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Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

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DOI:

10.3791/55341

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5 de maio de 2017

 ,  ,  , 
1Physiology, Michigan State University, 2Center for Neurodegenerative Science Van Andel Institute, 3Pharmaceutical Sciences, Wayne State University

Neste artigo

Resumo

Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.

Resumo

Existem muitos métodos bem desenvolvidos para purificar e estudar proteínas individuais e peptídeos. No entanto, a maioria das funções celulares são realizados por redes de complexos de proteínas que interagem, que são muitas vezes difíceis de investigar, porque a sua ligação é não-covalente e facilmente perturbado por técnicas de purificação. Este trabalho descreve um método de estabilização e separando complexos de proteína nativa a partir de tecido não modificado utilizando electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tecido é carregado num gel de poliacrilamida nativo azul-n desnaturante, em seguida, uma corrente eléctrica é aplicada até que a proteína migra uma curta distância dentro do gel. A tira de gel contendo a proteína migrado é então excisada e incubadas com as ditiobis reactivos de amina reagente de ligação cruzada (propionato de succinimidilo), que estabiliza covalentemente complexos de proteínas. A tira de gel contendo complexos de ligação cruzada é então moldada num gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio, e tele complexos são separados completamente. O método baseia-se em técnicas e materiais familiares para a maioria dos biólogos moleculares, o que significa que é barato e fácil de aprender. Enquanto que é limitada na sua capacidade para separar adequadamente extremamente grandes complexos, e não tem sido universalmente bem sucedida, o método foi capaz de capturar uma grande variedade de complexos bem estudadas, e é provavelmente aplicável a muitos sistemas de interesse.

Introdução

Função celular normal é dependente de interacções proteína-proteína de 1, 2. Como resultado, as doenças humanas são frequentemente caracterizadas por perturbações na montagem e comportamento de vários complexos de proteínas 3. A capacidade de caracterizar essas interacções é, por conseguinte, crítica. meios actuais de detecção destas interacções requerem purificação de proteínas alvo, muitas vezes seguidos por suspenso de seus parceiros interactuantes. Clássica de purificação é realizado por centrifugação diferencial, precipitação e / ou cromatograf ia em 4. Estes métodos são demorados, deve ser alterado para cada proteína alvo, e muitas vezes resultam em baixos rendimentos. Modernos métodos de purificação envolvem a fusão de sinais peptídicos a proteínas alvo, seguido de imunoprecipitação ou de extracção em colunas carregadas com esferas ligadas a uma molula de captura 5,"> 6. Embora esta seja extensível para muitas proteínas, que exige modificação da sequência do alvo, potencialmente resultando em construções que diferem na afinidade para os seus parceiros de ligação usuais. A natureza delicada de algumas interacções proteína-proteína significa que este método pode não ser aplicável para muitos cenários. Além disso, os ensaios de pull-down utilizadas para mapear as interações proteína-proteína pode não capturar uma imagem celular precisa, devido à graus restritos de liberdade e os níveis de não-nativos da proteína isca.

Idealmente, os complexos de proteína podia ser detectada nos seus estados nativos, sem a necessidade de purificação ou suspenso. Electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) foi desenvolvido como uma alternativa menos desnaturante a electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), e permite a separação de algumas proteínas e complexos a partir de amostras biológicas 7. No entanto, as proteínas em BN-PAGE separadas com base em um large número de variáveis, incluindo tamanho, carga, estrutura tridimensional, e associação com outras moléculas. As interacções destes factores resultam frequentemente em co-separação de proteínas, formação de agregados, e pobre resolução banda de proteína. Electroforese em gel nativo de poliacrilamida bidimensional resolve alguns, mas não todos, estes problemas 8.

Para contornar as complicações associadas com a separação nativa, alguns autores utilizam reagentes reactivos de amina de reticulao, tais como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar os complexos de proteína em lisados de tecido 4. Estes lisados ​​tratados pode então ser desnaturado e separadas por SDS-PAGE, preservando ao mesmo tempo o tamanho nativo e a composição de complexos de proteínas. No entanto, uma vez que os reagentes de reticulação reagir com base na proximidade de uma molécula para outra, e proteínas em lisados ​​de tecido tem muitos graus de liberdade e pode interagir estocasticamente, inespecífica transversal fundo-linking pode ser elevado, especialmente em amostras concentradas. Isso pode levar a resultados difíceis de interpretar.

