Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Resumo

Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.

Resumo

modelos de microfluidos de hemostasia avaliar a função das plaquetas em condições de cisalhamento hidrodinâmico, mas na presença de anticoagulantes, esta análise é restrita apenas a deposição de plaquetas. A intrincada relação entre o Ca ²⁺ função de coagulação e plaquetas dependente requer recalcificação cuidadosa e controlada de sangue antes da análise. A nossa configuração usa um canal de mistura em forma de Y, que fornece Ca ²⁺ / Mg ²⁺ tampão concentrado para fluir sangue imediatamente antes da perfusão, permitindo recalcificação rápida sem estase amostra. Uma diferença de dez vezes na velocidade de fluxo entre ambos os reservatórios minimiza a diluição. O sangue é então perfundido recalcified em uma câmara de análise revestidos com colagénio, e rotulagem diferencial permite a imagem em tempo real, de ambas a deposição de plaquetas e de fibrina através de microscopia de fluorescência de vídeo. O sistema utiliza apenas ferramentas disponíveis comercialmente, aumentando as chances de padronização. Reconstituição do throsangue mbocytopenic com plaquetas de bancarizada concentra, além disso, os modelos transfusão de plaquetas, provando o seu uso neste domínio de investigação. Exemplos de dados demonstraram que o início da coagulação e deposição de fibrina foram linearmente dependente da concentração de plaquetas, confirmando a relação entre a hemostase primária e secundária no nosso modelo. Em um prazo de 16 perfusão min, a ativação de contas não ocorreu, apesar recalcificação para Ca normais ²⁺ e Mg ²⁺ níveis. Quando o factor de coagulação XII foi inibida pelo inibidor de tripsina de milho, este período de tempo foi ainda mais longo, indicando uma considerável gama dinâmica na qual as mudanças na natureza pró-coagulante das plaquetas pode ser avaliado. Co-imobilização do factor de tecido com colagénio reduziu significativamente o tempo de início da coagulação, mas não a sua taxa. A opção para estudar o factor de tecido e / ou a via de contacto aumenta a versatilidade e utilidade do ensaio.

Introdução

hemostasia primária e secundária foram originalmente conceituado como dois processos bioquímicos relativamente separáveis. hemostasia primária era visto como um dos principais contribuintes em condições de fluxo arterial, com um papel fundamental para plaquetas, enquanto que a hemostasia secundária foi visto a dominar a coagulação sob fluxo de sangue venoso, permitindo que a cascata de protease para formar fibrina insolúvel. As últimas décadas têm remodelado essa visão tradicional substancialmente, reconhecendo que a ativação plaquetária e coagulação são interdependentes e são processos igualmente importantes durante a hemostasia fisiológico e patológico em todos (não-extremos) meios hidrodinâmicas. Este ponto de vista foi traduzida para a clínica, onde ensaios concebidos para medir de forma abrangente a coagulação do sangue total são cada vez mais utilizados, embora com muitas perguntas restantes sobre a relevância, aplicabilidade e utilidade ^1.

Recentemente, publicou uma análise funcional das plaquetasconcentrados utilizando câmaras de fluxo de microfluidos revestidas com colagénio fibrilar num modelo in vitro de transfusão de ^2, com amostras contendo quantidades normais de células vermelhas do sangue, plasma e plaquetas. Este método utiliza heparina ou hirudina sangue anticoagulado, implicando o envolvimento ou não limitada de hemóstase secundário, que é dependente da geração de trombina e cálcio ionizado (Ca ^2+). Para apoiar a formação de trombina e, portanto, para incluir todos os aspectos da hemostasia sob fluxo microfluídico, foi desenvolvido um método complementar na mesma plataforma técnica, incluindo agora livre ^{de Ca2 +.} Deste modo, a deposição de plaquetas e formação de fibrina pode ser estudada, novamente em um modelo de uma transfusão de plaquetas, para avaliar a qualidade do concentrado de plaquetas.

