Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

Summary

Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.

Abstract

Existem muitos métodos bem desenvolvidos para purificar e estudar proteínas individuais e peptídeos. No entanto, a maioria das funções celulares são realizados por redes de complexos de proteínas que interagem, que são muitas vezes difíceis de investigar, porque a sua ligação é não-covalente e facilmente perturbado por técnicas de purificação. Este trabalho descreve um método de estabilização e separando complexos de proteína nativa a partir de tecido não modificado utilizando electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tecido é carregado num gel de poliacrilamida nativo azul-n desnaturante, em seguida, uma corrente eléctrica é aplicada até que a proteína migra uma curta distância dentro do gel. A tira de gel contendo a proteína migrado é então excisada e incubadas com as ditiobis reactivos de amina reagente de ligação cruzada (propionato de succinimidilo), que estabiliza covalentemente complexos de proteínas. A tira de gel contendo complexos de ligação cruzada é então moldada num gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio, e tele complexos são separados completamente. O método baseia-se em técnicas e materiais familiares para a maioria dos biólogos moleculares, o que significa que é barato e fácil de aprender. Enquanto que é limitada na sua capacidade para separar adequadamente extremamente grandes complexos, e não tem sido universalmente bem sucedida, o método foi capaz de capturar uma grande variedade de complexos bem estudadas, e é provavelmente aplicável a muitos sistemas de interesse.

Introduction

Função celular normal é dependente de interacções proteína-proteína de ^{1, 2.} Como resultado, as doenças humanas são frequentemente caracterizadas por perturbações na montagem e comportamento de vários complexos de proteínas ^3. A capacidade de caracterizar essas interacções é, por conseguinte, crítica. meios actuais de detecção destas interacções requerem purificação de proteínas alvo, muitas vezes seguidos por suspenso de seus parceiros interactuantes. Clássica de purificação é realizado por centrifugação diferencial, precipitação e / ou cromatograf ia em ^4.

Protocol

1. Preparação do Tecido

1. Preparar 10 ml de 4x tamp de amostra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) metano amino-tris (hidroximetil) (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ).
   NOTA: esta solução pode ser feita com antecedência e guardadas a 4 ° C.
2. Dilui-se 250 uL de tampão de amostra 4x em 750 uL de _dH2O contendo mistura de inibidores de protease comercial 1x. Vortex e frio no gelo.
3. Homogeneizar 20 mg de tecido alvo no tampão de amostra de 1 mL de 1x gelada BN-PAGE com 30 movimentos de um homogeneizador Dounce limpo.
   NOTA: Para este experimento de demonstração, o tecido alvo é te....

Results

Neste experimento de demonstração, multero-PAGE foi realizada em toda lisado cérebro de rato. As proteínas resultantes separadas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF), e em seguida sondadas com anticorpos contra proteínas que são conhecidas por formar complexos. A Figura 1 mostra uma validação do protocolo por dois meios. Em primeiro lugar, demonstra-se que as proteínas de ligação cruzada são susceptíveis ao corte por adição de um agent.......

Discussion

interações proteína-proteína são importantes para cada tarefa seres vivos realizar. Devido a isso, eles são objecto de intenso escrutínio e pesquisa. Multímero-PAGE é um novo método para a captura, separar, e a análise de uma grande variedade de complexos de proteínas. Foi anteriormente demonstrado a sua aplicabilidade ao estudo oligimerization da doença associada à proteína α-sinucleína ^11. No entanto, é extensível para muitos complexos de proteína, tal como demonstrado na Figura 2.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Produtos Químicos
ε-Ácido aminocapróico	Sigma	A2504
Acrilamida	Acros Organics	164855000	Tóxico.
Acrilamida / bisacrilamida 37,5: 1 (solução estoque de 40% T)	BioRad	161-0148	Tóxico.
Persulfato de amônio	Sigma	A3678
Anti coelho IgG-HRP de cabra	Santa Cruz Biotecnologia	sc-2004
Kit de ensaio de ácido bicinchonínico	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Albumina de soro bovino	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Kit de substrato de quimioluminescência	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Dimetilsulfóxido Fisher	Scientific	D128-1
Dithiobis (succinimidilpropionato)	Thermo Scientific	22585
Leite desnatado seco	LabScientific	M0841
Glicerol	Sigma	G9012
Glicina	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail	Thermofisher	78430
Ácido clorídrico	Fisher Scientific	A144SI-212	Para titulação. Cáustico.
Metanol	Fisher Scientific	A412-4	Para ativação de membrana PVDF. Tóxico.
Monoclonal anti &alfa;-sinucleína IgG de coelho	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina	Sigma	T9281
N,N'-metilenobisacrilamida	Acros Organics	16479	Tóxico.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polissorbato 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Membranas de transferência de fluoreto de polivinilideno	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Cloreto de potássio	Fisher Scientific	P217-3
Fosfato de potássio coquetel de	Sigma	P9791
	Thermo Scientific	88265
(10% p / v)	BioRad	161-0416
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	BP358-212
Dodecil sulfato de sódio	Sigma	L37771
Fosfato de sódio monobásico	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Base Tris Fisher	Scientific	BP152-500
Tris-HCl (tampão de 0,5 M, pH 6,8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (tampão de 1,5 M, pH 8,8)	BioRad	161-0798
< forte > Nome< / forte >	< forte > Empresa < / forte >	< forte> Número de catálogo	Comentários
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
Software ImageJ	NIH
Synergy H1 leitor de microplacas	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Centrífuga Microfuge 22R	Beckman Coulter
2 mL homogeneizador
Misturador de vórtice	Fisher Scientific
Homogeneizador de tecidos ultrassônico	Fisher Scientific	FB120220