Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia
14 de abril de 2017
O cílio primário é fundamentalmente importante na proliferação de células progenitoras neurais, a diferenciação neuronal, e função neuronal adulta. Aqui, descrevemos um método para estudar ciliogênese e o tráfico de proteínas de sinalização para os cílios em células estaminais / progenitoras neuronais e neurónios diferenciados utilizando culturas primárias de neuroesferas.
O objetivo geral deste procedimento é utilizar métodos de cultura baseados em neuroesferas para células-tronco neurais primárias e progenitoras para estudar a biogênese e o tráfego primário de cílio. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos cílios primários, como biogênese dos cílios e tráfego de moléculas de cílios para os cílios primários. Em células-tronco neurais primárias, progenitores neurais e neurônios.
A principal vantagem dessa técnica é que podemos usar os critérios de células primárias das células-tronco neurais, progenitores neurais e neurônios para analisar a biogênese e as vias ciliares no contexto do cílio primário. Geralmente, os indivíduos novos nesse método terão dificuldades porque a cultura de células-tronco neurais é tecnicamente desafiadora para iniciantes. Mostraremos que uma demonstração desse método é crítica, pois a dissecção do ventrículo lateral e etapas como a cultura de neuroesferas e a quantificação de cílios primários são facilmente aprendidas observando as etapas críticas.
Comece este procedimento com uma zona subventricular da ventrícula lateral dissecada de um camundongo adulto usando o método de dissecção de montagem completa. Coloque o tecido contendo a SVZ em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 500 microlitros de 0,05% de tripsina-EDTA em PBS e incube 15 minutos a 37 graus Celsius em banho-maria.
Após a incubação, adicione 500 microlitros de meio de parada e pipete suavemente 20 a 30 vezes usando uma ponta de 1 mililitro. Evite formar bolhas de ar durante a pipetagem. Depois disso, gire as células a 500 vezes G por oito minutos.
Descarte o sobrenadante, adicione 1 mililitro de PBS e ressuspenda as células pipetando suavemente cinco vezes usando uma ponta de 1 mililitro. Centrifugar a 500 vezes G durante oito minutos. Em seguida, aspire o meio usando uma ponta de 1 mililitro e adicione 1 mililitro de meio basal.
Depois de contar as células, coloque as células de uma SVZ em um prato de 10 centímetros com 10 mililitros de meio NSC e cultive a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após cinco a sete dias, as neuroesferas podem ser observadas. Para analisar células em neuroesferas anexadas por imunocoloração, transfira 1 mililitro de meio contendo várias neuroesferas para um tubo de 1,5 mililitro e gire a 500 vezes G por oito minutos.
Após remover o meio, fixe as esferas com 4% de paraformaldeído por 15 minutos. Após a remoção do paraformaldeído, incube as esferas com 30% de sacarose, durante a noite. E então centrifugue novamente.
Lave com PBS. Em seguida, após centrifugar como antes, remover e descartar o sobrenadante. Em seguida, coloque uma pipeta com uma ponta cortada de 1 mililitro e pipete 500 microlitros de solução OCT nas neuroesferas.
Transferir a solução OCT que contém as neuroesferas para um molde de congelação de plástico descartável. Em seguida, congele o molde em gelo seco por pelo menos 15 minutos. Corte as seções com um criostato.
Para visualizar as células-tronco na neuroesfera, realize imunocoloração contra o marcador de células-tronco Nestin. Para visualizar os cílios primários em uma neuroesfera, execute a imunocoloração contra ARL13B. Comece este experimento um a dois dias após a semeadura de células-tronco neurais dissociadas aderentes em lamínulas revestidas com poli-L-lisina e laminina.
Mude o meio nos poços experimentais para meio de fome e para meio NSC fresco nos poços de controle. Incubar por mais 24 horas. No dia seguinte, fixe as células com 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente.
Após a fixação, lave com PBS duas vezes por cinco minutos cada, em temperatura ambiente. E, em seguida, realizar a imunofluorescência usando protocolos padrão. Monte as lamínulas com solução de montagem.