Neste método, as plaquetas e fibrinogénio são marcados com fluoróforos que totalmente separados espectros de emissão. cor dupla, microscopia de vídeo em tempo real, em seguida, permite a análise deadesão de plaquetas primária, bem como a iniciação da coagulação e deposição de fibrina. Uma variável importante neste tipo de ensaio é de recalcificação, porque a adição de Ca ²⁺ para sangue estático, antes da perfusão, inevitavelmente provocar a coagulação iniciada por contacto no recipiente. Esta iniciação vai polarizar a leitura, devido ao entupimento de tubagem e biochip entradas antes da perfusão. Portanto, no nosso método, citrato de sangue anticoagulado e um tampão molecular contendo ^{Ca2 +} separadamente são bombeados através da parte superior das pernas de uma câmara de entrada em forma de Y. Os componentes são misturados durante a perfusão antes de entrar numa câmara de análise revestidos com colagénio sozinho ou em combinação com o factor tecidular humano recombinante (rhTF). Ao adaptar as velocidades de fluxo das bombas separadas e a concentração de Ca ²⁺ no buffer, uma diluição de 10% da amostra de sangue final tem lugar.

Usando este protocolo estendido, que demonstram a contribuição de coágulosfator ção XII (FXII) e concentração de plaquetas entrar em contato com a iniciação via de coagulação sob fluxo. Os nossos dados também mostram que por revestimento rhTF ao lado de colagénio, a via do factor de tecido pode ser medida simultaneamente.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes éticas institucionais para a pesquisa em amostras humanas, e o consentimento informado foi obtido de todos os doadores envolvidos. Aprovação para as experiências descritas aqui foi obtido do conselho de revisão institucional do Hospital Universitário de Antuérpia (número de aprovação 16/10/120).

NOTA: indicações de temperatura são sempre temperatura ambiente, a menos que especificado.