Aqui, demonstramos a utilização de um método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominada electroforese em gel de poliacrilamida-multero (multímero-PAGE), para separar e detectar os conjuntos de proteínas em misturas complexas. Inicialmente, lisado de células é suspenso em gel de poliacrilamida através BN-PAGE. O gel contendo o lisado é então feito reagir com o reagente DSP reticulação. e ligeiramente separadas no gel imobilizada-pseudo, as proteínas são muito menos susceptíveis de reagir de forma não específica, o que significa que a reactividade cruzada de fundo ligante é reduzida. Após a reticulação, as bandas de gel são excisadas e separados por meio de SDS-PAGE. O gel resultante pode então ser analisada por quaisquer meios tipicamente associados com electroforese em gel de poliacrilamida. Este método permite a separação e a detecção de complexos de proteínas nativas em lisado de tecido não modificada, sem a necessidade de purificação adicional ou puxar-Down.

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Protocolo

1. Preparação do Tecido

  1. Preparar 10 ml de 4x tamp de amostra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) metano amino-tris (hidroximetil) (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ).
    NOTA: esta solução pode ser feita com antecedência e guardadas a 4 ° C.
  2. Dilui-se 250 uL de tampão de amostra 4x em 750 uL de dH2O contendo mistura de inibidores de protease comercial 1x. Vortex e frio no gelo.
  3. Homogeneizar 20 mg de tecido alvo no tampão de amostra de 1 mL de 1x gelada BN-PAGE com 30 movimentos de um homogeneizador Dounce limpo.
    NOTA: Para este experimento de demonstração, o tecido alvo é tecido cerebral de ratos todo. Ap homogeneizao, as amostras podem ser tratadas com detergente suave, tal como 2% de digitonina para solubilizar e permitir a electroforese de proteínas de membrana.
  4. Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e centrifugar a 14000 xg durante 30 min para sedimentar os conteúdos celulares insolúveis. after centrifugação, decanta-se o sobrenadante para um tubo limpo em gelo.
  5. Seguir as instruções do fabricante para medir a concentração de proteína sobrenadante utilizando ácido bicinchonínico (BCA) ou um ensaio de quantificação de proteína semelhante.
  6. Se a amostra (s) de homogenado conter detergente, adicionar uma quantidade de 5% de Coomassie Blue G-250 em solução aquosa suficiente para levar a solução homogeneizado a 0,25% de Coomassie.

2. BN-PAGE

  1. Dilui-se 25 ml de 20x azul nativa (BN) electroforese estoque de tampão (1,0 M de Bis-Tris, 1,0 M de tricina, pH 6,8) em 475 mL de dH2O contendo 0,002% de Azul de Coomassie para fazer 500 ml de tamp de corrida 1x.
    1. Se as amostras contêm detergente, em vez disso fazer 250 ml de tamp de corrida 1x contendo 0,02% de Coomassie e mais 250 mL contendo nenhum.
  2. tampão (s) frio a 4 ° C.
  3. Limpar e montar um gel de poliacrilamida que derrama Cassete de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Despeje o gel de poliacrilamida BN (3% de camada de empilhamento em T, 6% de camada de resolução T) de acordo com uma receita padrão 7 e coloque o pente de poço.
  5. Após a polimerização dos géis, enxágüe a cassete com dH2O e monte o aparelho de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante.
  6. Remova o pente do poço e encha os poços com 1x buffer de execução BN-PAGE. Evite encher toda a câmara interna com tampão até as amostras serem carregadas.
    1. Se as amostras contiverem detergente, encher os poços com o tampão contendo 0,02% de Azul de Coomassie.
      NOTA: Execute os passos 2.7-2.9 a 4 ° C.
  7. Usando pontas de carga de gel, pipetar um volume de homogeneizado contendo 20 μg de proteína nos poços desejados. Pipetar um volume equivalente de 1x tampão de amostra BN-PAGE em poços não utilizados.
    NOTA: Utilizar a concentração de proteína determinada a partir do ensaio de BCA para calcular o volume apropriado de homogeneizado a adicionar aos poços.
  8. Depois as amostras são carregadas, encher a câmara interior com tampão 1x BN-PAGE em execução. Certifique-se o gel é inteiramente submerso em tampão. Em seguida, encher a câmara exterior com 1x tampão de corrida para o nível indicado pelo fabricante.
    1. Se as amostras contêm detergente, encher a câmara interior com o tampão 1x contendo 0,02% de azul de Coomassie, e a câmara exterior com tampão de corrida 1x isento de corante.
  9. Ligar os eléctrodos para a fonte de alimentação, e electroforese as proteínas no gel a 150 V até que a banda de corante progride ~ 2 centímetros em resolver camada. Parar e desligar a alimentação eléctrica.

3. A reticulação

NOTA: Efectuar os Passos 3,1-3,6 a 4 ° C.