Em seguida, seque o vidro deslizante durante a noite em temperatura ambiente no escuro. No dia seguinte, adquira imagens em um microscópio composto com a ampliação necessária. A câmera do microscópio e as objetivas devem ser controladas usando o software que o acompanha.
Faça seções z suficientes em intervalos de 0,5 a 0,8 mícron. Para a análise quantitativa da localização ciliar em células aderentes, selecione de três a oito campos consecutivos com células confluentes visualizando o canal DAPI. Adquira pilhas de imagens de cada campo.
Quantifique o número de cílios primários usando ImageJ. Abra a caixa de diálogo Análise de plug-ins e selecione a ferramenta Contador de células para contar as células com cílios positivos para GPCR. Use parâmetros de intensidade e contraste de imagem semelhantes para todas as imagens do mesmo experimento para fins de contagem e exportação.
24 horas após a cultura de células dissociadas em meio NSC ou meio de fome, as células foram fixadas e imunomarcadas contra GPR161 mostrado em verde, ARL13B que aparece em vermelho e DNA mostrado em azul. Cílios positivos para GPR161 são observados em células de controle à esquerda e células famintas à direita. Como visto nessas vistas ampliadas.
As setas brancas e as pontas das setas indicam cílios positivos e negativos para GPR161, respectivamente. Esta imagem mostra a quantificação de células ciliadas positivas para ARL13B. A quantificação é realizada a partir de dois campos de visão, cada um de duas réplicas técnicas de um único experimento.
A porcentagem de células ciliadas positivas para ARL13B aumenta com a fome. Esta imagem mostra a quantificação da localização de GPR161 em cílios positivos para ARL13B em células de controle e famintas. A porcentagem de localização de GPR161 em cílios positivos para ARL13B também aumenta com a fome.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de duas horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outro método de cultura de células derivadas de tumores primários pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como o papel dos cílios na gênese do tumor. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo dos cílios primários explorarem a biogênese ciliar e o tráfego em sistemas baseados em neuroesferas primárias.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar cílios primários em células-tronco neurais, progenitores neurais e neurônios derivados de culturas baseadas em neuroesferas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para estudar a ciliogênese e o tráfego de proteínas sinalizadoras para cílios primários em células-tronco e progenitoras neurais. Utilizando culturas de neuroesferas, a técnica aborda questões fundamentais sobre a biogênese de cílios e o transporte de moléculas para os cílios em células neurais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- O cílio primário é essencial para diversas funções neurais.
- Compreender a biogênese dos cílios é fundamental para obter insights sobre o desenvolvimento neural.
- Os cultivos de neuroesferas fornecem um modelo relevante para o estudo de células-tronco neurais.
- Existem desafios técnicos no cultivo de células-tronco neurais para iniciantes.
Objetivo do Estudo
- Investigar a biogênese de cílios primários em células progenitoras neurais.
- Analisar o tráfego de proteínas sinalizadoras para os cílios primários.
- Fornecer uma demonstração prática das técnicas de cultivo de neuroesferas.
Métodos Utilizados
- Métodos de cultivo de neuroesferas para células-tronco e progenitoras neurais.
- Dissecação do ventrículo lateral.
- Quantificação de cílios primários.
- Observação de etapas críticas para uma aprendizagem eficaz.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de culturas de neuroesferas para análise.
- Demonstração de métodos de biogênese e tráfego de cílios.
- Identificação dos principais desafios para iniciantes no cultivo.
- Compreensão do papel dos cílios primários na função neural.
Conclusões
- Este método melhora a compreensão dos cílios primários em células neurais.
- Ele fornece uma base para pesquisas futuras em estudos relacionados aos cílios.