Configuração 1. A microfluídica

1. Prepare os canais microfluídicos câmara de fluxo, tubulação, e pinos de conexão
   1. Ressuspender o frasco de estoque de colagénio por mistura de vórtice, e depois dilui-se em a solução isotónica de glucose fornecida pelo fabricante, a uma concentração final de 50 ug / mL.
      NOTA: O uso de colágeno de tendão equino, composta principalmente de tipo fibrilas I. O eqüino colágeno tipo I é muitas vezes referida como "Horm" colágeno e é o padrão ouro para este tipo de ensaio, para ambos histórico erazões biológicas. Humana colagénio do tipo III também pode ser utilizada, mas estas fibrilas de revestimento menos bem, e a resposta de plaquetas não é tão forte. Outras superfícies de revestimento também pode ser utilizado, tal como o factor de von Willebrand, fibrinogénio, fibronectina, laminina, vitronectina, trombospondina-1, ou combinações destes ^três.
   2. Tomar um novo, biochip microfluídico descartável com oito, canais e dimensões paralelas retas, em mm, de 0,4 W x 0.1 H x 20 L. Pipet 0,8 mL de colagénio no canal (s) do biochip em uma extremidade e rotular isto como da tomada. Encha apenas 5/6 do comprimento do canal de modo a que as fibrilhas de colagénio não são revestidos na entrada do canal, porque isto pode causar o entupimento, o que impede uma perfusão eficiente.
   3. Incubar a biochip a 4 ° C durante pelo menos 4 horas num recipiente selado e humidificada.
   4. Para estudar o fator tecidual (extrínseca) coagulação mediada em combinação com a via de contacto (intrínsecos), revestimento dos canais com collagen e o factor tecidular humano recombinante (rhTF).
      1. Diluir rhTF em 10 mM de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) -buffered salina (HBS; 0,9% (w / v) de NaCl, pH 7,4, 1: 3000, da concentração: 4,5 nM).
      2. Remover a solução de colagénio de revestimento através da saída. Pipetar 0,8 mL de rhTF em HBS (diluição a 1/500 da concentração estoque, concentração final: 9:00) para a saída do canal, enchendo 5/6 do comprimento do canal, semelhante à estratégia de colagénio-revestimento.
      3. Incubar a biochips para mais 30 min num recipiente selado e humidificada.
   5. Encher os canais revestidos com tampão de bloqueio (1,0% (w / v) de albumina de soro bovino e 0,1% (w / v) de glucose em HBS), a partir da outra extremidade (rotulada como a entrada). Encher um número igual de canais em forma de Y com o mesmo tampão de bloqueio em um biochip mistura.
      1. Certifique-se de todos os canais e braços canais são completamente preenchido com tampão de bloqueio. Incubar tanto biochips para, pelo menos, 1 h num recipiente selado e humidificada.
   6. Para cada canal em utilização, preparar dois tubos de 8 cm de comprimento, a 2 cm de comprimento, 46 ​​centímetros e um comprimento. Coloque um pino numa extremidade dos três tubos mais pequenos e em ambas as extremidades do tubo mais longo.
2. Preparar a bomba de enxaguamento
   1. Lavar todos os fluidos da bomba e a tubulação conectada com água destilada.
   2. Desengordurar fundição do biochip com uma precisão sem pó limpe e álcool desnaturado para remover impressões e poeira.
   3. Preencha toda a tubulação com um tampão de bloqueio antes de os ligar os biochips.
   4. Corrigir o biochip revestido na platina do microscópio automatizado. Fixar o biochip misturar na mesma altura que o estágio do microscópio utilizando uma tomada de laboratório de tesoura.
   5. Ligue o biochip revestido com o biochip misturando usando o tubo mais longo, 46 ​​cm de comprimento. Certifique-se de ambos os biochips estão a uma distância de modo que o tubo forma uma linha flexível, mas em linha reta.
   6. Anexar um pino conector da seringa no tubo de Luer-compatível da bomba de lavagem. Ligue-o para a extremidade livre do tubo de 2 cm e fixar a outra extremidade para a saída da biochip revestido.
   7. Fixe os dois de 8 cm tubulação para a entrada biochip misturando usando seus pinos. Coloque a extremidade livre de cada tubo em um frasco de HBS. Lavar toda a tubulação e todos os canais com 1 mL HBS.
      NOTA: HBS flui do frasco através do tubo de 8 cm para o chip e a mistura através do tubo de 46 cm para o chip revestido (sem revestimento que flui a partir da para a parte revestida), devido à força de tracção da bomba de enxaguamento. Este passo remove o tampão de bloqueio e de colagénio fracamente aderidas (ou rhTF em biochips com revestimento duplo).
3. Preparar as bombas de perfusão
   1. Abra o software do controlador das bombas de perfusão. Inicializar as bombas clicando duas vezes no ícone seringas no software.
   2. Seleccione o tipo de seringa que vai ser usado: seringas de 1 mL para a coagulação bpode ser prejudicado e 2 seringas ml de sangue reconstituído.
4. Ligue as seringas para a construção biochip
   1. Desligue a bomba de lavagem e todos os tubos, exceto para aquele que liga os dois biochips. A tubagem desconectado é reutilizado nos passos seguintes.
   2. Conecte o tubo de 2 cm com seu pino conector da seringa para o bloqueio Luer de uma tubagem de resíduos de paredes espessas. Encher o tubo de parede espessa com solução de pepsina padrão utilizando uma seringa.
      NOTA: A adição de pepsina aos inibe tubagem de resíduos e lisa coagulação pós-perfusão e, portanto, evita o entupimento do sistema de back-end.
   3. Fixar a extremidade aberta do tubo de paredes espessas, com um grampo Kocher. Coloque um recipiente de resíduos adequado com debaixo de água sanitária para recolher o flow-through.
   4. Corrigir o tubo com o seu pino para a tomada de biochip revestido.

