Artigo de método

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

DOI:

10.3791/55334

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8 de junho de 2017

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1Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 2Division of Experimental Radiology, Department of Neuroradiology, Heidelberg University Hospital, 3NeuroImaging Centre Research, Department of Neuroscience, Ruhr-University Bochum, 4Centre for Infectious Diseases, Parasitology Unit, Heidelberg University Hospital, 5German Centre for Infection Research (DZIF), 6Department of Neuroradiology, University of Würzburg, 7Center for Childhood and Adolescent Medicine, General Pediatrics, Heidelberg University Hospital

Neste artigo

Resumo

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Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.

Resumo

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A malária cerebral é um sinal de doença grave da malária e muitas vezes é um prenúncio da morte. Embora o tratamento agressivo possa salvar vidas, a detecção da malária cerebral pode ser difícil. Apresentamos um modelo experimental de camundongo de malária cerebral que compartilha múltiplas características da doença humana, incluindo edema e patologia microvascular. Usando ressonância magnética (MRI), podemos detectar e rastrear a ruptura da barreira hematoencefálica, o desenvolvimento de edema e o subsequente inchaço cerebral. Descrevemos várias técnicas de ressonância magnética que podem visualizar essas alterações patológicas pertinentes. Assim, mostramos que a ressonância magnética representa uma ferramenta valiosa para visualizar e rastrear alterações patológicas, como edema, inchaço cerebral e patologia microvascular, in vivo.

Introdução

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A malária é um problema de saúde global significativo. 1 A malária grave caracteriza-se, em parte, por envolvimento cerebral e muitas vezes é um fraco fator prognóstico. O envolvimento cerebral é comum em crianças menores de cinco anos nas áreas de alta transmissão da malária e representa a principal causa de morte relacionada à malária naquela faixa etária. 1 Embora o tratamento agressivo possa salvar a vida, a detecção da malária cerebral, especialmente nos estágios iniciais, pode ser difícil. Os processos patológicos envolvidos na malária cerebral incluem interrupção microvascular e edema cerebral, o que pode levar ao inchaço cerebral intenso. Neste artigo, apresentamos um protocolo de imagem por ressonância magnética (MRI) que permite a imagem in vivo de cérebro inteiro da malária cerebral experimental (ECM). Os métodos de imagem de alta resolução de cérebro inteiro foram amplamente subutilizados nesta doença, embora pouco se saiba sobre como o ECM inicia no centroSistema nervoso ou quais mecanismos específicos levam à doença. A ressonância magnética in vivo , que cobre todo o cérebro, representa uma ferramenta de pesquisa importante para obter uma melhor compreensão da patologia ECM. A ressonância magnética é capaz de avaliar o inchaço do cérebro cerebral global, que recentemente foi reconhecido como um importante preditor de morte, não apenas no ECM, mas também na malária cerebral humana. 2 , 3 O inchaço cerebral grave ocorre em doenças fatais e representa uma das várias características patológicas entre os modelos ECM e a doença humana, uma doença caracterizada por alterações inflamatórias e microvasculares. 4

O ECM pode ser induzido em camundongos CBA ou C57BL através de infecção com ANKA de Plasmodium berghei letal . 5 O início do ECM ocorre tipicamente entre os dias 6 e 10 após a infecção e resulta em encaixe, ataxia, dificuldade respiratória e coma, o que leva ao rapId death. 4 A Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS) é uma pontuação útil para avaliar os sintomas clínicos da ECM. Consiste em 10 parâmetros, cada um marcou de 0 a 2, com um máximo de 20. 6 Recentemente, apresentamos boa concordância entre a gravidade dos escores do RMCBS em camundongos ECM e as alterações patológicas demonstradas pela RM. 7 Neste protocolo, descrevemos a indução de ECM em camundongos e a ressonância magnética in vivo de camundongos com ECM.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais relatados neste artigo foram conduzidos de acordo com as diretrizes padrão da Federação para Associações de Ciência Animal de Laboratório (FELASA) e as diretrizes padrão da Sociedade de Ciência Animal de Laboratório (GV-SOLAS) e foram aprovadas pelas autoridades alemãs locais em Karlsruhe (Regierungspräsidium Karlsruhe , Alemanha). Por favor, note que o nível de biossegurança 2 aplica-se ao trabalho de esporozoítas de mosquito e Plasmodium berghei ANKA.