- Demonstrações técnicas podem auxiliar na superação dos desafios iniciais do cultivo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estudo de cílios primários em células-tronco e progenitoras neurais fornece subsídios mecanicistas sobre vias de sinalização do desenvolvimento relevantes para modelos de doenças neurodegenerativas. Culturas baseadas em neuroesferas permitem sistemas escalonáveis e reprodutíveis para validação de alvos na descoberta de fármacos para o SNC. Essa abordagem reforça a confiança preditiva em estudos de modulação de vias ao manter a sinalização fisiológica dependente de cílios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação da ciliogênese e do tráfego ciliar em células-tronco/progenitoras neurais para validar alvos nas vias de sinalização Hedgehog e GPCR.
- Valor Operacional: Permite múltiplos passagens e ciclos de congelação-descongelação, reduzindo a variabilidade em estudos longitudinais de engajamento de alvos.
- Valor Preditivo: Relaciona a localização de moléculas sinalizadoras, como GPR161, nos cílios com a atividade da via, auxiliando na desmistificação mecanicista de terapêuticos para o SNC.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do Ensaio: Células aderentes derivadas de neuroesferas permitem a imunomarcação padronizada e a quantificação de células positivas para cílios usando os marcadores ARL13B e GPR161.
- Saída Quantitativa: Permite a medição da porcentagem de ciliação e do tráfego proteico para os cílios em condições basais e de privação nutricional, apoiando a modelagem de resposta à dose.
- Escalabilidade: Compatível com placas de múltiplas poças e imagem automatizada para triagem em média escala de compostos ciliogênicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela vias dependentes de cílios implicadas em distúrbios neurodesenvolvimentais, obesidade e disfunção cognitiva.
- Continuidade Translacional: Conecta achados de ciliogênese in vitro a fenótipos in vivo por meio de mecanismos conservados de sinalização ciliar.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a identificação de defeitos no tráfego ciliar como possíveis biomarcadores translacionais para modulação de vias.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer um sistema fisiologicamente relevante para avaliar o engajamento do alvo em cascatas de sinalização dependentes de cílios antes da otimização do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre os papéis dos cílios na proliferação e diferenciação de progenitores neurais por meio de condições controladas de cultivo.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios para compostos que afetam a ciliogênese ou a localização de proteínas ciliares, utilizando leituras quantificáveis de imunofluorescência.
- Análises: Gera dados quantitativos sobre a frequência de ciliação e a localização subcelular de proteínas de sinalização, facilitando análises comparativas entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona fenótipos celulares de cílios com a atividade de vias de sinalização Hedgehog e GPCR, relevantes para modelos pré-clínicos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo da regulação dos cílios em diversos tipos celulares neurais e em perturbações relevantes para doenças.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece subsídios mecanicistas sobre a sinalização dependente de cílios, reduzindo a ambiguidade na validação de alvos em vias do SNC.
- Valor Operacional: A padronização do cultivo de neuroesferas melhora a reprodutibilidade e permite a criopreservação para consistência entre lotes.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao esclarecer a fidelidade da via-alvo em modelos neurais fisiologicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço com ajuste de risco ao validar a modulação do alvo em sistemas com competência ciliar antes do investimento pré-clínico.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecido neural e técnicas de cultivo celular primário.
- Depende do acesso a criostato, microscopia de fluorescência e ferramentas de análise de imagens, como o ImageJ, para a quantificação de cílios.
- Necessita padronização dos protocolos de inanição e fixação para garantir leituras consistentes de cílios entre os experimentos.
- A adaptação a outras regiões neurais ou modelos de doenças pode exigir otimização das condições de dissociação e cultivo.
- Limita-se a ensaios de diferenciação aderente para quantificação de cílios; neuroesferas em suspensão requerem processamento para obtenção de imagens.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:13
Isolation of Neurospheres from the Adult Mouse Brain
2:43
Embedding and Sectioning of Neurospheres for immunostaining
4:10
Starvation and Analysis of Cilia
6:01
Results: Starvation Induces Ciliogenesis in Dissociated, Adherent Neutral Stem/Progenitor Cells
7:19
Conclusion