2. Preparação de amostras de sangue

1. Recolha de sangue de um voluntário saudável e separar seus componentes ⁴
   1. Recolha de sangue em um recipiente de ácido etilenodiamina-tetra-acético evacuado (EDTA). Utilize este exemplo apenas para a realização de um hemograma completo (CBC) usando um analisador hematológico automatizado.
   2. Recolha de sangue em recipientes de citrato de sódio evacuados. 5 ml de sangue é necessário por canal.
   3. Colocar a amostra (s) em uma reconstituição sangue rotador horizontal pendente.
      NOTA: O ensaio deve ser concluída no prazo de 3 h de flebotomia. amostras de concentrado de plaquetas e de sangue total são do grupo sanguíneo ABO / RhD correspondido.
   4. Centrifugar por 13 minutos a 250 xg para preparar plasma rico em plaquetas (PRP). Não use o freio da centrífuga para não perturbar o pellet ligeiramente comprimido.
   5. Transferir o PRP a um tubo de centrifugação cónico de fresco. Centrifugar durante 10 minutos a 4500 xg (com freio) para sedimentar as plaquetas e preparar plasma pobre em plaquetas (PPP). Descartar o platpellet elet. Incubar o PPP num banho de água a 37 ° C.
   6. Transferir os glóbulos vermelhos empacotados para um tubo cónico de fresco por perfuração do fundo de um original com uma agulha 21 G.
      NOTA: A contagem das plaquetas na fracção residual de glóbulos vermelhos embalados é de 11 ± 4 x 10 ³ por mL (média ± DP, n = 10).
2. reconstituir sangue
   1. Determinar o hematócrito dos glóbulos vermelhos empacotados, preparado no passo 2.1.6 utilizando um analisador hematológico automático.
   2. Determinar a concentração de plaquetas de o concentrado de plaquetas que será usado para a análise utilizando um analisador hematológico automático.
   3. Calcular o volume de células compactadas de sangue vermelho, concentrado de plaquetas, e PPP que irá produzir um hematócrito de 40% e 250 x 10 ³ plaquetas / mL num volume final de 2,5 mL. Misture-os para preparar sangue reconstituído e realizar um CBC.
      NOTA: Outros títulos alvo de células podem ser utilizadas, dependendo thquestão de pesquisa e.
   4. Prepara-se uma amostra de "branco" de controlo em que o volume de concentrado de plaquetas é substituído pelo mesmo volume de solução salina para determinar a concentração de plaquetas "endógeno" (isto é, não-plaquetas sanguíneas bancários).
3. Rotular o sangue reconstituído para plaquetas e fibrinogênio
   1. Pipetar 13 ul de uma solução 10,7 mg / mL de fibrinogénio Alexa Fluor 405-marcado (70 ng / mL de concentração final) num tubo de ensaio e adicionar 1 mL de sangue reconstituído.
      NOTA: O fibrinogénio foi marcada utilizando um estojo comercialmente disponível de acordo com o manual do fabricante.
   2. Misturar outro 1 ml de sangue reconstituído em um tubo de teste contendo 2 ul de 1 mM DIOC ₆ (1 uM de concentração final) ou contendo 2 ul de 5 mM de calceína AM (5 uM de concentração final). Adicionar isto ao tubo que contém o sangue com fibrinogénio, dando um volume final de 2 mL de fibrinogénio em plaquetas e-ssangue tained.
      NOTA: A escolha da solução corante pode depender da questão de investigação ou a preferência do pesquisador ^5. Esteja ciente de que a excitação de qualquer corante pode causar artefatos fotoquímicos.
   3. Misture suavemente por inversão. Incubar a amostra durante 10 min a 37 ° C.
4. Preparar o tampão de coagulação
   1. Preparar tampão de coagulação contendo _CaCl2 10 mM e MgCl ₂ 3,75 mM em HBS. Prepare 1 ml de tampão de coagulação para um canal.
   2. Filtro-esterilizar o tampão de coagulação através de um filtro de 0,2 um. Pré-aquecer este até 37 ° C.

