipocampo, e azona ventricular do terceiro ventrículo no hipotálamo em mamíferos 30, 31, 32. NSCs são multipotentes, possuem a capacidade de auto-renovação, e são importantes para o desenvolvimento do cérebro e da medicina regenerativa 30. A maioria dos NSC no SVZ são quiescentes e possuem um cílio primário solitário que, em muitos casos, se estende para fora para o ventrículo lateral 33. Os sinais cílio primários através da localização de vários receptores, a indução de respostas celulares a jusante, particularmente em relação a Shh, TGFp, e receptor de tirosina-quinase vias 2, 34, 35, 36. Uma vez que os cílios se estender para o ventrículo lateral,-se a hipótese de que cílios detectar citoquinas no fluido cerebrospinal (CSF) para activar as NSC 37 </s-se&gt;. Estudos recentes sugerem que a via de sinalização de Shh e cílios são críticos para a activação de células estaminais na reparação e regeneração de vários tecidos, incluindo o epitélio olfactivo, pulmão, rim e 38, 39, 40, 41. No entanto, os mecanismos através dos quais comunica com CSF NSC e se cílios estão envolvidos não são conhecidos. NSC aderentes em cultura são ciliado; localizar os componentes da via, tais como Shh, Smo e Gpr161 em cílios; e são Shh responsivo 42. Assim, NSC pode servir como um importante sistema modelo para o estudo da via de Shh, tráfico ciliar, e vias de diferenciação neuronal. Além disso, a partir de neurónios diferenciados NSC também podem ser utilizadas para ensaios de tráfico ciliar. As neuroesferas são constituídos por aglomerados de células flutuantes resultantes da proliferação de neural células estaminais / progenitoras que crescem na presença de factores de crescimento específicos e superfícies não adesivos 43, 44. As neuroesferas servir como importante em modelos de cultura in vitro para estudar as células estaminais / progenitoras neurais em desenvolvimento normal e doença 31, 45, 46, 47. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em neuroesfera para a cultura de células estaminais / progenitoras neuronais e para a diferenciação em neurónios / glia. Nós particularmente enfatizar o tráfico de sinalização componentes aos cílios de estaminal neuronal / células progenitoras e neurónios diferenciados (Figura 1). Em oposição a cultura de neurónios primários, neuroesferas primárias são relativamente fáceis de cultura, são passíveis de várias passagens e congelamento-descongelamento ciclos, e pode ser submetida a diferenciação em neurónios / glia. Importante, determinou-se que neural derivada-neuroesferaas células estaminais / progenitoras e neurónios diferenciados são ciliadas em cultura e localizar moléculas de sinalização importantes para a função ciliar nestes compartimentos. métodos de cultivo baseadas em Neurosphere pode servir como um sistema modelo ideal para estudar ciliogênese e ciliar tráfico de NSC e neurônios diferenciados.

<table><tbody><tr><td>Tampa de vidro redonda de 12 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído a 4% (PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>Placa de</td> Petri <td>Falcon 352098</td><td></td></tr><tr><td>95 mm x 15 mm, tampa deslizável</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>prato de 10 cm</td></tr><tr><td>70 &micro; filtro de células m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Arl13B, Clone N295B / 66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sem soro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>B27</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Frasco</td> criogênico científico Thermo ST <td>40R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Moldes de Espécime de Vinil Descartável</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 mm x 10 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modificado, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura de células</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 Fórceps</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução</td> <td>Fluoromount-GSouthern Biotech</td><td>0100-01</td><td>solução de montagem</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti camundongo IgG1 Anticorpo secundário, Alexa Fluor 555 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td><td>Cabra anti camundongo IgG1, Alexa 555 anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Cabra anti camundongo IgG2a Anticorpo secundário, Alexa Fluor 555 conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>Cabra anti camundongo IgG2a, Alexa 555 anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>caseiro</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>humano bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>FGF</td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>0,100 mm de profundidade</td><td>melhorado neubauer</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td>Isofluorano</td></tr><tr><td>Laminina da membrana basal do sarcoma Engelbreth-Holm-Swarm Sigma</td><td></td><td>L2020</td><td>Laminina</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Reagente de Transfecção</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-2 (100X)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Composto de outubro</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr> Proteína EGF humana recombinante <tr><td>de Poli-L-lisina (PLL)</td> <td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>,</td><td>sistemas CF R e D</td><td>236-EG-200</td><td>EGF</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost mais lâmina de microscópio</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-15</td><td>slides</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA (10X)</td> <td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>Tripsina</td></tr><tr><td>COSTAR Placa de 6 poços, com tampa Fundo plano Ultra-baixa Superfície de fixação Poliestireno, Estéril</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>placa de 6 poços de ligação ultrabaixa</td></tr><tr><td>&beta;-tubulina III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