  1. Desmontar o aparelho de electroforese, e separar as vidraças da cassete de gel. Remover e descartar a camada de empilhamento.
  2. Corte cuidadosamente o gel apenas abaixo da aresta inferior da frente do corante. Levaro cuidado de fazer este corte tão lisa e direita quanto possível, e, em seguida, descartar a peça não utilizada do gel. Isto deixará uma ~ 2 cm de largura, tira horizontal em gel de poliacrilamida, que contêm toda a proteína na amostra de homogenato.
  3. Aparar quaisquer porções não utilizadas ao longo das bordas da tira de gel.
  4. Cuidadosamente colocar a tira em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS), em um recipiente pequeno, e misturar suavemente por nutação durante 30 minutos para equilibrar.
  5. Após equilíbrio, descartar e substituir o PBS com mais 10 ml. Pipetar 500 L de 25 mM de DSP dissolvido em sulfóxido de dimetilo na PBS, e continuar a misturar como anteriormente (passo 3.4), durante 30 min.
  6. Decantar a solução de DSP. Adicionar 10 ml de 0,375 M de tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl), pH 8,8, contendo 2% de dodecilsulf ato de sódio (SDS) para extinguir o DSP que não reagiu. Continuar nutação durante 15 minutos.

4. SDS-PAGE

  1. Enquanto tira de gel é têmpera, preparar SDS-PASoluções de gel GE de acordo com métodos padrão 9. Não adicione reagentes de polimerização.
  2. Após terminar a reacção, voltar a tira de gel ΒΝ até à temperatura ambiente, e fundido a tira dentro de uma nova cassete de gel.
    1. Para fazer isso, cuidadosamente pegar o gel e colocá-lo sobre uma placa de gel de espaçador cassete limpo.
    2. Oriente a tira de modo que a parte inferior da frente do corante é mais próximo à parte superior da nova cassete (ou seja, o lado que viajou mais distante durante BN-PAGE deve ser o mais próximo do topo da nova cassete, a tira de gel deve ser invertida a partir do seu prévio orientação). Ver Figura 3.
    3. Colocar a tira de tal modo que o seu bordo superior encontra-se ainda com que a borda superior da placa de cobertura será (ou seja, ele vai estar no topo do gel de novo). Certifique-se a frente de corante é paralela às bordas horizontais da placa de vidro.
    4. Empurrar um lado da tira excisado contra uma das paredes do espaçador, deixando espaço no tele outro lado para o gel para ser vertida e um padrão de proteína, ou escada para ser carregado.
    5. Se a borda inferior da tira de gel contém quaisquer áreas serrilhadas ou irregulares, cortá-los cuidadosamente distância. Se estiver presente, eles vão bolhas armadilha durante gel de vazamento.
    6. Uma vez que a tira de gel está posicionada correctamente, colocar a placa de cobertura sobre a placa do espaçador. Aplique uma leve pressão para empurrar as bolhas de ar aprisionadas.
    7. Continuar a montar o aparelho que derrama-gel de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Adicionar reagentes de polimerização para o tampão de gel de resolução, e despeje-a cassete de gel preparada, usando uma pipeta serológica. Encher a cassete de gel a aproximadamente 2 cm abaixo da tira de gel BN-PAGE excisado, para deixar espaço para a camada de empilhamento.
  4. Adicionar 100 mL de butanol sobre a parte superior do gel derramado, e permitir 30 min para a polimerização da camada de resolver. Decantar o butanol.
  5. Adicionar reagentes de polimerização para a solução de gel de empilhamento. Usando um serologpipeta ical, verter a camada de empilhamento para preencher todo o espaço vazio que permanece na cassete de gel.
    1. Inclinar a cassete de gel, como a camada de empilhamento é derramado de modo a preencher o espaço abaixo da tira de gel, e as bolhas de ar não estão presos.
    2. À medida que o tampão de gel de empilhamento preenche o espaço vazio por baixo da tira de gel, retornar gradualmente a cassete de gel a base de nível.
    3. Continuar a preencher o espaço vazio ao lado da tira de gel excisado com o tampão do gel de empilhamento, até que quase transborda.
  6. Permitir que a camada de empilhamento para polimerizar durante 30 minutos.
    NOTA: Adicione 10x SDS-PAGE O tampão de corrida (Tris 250 mM (hidroximetil) aminometano (tris), 1.9 M de glicina, 1% de SDS), enquanto que o gel é a polimerização. Isso também pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente.
  7. Dilui-se 50 mL de 10X de SDS-PAGE estoque tampão de corrida em 450 mL de dH2O para fazer tampão de trabalho 1x.
  8. Depois da camada de empilhamento tem polimerizado, remover a cassete de gel da vertendoaparelho, lavar com dH 2 O, e montar o aparelho de electroforese de acordo com as instruções do fabricante.
  9. Encher a câmara interior completamente com tampão de corrida SDS-PAGE 1x, em seguida, encher a câmara exterior para o nível indicado pelo fabricante.
  10. Carregar o espaço ao lado da tira de gel excisada com uma escada de peso molecular ou padrão de proteína apropriada.
  11. Anexar os eléctrodos para a fonte de alimentação, e electroforese das amostras a 120 V. Quando o corante de Coomassie corre fora do gel, parar e desligar a fonte de alimentação.
  12. Analisar o gel, utilizando métodos padrão de eiectromancheamento e detecção da proteína através da ligação 10 anticorpo.