3. Perfusão Assay

1. Concentre-se as ópticas microscópio para as fibras de colagénio aderiram ao fundo do canal. Use contraste de fase ou contraste de interferência diferencial (DIC). Selecione "Z atual definido para as regiões telha selecionados" no software experimento para corrigir digitalmente o foco selecionado.
2. Definir uma região de interesse (ROI) no canal seleccionado utilizando o software de aquisição do microscópio.
   NOTA: O ROI pode ser de qualquer área de superfície escolhido arbitrariamente dentro de um canal de perfusão. É aconselhável não para analisar a formação de trombos de fibrina e geração perto da entrada e a saída, a fim de evitar a aquisição de imagens de trombos distribuídos de forma desigual. A área de superfície ROI deve conter um número significativo de trombos para permitir o nivelamento da variabilidade do sinal de plaquetas individuais. A localização da ROI no plano xy do canal é sempre fixa e determinada antes da perfusão. Se necessário, a parte não revestida do canal pode ser incluído na análise para determinar se as plaquetas se ligam de forma não específica para o plástico biochip.
3. Preparar amostras para perfusão
   1. Montar uma seringa de 1 ml contendo 1 ml de tampão pré-aquecido a coagulação na bomba de perfusão.
   2. Misturar o sangue pré-aquecido reconstituído, invertendo suavemente e carga de 2 mG em uma seringa de 2 mL.
   3. Certifique-se de que todo o ar é removido de ambas as seringas e se conectar cada um para um tubo de 8 cm com um pino de conector de seringa.
   4. Prime os conectores e tubos de ambas as seringas em alta velocidade (400 mL / min) e parar quando tudo está preenchido com tampão de coagulação ou de sangue.
      NOTA: por iniciação do tubo, o tampão de coagulação do sangue e reconstituída será imediatamente misturados no canal em forma de Y do biochip mistura ao iniciar o experimento, evitando a introdução de ar para as câmaras de perfusão.
4. Usando pins, fixar a outra extremidade do tubo tanto para as pernas de divisão do canal em forma de Y na mistura biochip. A perna de fundo é usado para perfusão tampão coagulação e parte superior da perna para o sangue reconstituído.
5. Iniciar a experiência, iniciando a perfusão a 4,4 mL / min para o buffer de coagulação e 44 mL / min para o sangue reconstituído. Remover o grampo Kocher na saída da tubagem de resíduos para permitir perfuSion.
   NOTA: A vazão pode ser alterado dependendo da pergunta da pesquisa. Iniciar um cronômetro para determinar o tempo entre o início do experimento eo início da aquisição de imagem em tempo real.
6. gravar imagens a cada 10 s para 30 min em tempo real usando o software de aquisição e experiência do microscópio. Iniciar a gravação quando a mistura de sangue reconstituído e tampão de coagulação entra no biochip revestido montado na platina do microscópio.
   NOTA: Outras séries de tempo pode ser utilizado, dependendo da configuração experimental. Use uma ampliação de 100X (objetiva de 10X e 10X lentes).

Experiência 4. Terminação

1. Terminar as bombas e a aquisição da imagem após 30 minutos ou mais cedo, se o sinal estiver saturado. Retire todos os tubos e as seringas e descartá-las como resíduos de risco biológico.

Análise 5. Os dados

1. Determinar o crescimento do trombo (fluorescência verde) e formação de fibrina (violeta fluorescence) a cinética com o software de análise de imagem. Os comandos a seguir são específicos para o software usado aqui:
   1. Abra o processamento plugin: costura para costurar as imagens lado a lado por ponto de tempo.
   2. Abra a Análise plugin de imagem para determinar a cobertura da superfície das plaquetas.
   3. Abra a Medida plugin. Definir o ROI desenhando uma região retângulo incluindo todas as fibras de trombos e fibrina; neste protocolo, o ROI é um rectângulo de 637 ^mm2.
      Selecione a guia Todas as exibições para incluir todos os pontos temporais registrados.
   4. Use Criar tabelas para gerar automaticamente uma folha de cálculo que irá conter o valor da intensidade de fluorescência média da região rectângulo seleccionado de cada ponto de tempo.
   5. Salvar as planilhas em formato xml.
2. Abra uma planilha em um programa de planilha para cálculos posteriores.
   1. Subtrair o inicial (background valor de todos os dados).
   2. Traçar o sinal de fluorescência como uma função do tempo de perfusão, tanto para o verde (plaquetas) e os corantes violeta (fibrina).
      NOTA: Leve em conta o tempo entre a inicialização da bomba e o ponto de partida real de aquisição de imagem. A formação do trombo é geralmente um processo de dois passos neste modelo: (1) "lenta" a adesão de plaquetas (isto é, aderência) ao colagénio imobilizado seguido por (2) crescimento do trombo-driven coagulação com um aumento de "rápida" em ambos ligação de plaquetas ( ou seja, a acumulação) e deposição de fibrina (isto é, a coagulação) (Figura 1).
   3. Calcular o declive da adesão de plaquetas e a acumulação por regressão linear; esta inclinação proporciona uma cinética de crescimento de trombos de plaquetas em cada fase da sua formação.
   4. Calcular o declive da coagulação de fibrina e extrapolar esta linha para interceptar o eixo dos X, a determinação do momento do início.