1. Infecção

  1. Infecte Anopheles stephensi mosquitos com Plasmodium berghei ANKA alimentando -os por 15 minutos em um mouse gametocitêmico. Mantenha os mosquitos infectados com 80% de umidade e 21 ° C.
  2. Coletar mosquitos fêmeas de sua gaiola 17 a 22 dias após a refeição de sangue. Coloque-os no gelo para anestesiar-los.
  3. Usando fórceps, coloque três a quatro mosquitos em um slide de vidro coberto com uma gota de meio RPMI frio. Coloque o slide ao microscópio.
  4. Usando fórceps, estique cuidadosamente o mosquito entre a cabeça e o corpo. Isolar a glândula salivar usando uma seringa e uma agulha. Repita este procedimento com os demais mosquitos.
  5. Recolher as glândulas salivares da lâmina de vidro, sugando-as com uma pipeta de vidro e recolhê-las em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: Dependendo das taxas de infecção, geralmente podem ser obtidas 8 000 a 15 000 esporozoítos infecciosos por glândula salivar.
  6. Por aproximadamente 3 min, esmague as glândulas salivares isoladas dentro do tubo de centrífuga com uma vara pequena e plástica para isolar os esporozoítos do tecido da glândula salivar.
  7. Centrifugar durante 3 minutos a 1000 xg e 4 ° C para purificar os esporozoítos do tecido restante.
  8. Pipetar o sobrenadante, que contém os esporozoítos (SPZ), até um novo tubo de centrífuga e contar os esporozoítos purificados em um hemocitômetro Neubauer.
  9. Ajustar a concentração de esporozoítos purificados para 10 000 / mL adicionando phSolução salina tamponada com osphate.
  10. Injetar um total de 1.000 esporozoítos (0,1 mL) nas veias da cauda de ratos C57BL / 6 endogâmicos para iniciar a infecção. Para facilitar as injeções, coloque os ratos C57BL / 6 em um dispositivo de retenção e coloque as caudas em água quente (aproximadamente 37 ° C) para auxiliar na visualização das veias da cauda;
    NOTA: A própria injeção é um procedimento curto que pode ser executado dentro de alguns segundos.
  11. Uma vez por dia, verifique a parasitemia no estágio sanguíneo em esfregaços sanguíneos a partir do dia 3 após a infecção por SPZ.
    NOTA: O monitoramento da parasitemia foi previamente visualizado em um artigo JoVE de Mueller et al. 8
  12. Avalie os ratos uma vez por dia com a pontuação Rapid Murine Coma e Behavior Scale (RMCBS), a partir do dia 5 após a injeção de esporozoítos.
    NOTA: Uma descrição detalhada deste procedimento, incluindo uma demonstração de vídeo, foi publicada por Caroll et al. 6
  13. AvaliarOs camundongos com imagens de MRI de acordo com o escore do RMCBS e a questão de pesquisa a ser abordada. 6

2. Configuração de Imagem de Ressonância Magnética

  1. Execute a ressonância magnética em um scanner animal pequeno de 9,4T usando um ressonador de volume para transmissão de radiofrequência e uma bobina receptora de superfície de 4 canais com instalação em fase. Ligue o banho de água com temperatura controlada para 42 ° C para manter a temperatura corporal do mouse.
  2. Induzir anestesia em uma câmara usando 2% de isoflurano e ar comprimido até o mouse não reage mais a uma pitada de dedo do pé. Manter a anestesia em 1-1,5%.
  3. Coloque um cateter de veia da cauda na veia da cauda do mouse. Posicione o mouse para ressonância magnética, colocando-o propenso e com uma parte traseira crunched em uma cama de animal equipada com um headlock e barra de dentes para minimizar o movimento da cabeça. Tenha cuidado para não endireitar a coluna cervical do mouse.
  4. Conecte um sistema de injeção do agente de contraste ao cateter da veia da cauda. Use um sistema de injeção feito sob medida preenchido com uma seringa Gd-DTPA (0,3 mmol / kg) ou use um tubo PE conectado a uma seringa Gd-DTPA (0,3 mmol / kg).
  5. Aplique pomada com o dexpantenol em ambos os olhos. Coloque a bobina do cabeçote do receptor de superfície com 4 canais em fase na cabeça do mouse. Coloque uma almofada de respiração na parte de trás do mouse e conecte-a a um dispositivo de monitoração de respiração.