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Resultados

Neste experimento de demonstração, multero-PAGE foi realizada em toda lisado cérebro de rato. As proteínas resultantes separadas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF), e em seguida sondadas com anticorpos contra proteínas que são conhecidas por formar complexos. A Figura 1 mostra uma validação do protocolo por dois meios. Em primeiro lugar, demonstra-se que as proteínas de ligação cruzada são susceptíveis ao corte por adição de um agent...

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Discussão

interações proteína-proteína são importantes para cada tarefa seres vivos realizar. Devido a isso, eles são objecto de intenso escrutínio e pesquisa. Multímero-PAGE é um novo método para a captura, separar, e a análise de uma grande variedade de complexos de proteínas. Foi anteriormente demonstrado a sua aplicabilidade ao estudo oligimerization da doença associada à proteína α-sinucleína 11. No entanto, é extensível para muitos complexos de proteína, tal como demonstrado na Figura 2.

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Compatível com o DA034783 NIH / NIDA. Agradecemos Bryan A. Killinger de assistência técnica com o multimero-PAGE.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Produtos Químicos
ε-Ácido aminocapróicoSigmaA2504
AcrilamidaAcros Organics164855000Tóxico.
Acrilamida / bisacrilamida 37,5: 1 (solução estoque de 40% T)BioRad161-0148Tóxico.
Persulfato de amônioSigmaA3678
Anti coelho IgG-HRP de cabraSanta Cruz Biotecnologiasc-2004
Kit de ensaio de ácido bicinchonínicoThermofisher23225
Bis-trisSigmaB9754
Albumina de soro bovinoSigmaA9647
ButanolFisher ScientificA399-1
Kit de substrato de quimioluminescênciaThermoFisher24078
Coomassie blue G-250Sigma-AldrichB0770
DigitoninSigmaD141Toxic.
Dimetilsulfóxido FisherScientificD128-1
Dithiobis (succinimidilpropionato)Thermo Scientific22585
Leite desnatado secoLabScientificM0841
GlicerolSigmaG9012
GlicinaFisher ScientificBP381-5
Halt Protease Inhibitor CocktailThermofisher78430
Ácido clorídricoFisher ScientificA144SI-212Para titulação. Cáustico.
MetanolFisher ScientificA412-4Para ativação de membrana PVDF. Tóxico.
Monoclonal anti &alfa;-sinucleína IgG de coelhoSanta Cruz Biotechnologysc-7011-R
N,N,N',N'-tetrametiletilenodiaminaSigmaT9281
N,N'-metilenobisacrilamidaAcros Organics16479Tóxico.
NP40Boston BioproductsP-872
Polissorbato 20 (tween-20)Fisher ScientificBP337-500
Membranas de transferência de fluoreto de polivinilidenoThermo Scientific88518
Ponceau SSigmaP3504
Cloreto de potássioFisher ScientificP217-3
Fosfato de potássio coquetel deSigmaP9791
Thermo Scientific88265
(10% p / v)BioRad161-0416
Cloreto de sódioFisher ScientificBP358-212
Dodecil sulfato de sódioSigmaL37771
Fosfato de sódio monobásicoFisher ScientificBP329-1
TricineSigmaT0377
Base Tris FisherScientificBP152-500
Tris-HCl (tampão de 0,5 M, pH 6,8)BioRad161-0799
Tris-HCl (tampão de 1,5 M, pH 8,8)BioRad161-0798
< forte > Nome< / forte >< forte > Empresa < / forte >< forte> Número de catálogoComentários
Instruments
GE Imagequant LAS 4000GE Healthcare28-9558-10
Software ImageJNIH
Synergy H1 leitor de microplacasBioTek
Gel Former + StandBiorad
Centrífuga Microfuge 22RBeckman Coulter
2 mL homogeneizador
Misturador de vórticeFisher Scientific
Homogeneizador de tecidos ultrassônicoFisher ScientificFB120220
inibidor de protease monobásico Solução SDS de dounce

Referências

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