Resultados

A análise dos dados em bruto em tempo real é descrito na Figura 1. Em primeiro lugar, as plaquetas aderem à superfície reactivo, que resulta em um aumento constante na fluorescência verde registada (Figura 1A, i), chamada adesão. Durante esta fase, existe pouca fluorescência violeta, o que indica que não é de fibrina ou é apenas marginalmente formada (Figura 1B). Após a iniciação da coagulação, depósitos de fibrina em rápida fluorescente violeta (iii), e durante esse tempo, plaquetas aumenta fluorescência verde em aproximadamente à mesma taxa, designados aqui como a acumulação de plaquetas (ii). Uma única experiência retorna, portanto, três taxas de aumento de fluorescência (I, II, e III) como um marcador substituto para a velocidade na qual plaquetas e fibrina deposição tem lugar neste modelo. Por outro lado, um momento de início da coagulação (momento de início-de (IV)) é extrapolada, que é um determinante de plaquetaspotencial pró-coagulante.

Na ausência de TF, a iniciação da coagulação é lenta e é executado principalmente através da via de contacto, onde o complexo de tenase intrínseca activa FX através da activação directa de FIX FXI por ⁶ e / ou FXII. Para demonstrar a dependência FXII, 4 uM de inibidor de tripsina de milho (CTI) foi adicionada para inibir a FXII activado (FXIIa) ^7. Esta inibição não afetou a adesão de plaquetas (Figura 2A), mas de coagulação não começou para a duração total arbitrariamente definida da experiência de perfusão (Figura 2B e Suplementar Video 1).

In vitro, o caminho de contacto pode ser iniciada por materiais estranhos como de vidro, ou em ensaios clínicos que utilizam um material mineral tal como o caulino. In vivo, as plaquetas activadas fornecer a carga negativa ^{8 <}/ sup> através da exposição a membranas de fosfolipídios ácidos ^9, como fosfatidilserina, e / ou através da liberação de polifosfatos (pólipo) ^{10, 11.} Os nossos microfluidos em tempo real de ensaio mimetiza o último porque, em uma gama de concentrações de plaquetas, a reacção hemostática dependente da contagem de plaquetas (Figura 3). Ao aumentar o número de plaquetas na amostra reconstituída, a taxa de adesão (Figura 3A), a acumulação (Figura 3B, verde), e a coagulação (Figura 3B, violeta) aumentou linearmente. O momento de início-de encurtado de forma significativa (Figura 3C) através do aumento da concentração de plaquetas, sugerindo que um número limite de (activada) depositado plaquetas é necessário para desencadear a coagulação.

Após a dano tecidual in vivo, no entanto, as células portadoras de TF será initiate a coagulação do sangue através do FVIIa-TF complexo tenase extrínseca na presença de Ca ^2+. Este é imitado em nossa configuração experimental pelo pós-revestimento das câmaras de perfusão contendo colágeno com rhTF lipidada. Numa análise emparelhada de canais revestidos com apenas ou em combinação com colagénio rhTF, coagulação início foi significativamente mais rápida (Figura 4A). A taxa de adesão de plaquetas não era linear, portanto, nenhuma regressão linear pode ser realizada (dados não mostrados). Tanto a taxa de coagulação e a acumulação de plaquetas não era diferente entre condições (Figura 4B-4C, Recurso Vídeo 2).