3. Protocolo de imagem

NOTA: Escolha as seqüências de imagens a partir do protocolo listado abaixo de acordo com as questões de pesquisa a serem abordadas. Todos os parâmetros listados são válidos para o software MRI, mas podem ser ajustados se outros programas de software forem usados.

  1. Comece executando uma varredura de localização para garantir que o cérebro do mouse esteja no isocentro do ímã.
  2. Para avaliar qualitativamente o edema vasogênico, use imagem em 3D ponderada em T2, selecionando uma seqüência RAR multi-fatia.
    1. Digite o seguinte paAjustes para o software MRI: tempo de repetição = 2.000 ms, tempo de eco = 22 ms, resolução isotrópica = 0.1mm, campo de visão = 20 x 10 x 12 mm 3 ; Matriz = 200 x 100 x 120, ângulo de flip = 90-180 °; (Spin-echo) e fator raro = 8. Inicie a sequência e aguarde 10 min 48 s para adquirir as imagens em bruto.
  3. Para avaliar quantitativamente o edema vasogênico, realize a relaxometria T2 selecionando uma seqüência de eco multi-fatia múltipla.
    1. Use os seguintes parâmetros: tempo de repetição = 3.100 ms, tempo de eco = 8-136 ms em incrementos de 8 ms, número de fatias = 17, espessura da fatia = 0,7 mm, resolução do plano = 0.116 mm x 0.116 mm, campo de visão 20 X 20 mm 2 , matriz = 172 x 172, ângulo de flip = 90-180 graus; (Spin-echo). Inicie a sequência e aguarde 8 min 53 s para adquirir as imagens em bruto.
  4. Para avaliar quantitativamente o edema vasogênico e o edema citotóxico, realizar imagens ponderadas por difusão / coeficiente de difusão aparenteFficient (ADC), selecionando uma sequência de difusão de spin-echo EPI.
    1. Use os seguintes parâmetros: tempo de repetição = 3.400 ms, tempo de eco = 20 ms, espessura da fatia = 0,7 mm, número de fatias = 17, número de direções sensibilizadas por difusão = 30, valor b = 1.500 s / mm 2 , δ = 3 ms Δ = 9 ms, fator de aceleração de codificação de Fourier parcial = 1,51, campo de visão = 12 x 15 mm 2 , matriz = 96 x 128, resolução no plano = 0,125 mm x 0,117 mm, ângulo de inclinação = 90-180 graus e Número de fatias de saturação (sagital) = 1. Inicie a sequência e aguarde 7 min 56 s até as imagens em bruto forem adquiridas.
  5. Para avaliar microhemorragias, use imagens 3D ponderadas com pontuação. Selecione uma seqüência FLASH com compensação de fluxo.
    1. Digite os seguintes parâmetros no software MRI: tempo de repetição = 2.000 ms, tempo de eco = 22 ms, resolução isotrópica 0,08 mm, campo de visão = 32 x 15 x 8 mm 3 , tamanho da matriz = 400 x 188 x 100 e fÂngulo do lábio = 12 graus. Comece a sequência e aguarde 15 min 40 s para adquirir as imagens em bruto.
  6. Para avaliar a permeabilidade arterial, use a angiografia do tempo de vôo, selecionando uma seqüência FLASH 3D.
    1. Use os seguintes parâmetros no software MRI: tempo de repetição = 16 ms, tempo de eco = 3,5 ms, espessura da fatia = 0,07 mm, resolução no plano = 0,104 x 0,104 mm, campo de visão = 20 x 20 x 10 mm 3 , matriz = 192 x 192 x 142, e ângulo de inclinação = 15 graus. Comece a seqüência e aguarde 7 min 16 s até as imagens serem adquiridas.
  7. Para avaliar a ruptura da barreira hematoencefálica, use imagens 3D ponderadas T1 antes e após uma injeção de agente de contraste de 0,3 mmol / kg. Selecione uma seqüência FLASH com radiofreqüência com uma excitação de freqüência de rádio global.
    1. Use os seguintes parâmetros de seqüência no software MRI: tempo de repetição = 5 ms, tempo de eco = 1,9 ms, resolução isotrópica = 0,156 mm, campo de visão 20 x 18,7X 18,7 mm 3 , matriz 128 x 120 x 120 e ângulo de flip = 8,5 ° ;. Comece a seqüência e aguarde 1 minuto 14 até as imagens serem adquiridas.