usando culturas neurosphere primárias para o estudo primário cilia

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

O cílio primário é fundamentalmente importante para a proliferação de células-tronco neurais/progenitoras e para a diferenciação neuronal durante a vida embrionária, pós-natal e adulta. Além disso, a maioria dos neurônios diferenciados possui cílios primários que abrigam receptores de sinalização, como receptores acoplados à proteína G, e moléculas de sinalização, como adenilil ciclases. O cílio primário determina a atividade de múltiplas vias de desenvolvimento, incluindo a via do ouriço sônico durante o desenvolvimento neuronal embrionário, e também funciona na promoção da sinalização subcelular compartimentada durante a função neuronal adulta. Sem surpresa, defeitos na biogênese e função primária do cílio têm sido associados a anomalias de desenvolvimento do cérebro, obesidade central e déficits de aprendizagem e memória. Assim, é imperativo estudar a biogênese primária do cílio e o tráfego ciliar no contexto de células-tronco neurais/progenitoras e neurônios diferenciados. No entanto, os métodos de cultura para neurônios primários requerem experiência considerável e não são passíveis de ciclos de congelamento e descongelamento. Neste protocolo, discutimos métodos de cultura para populações mistas de células-tronco neurais/progenitoras usando neuroesferas primárias. Os métodos de cultura baseados em neuroesferas fornecem os benefícios combinados do estudo de células-tronco neurais primárias / progenitoras: receptividade a múltiplas passagens e ciclos de congelamento e descongelamento, potencial de diferenciação em neurônios / glia e transfectabilidade. É importante ressaltar que determinamos que as células-tronco / progenitoras neurais derivadas da neuroesfera e os neurônios diferenciados são ciliados em cultura e localizam moléculas de sinalização relevantes para a função ciliar nesses compartimentos. Utilizando essas culturas, descrevemos ainda métodos para estudar a ciliogênese e o tráfego ciliar em células-tronco neurais / progenitoras e neurônios diferenciados. Esses métodos baseados na neuroesfera nos permitem estudar as vias celulares reguladas pelos cílios, incluindo o receptor acoplado à proteína G e a sinalização sônica do ouriço, no contexto de células-tronco neurais / progenitoras e neurônios diferenciados.

Depois de plaqueamento das células a partir do SVZ em meio NSC durante uma semana, neuroesferas flutuantes foram observados (Figura 2A). Os tamanhos das esferas variou entre 50 e 200 um. Para examinar se as esferas foram derivados a partir de células estaminais / progenitoras neurais, as neuroesferas foram plaqueadas em lamelas e PLL- em meio NSC Laminina-revestido durante 2 dias. Eles foram então imunocoradas em relação ao marcador / células progenitoras estaminais neur...

O cílio primário é fundamentalmente importante na proliferação de células progenitoras neurais, a diferenciação neuronal, e função neuronal adulta. Aqui, descrevemos um método para estudar ciliogênese e o tráfico de proteínas de sinalização para os cílios em células estaminais / progenitoras neuronais e neurónios diferenciados utilizando culturas primárias de neuroesferas.

Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar métodos de cultivo baseados em neuroesferas para células-tronco e progenitoras neurais primárias, a fim de estudar a biogênese e o tráfego do cílio primário. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área dos cílios primários, como a biogênese dos cílios e o tráfego de moléculas para os cílios primários, em células-tronco neurais primárias, progenitores neurais e neurônios.A principal vantagem desta técnica é que podemos utilizar os critérios celulares primários das células-tronco neurais, progenitores neurais e neurônios para analisar a biogênese e as vias ciliares no contexto do cílio primário. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois o cultivo de células-tronco neurais é tecnicamente desafiador para iniciantes. Mostraremos que uma demonstração deste método é fundamental, já que a dissecação do ventrículo lateral e etapas como o cultivo de neuroesferas e a quantificação de cílios primários são facilmente aprendidas mediante a observação das etapas críticas.Inicie este procedimento com uma zona subventricular do ventrículo lateral dissecada de um camundongo adulto utilizando o método

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a produção simultânea de culturas de células precursoras neurais, quer como monocamadas aderentes ou neuroesferas, a partir da zona subventricular e giro dentado de ratinhos adultos individuais.

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

Aqui apresentamos um protocolo para a geração espontânea de neuroesferas enriquecidas em células progenitoras neurais de neurônios chapeados de alta densidade. Durante a mesma experiência, quando os neurônios são chapeados em uma densidade mais baixa, o protocolo igualmente conduz às culturas preliminares prolongadas do neurônio de rato.

Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley

Realizar experimentos in vitro para refletir as condições in vivo da forma mais adequada possível não é uma tarefa fácil. O uso de culturas celulares primárias é um passo importante para a compreensão da biologia celular em um organismo inteiro. O protocolo fornecido descreve como crescer com sucesso e cultura embrionária mouse neurônios cerebelares.

Cultura primária de neurônios isolados do cerebelo embrionário do rato

Cílios primários são estruturas extracelulares associadas ao centriole. A detecção primária de cílios por coloração imunofluorescente é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de altíssima qualidade. Neste protocolo, os fibroblastos que expressavam cílios primários foram fixados, imunossuídos e imagedos em um microscópio fluorescente ou confocal.

Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência

O uso de inteligência artificial (IA) para analisar imagens está emergindo como uma abordagem poderosa, menos tendenciosa e rápida em comparação com métodos comumente usados. Aqui treinamos a IA para reconhecer uma organela celular, cílios primários, e analisar propriedades como comprimento e intensidade de coloração de forma rigorosa e reprodutível.

Abordagens de Inteligência Artificial para avaliar cilia primária

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.

Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo

Aqui, descrevemos um sistema de nucleofecção projetado para aumentar a eficiência da entrega de genes em células-tronco neurais expandidas (NSCs) isoladas da zona subventricular murina adulta. Os resultados demonstram que este método melhora significativamente a perturbação gênica em NSCs, superando a eficácia dos protocolos tradicionais de transfecção e aumentando a taxa de sobrevivência celular.

Isolamento, expansão e nucleofecção de células-tronco neurais da zona subventricular murina adulta

Este método descreve a exploração do sinal endógeno em um modelo de camundongo transgênico ARL13B-CENTRIN-2 para obter imagens de cílios primários in situ, em três dimensões em grandes áreas de tecido mineralizado, desde a coleta de tecido até a análise da organização dos cílios. Este protocolo também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos.

Imagem volumétrica e análise de cílios primários em tecido musculoesquelético usando o modelo de camundongo ARL13B-CENTRIN-2

A cultura de gotículas verticais ex vivo é uma alternativa às técnicas experimentais atuais in vitro e in vivo. Este protocolo é fácil de executar e requer quantidades menores de reagente, ao mesmo tempo em que permite a capacidade de manipular e estudar a vascularização, morfogênese e organogênese fetal.

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Vertical Gota de toda fetais Órgãos para estudar processos de desenvolvimento durante Rato Organogenesis

Aprenda a utilizar culturas de neuroesferas primárias para estudar a biogênese e o tráfego de cílios primários em células-tronco neurais. Este método demonstra dissecação do ventrículo lateral e quantificação de cílios.

Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia

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