Figura 1: A análise de regressão de adesão plaquetária e coagulação em câmaras de perfusão microfluídicos. Esta figura esclarece os parâmetros derivados de fluorescência de dados brutos em tempo real adquirida durante o fluxo sanguíneo recalcified sobre uma superfície reativa. (A) A média intensidade da fluorescência verde mostra a deposição plaquetária em função do tempo de perfusão. A curva descreve um processo bimodal, começando com (i) aumentar lentamente a adesão de plaquetas linear seguida por acumulação linear (ii) cresce rapidamente. Ambas as partes linear da curva são regrediu e o declive destes descreve as duas taxas de formação de trombos de plaquetas por fluorescência; (I) a adesão e (ii) a acumulação. (B) A intensidade média de fluorescência violeta mostra a deposição de fibrina em função do tempo. Durante a adesão de plaquetas, a fluorescência violeta é essencialmente ausente, ao mesmo tempo que se desenvolve rapidamente seguinte iniciação da coagulação. O aparecimento de momento-(IV) é definida como a intercepção com o eixo dos x da regressão linear extrapolada de (iii) a segunda fase da formação de trombos de fibrina designado por fluorescência aqui como a coagulação.ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/55351fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Na ausência de TF, a coagulação em câmaras de fluxo de perfusão revestidas com colagénio depende FXIIa. Perfusão de microfluidos de sangue reconstituído contendo CTI ou tampão de controlo (controlo) foi realizada a uma taxa de cisalhamento de 1.000 ^s-1 para um total de 30 min. (A) A taxa de adesão de plaquetas (s ^-1) não era dependente de CTI. (B) O momento de início-de-tratados para amostras CTI foi para além do limite de 30 minutos da experiência (mostrado como uma linha tracejada), o que demonstra a dependência deste parâmetro FXIIa. Bares e pontos são valores médios, bigodes são desvio padrão. A análise estatística foi realizada por teste t pareado. (NS = não significativo, n ≥3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Coagulação sob fluxo depende do número de plaquetas. Experiências de perfusão de microfluidos foram realizadas em câmaras revestidas com colagénio com o sangue reconstituído na presença de ^{Ca2 +} e concentrações variadas de plaquetas (n ≥3). (A) A taxa de taxa de adesão de plaquetas (B) da acumulação de plaquetas (verde) e da coagulação (violeta), e (C) Momento-de-início são apresentados como funções da concentração de plaquetas no sangue reconstituído. Pontos são valores médios, bigodes são desvios-padrão. Por favor clique aqui para ver uma versi maioresem dessa figura.

Figura 4: A activação de ambos TF e via de coagulação de contacto reduz significativamente o momento-de-início da coagulação. Sangue reconstituído, na presença de ^{Ca2 +,} foi perfundido através das câmaras revestidas com colagénio sozinho ou com o colagénio e rhTF para estudar o caminho de contacto só ou uma combinação das vias de contacto e TF. (A) O momento-de-início da coagulação é significativamente reduzido, em câmaras de fluxo contendo TF. (B) A taxa de acumulação de plaquetas durante a coagulação e (C) a taxa de coagulação não são significativamente diferentes entre colágeno apenas câmaras de fluxo ou colagénio e rhTF-revestidos. Bares e pontos são valores médios; bigodes são desvios-padrão. A análise estatística foi realizada por teste t pareado. (NS = não significativo, * P < 0,05, N ≥3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar 1: Na ausência de TF, a coagulação em câmaras de fluxo de perfusão revestidas com colagénio depende FXIIa. O papel da via do contacto é determinada em câmaras de fluxo de perfusão revestidas com colagénio. (A) sequência de imagens de fluorescência cobriu de plaquetas (verde) e fibrina (og�io) (violeta) deposição na ausência de CTI. (B) mesma sequência que o painel A, mas com o canal verde desligado. (C) sequência de imagens de fluorescência cobriu de plaquetas (verde) e fibrina (og�io) (violeta) deposição na presença de CTI. (D) mesma sequência que o painel C, mas com o canal verde desligado.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55351/Supplementary_video_1.avi "target =" _ blank "> Clique aqui para baixar este vídeo.