4. Processamento e Análise de Imagem

  1. Para analisar a ruptura da barreira hematoencefálica, subtrai imagens 3D ponderadas T1 não aprimoradas de imagens ponderadas T1 aprimoradas com a ferramenta aritmética ou a ferramenta de calculadora de imagem no ImageJ. Avalie as imagens de subtração para um aumento de sinal, o que corresponde à ruptura da barreira hematoencefálica. 9
  2. Para analisar o volume do cérebro, use conjuntos de dados nativos 3D T1 ou 3D ponderados. Delinee o cérebro da lâmpada olfativa ao cerebelo usando o editor de segmentação. 10
  3. Edema vasogênico
    1. Processe os dados de relaxometria T2 com o software MRI ou use um procedimento não linear de ajuste de mínimos quadrados. 11 Dados ponderados por difusão de processo para obter mapas ADC usando MRI sofTware ou FDT toolbox (veja Tabela de Materiais ).
    2. Coloque regiões de interesse manualmente nas diferentes regiões anatômicas.
      NOTA: A colocação automática de regiões de interesse pode se registrar incorretamente devido ao inchaço cerebral significativo. Os valores T2 e ADC das regiões anatômicas escolhidas são obtidos desta forma.
  4. Para analisar o volume de microhemorragia, delinear microhemorragias, que aparecem como focos ovoides e sombrios em conjuntos de dados ponderados T2 *, usando o editor de segmentação.

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Resultados

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Em ratinhos C57BL / 6, os primeiros sintomas clínicos de ECM podem ser observados entre os dias 6 e 10 após a infecção com esporozoítos de P. berghei ANKA . ECM desenvolve em 60 a 80% dos camundongos infectados e progride rapidamente para coma e morte dentro de 24 a 48 h. Em contraste, os ratos que não desenvolvem ECM morrem após a segunda semana após a infecção por anemia grave por hiperparasitemia. 12

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Discussão

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Neste artigo, descrevemos um protocolo de MRI em todo o cérebro para delinear mudanças na malária cerebral experimental. Acreditamos que a ressonância magnética foi subutilizada na pesquisa de malária até o momento e espero que nossos protocolos ajudem outros pesquisadores. Gostaríamos de descrever alguns pontos adicionais que podem ser úteis.

Se os camundongos gravemente doentes forem fotografados, o posicionamento é crucial. Devido ao aumento da pressão intracraniana, os camundongos são su...

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Divulgações

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Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

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A assistência técnica especializada de Miriam Reinig é reconhecida com gratidão. AH recebeu financiamento de um salário pós-doutorado da Faculdade de Medicina da Universidade de Heidelberg. O MP é apoiado por um salário memorável da Fundação Else-Kröner-Fresenius. A AKM é destinatária de um salário de licença de maternidade pela Academia DZIF do Centro Alemão de Pesquisa de Infecções (DZIF). JP é o destinatário de um Centro de Pesquisa Heidelberg para Medicina Molecular (HRCMM) Career Development Fellowship. Além disso, agradecemos a Julia M. Sattler e Friedrich Frischknecht pelo fornecimento de um filme exemplar de movimento esporozoítico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IsofluranoBaxter1001747para anestesia
DotaremGuebert1086923Gd-DTPA agente de contraste; 0,5 mmol/mL
Amira (Programa de Processamento de Imagem)FEI GroupVersion Amira 5.3.2
MATLAB The MathWorks, Inc.,Lançamento 2012b
Caixa de ferramentas FDT Biblioteca de software doFMRIBhttp://www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fdt/index.html

Referências

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