Suplementar Video 2: Activação de ambos TF e da via de contacto reduz significativamente o coagulação momento-de-início. Para estudar o papel de TF, foram usadas câmaras de fluxo revestidas com colagénio sozinho ou com o colagénio e rhTF. (A) sequência de imagens de fluorescência cobriu de plaquetas (verde) e fibrina (og�io) (violeta) deposição em câmaras de fluxo revestidas apenas com colágeno. (B) mesma sequência que o painel A, mas com o canal verde desligado. (C) sequência de imagens de fluorescência cobriu de plaquetas (verde) e fibrina (og�io) (violeta) deposição em câmaras de fluxo revestidas com colágeno e rhTF. (D) mesma sequência que o painel C, mas com a switc canal verdeele tinha desligado. Por favor clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

A transfusão de concentrados de plaquetas é prescrito para o paciente trombocitopênica para prevenir ou parar o sangramento. O seu impacto clínico foi recentemente destacado em uma revisão histórica da leucemia aguda ^12, lembrando que o aumento das taxas de sobrevivência de pacientes pediátricos nos anos sessenta e setenta foram em grande parte atribuível a melhorias na (plaquetas) medicina transfusional. Os concentrados de plaquetas também são utilizados para limitar a hemorragia no trauma agudo ou durante a cirurgia. Nestas condições, as plaquetas com excelentes propriedades pró-coagulantes que iniciam rapidamente hemostasia são os preferidos, mas concentrados de plaquetas são preparadas a partir de doações de doadores voluntários e, ao contrário de medicação farmacológica, são padronizados pela preparação só, não pelo (química) composição. Portanto, várias questões no domínio dos bancos de sangue não são respondidas, incluindo aqueles sobre as modalidades ideais de doação, condições de armazenamento e práticas de transfusão. No campo de platelet (transfusão) biologia, muitas perguntas sobre a depuração da célula de circulação, a contribuição de plaquetas transfundidas para hemostasia, ou a sua imunologia também permanecem sem resposta.

Inúmeras técnicas de laboratório para análise de função plaquetária estão disponíveis, mas estes abordar principalmente um aspecto singular da função plaquetária, como agregação ou desgranulação ^13. Para avaliar amplamente plaquetas e concentrados de plaquetas, modelos abrangentes de hemostasia são indispensáveis, e estes devem incluir hidrodinâmica. Reologia do sangue é crucial para interpretar correctamente o comportamento das plaquetas durante a hemostase ^{14, 15} ou ^16, trombose, mesmo se a anticoagulação impede ^{Ca2 +} e / ou trombina para participar na presença de citrato ou heparina, respectivamente ^2. Para estudar a interação entre coagulação e função das plaquetas sob fluxo de ¹⁷, ^18, a geração de trombina normal é necessária, e por conseguinte, livre de Ca ^2+, bem. A instalação experimental para o estudo da hemostasia sob estas condições é complexa, porque as medidas para evitar o "artefacto" ou de activação descontrolada da coagulação deve ser feita, tanto quanto possível. Além disso, muitos grupos de pesquisa especializados usar feito por hardware ^{19, 20,} o que provoca substancial variabilidade inter-laboratorial ^5. Limitações típicas desta abordagem, são o uso de recipientes rectangulares, perfis de fluxo não-pulsátil, e revestimentos de superfície não-humanos ^5. O ensaio aqui descrito utiliza ferramentas disponíveis comercialmente e pode, portanto, ser adequado para a normalização.

Uma vez que a reacção da cascata da coagulação pode ser facilmente activada quando o sangue não está contido dentro do corpo humano, a recalcificação controlada é um passo essencial. TO conseguir isso, adição de ^{Ca2 +} deve ser adiada até imediatamente antes da perfusão sobre a superfície de colagénio reactivo, porque, quando o tampão de ^{Ca2 +} é fornecido em grandes quantidades de sangue estática, coagulação inevitavelmente toma lugar, eventualmente, o entupimento da tubagem e dados de polarização interpretação (dados não mostrados). A solução para este problema é a bombear o tampão de ^{Ca2 +} e o sangue separadamente, permitindo a mistura de forças de convecção e de difusão durante a perfusão no seu caminho para a câmara de análise. A mistura completa é conseguida num segmento de 46 cm de tubo entre as câmaras de mistura e de análise. Este comprimento foi calculado para o tempo de permanência óptimo de reagentes para misturar com base nas leis fundamentais de massa e transporte convectivo ²¹ durante a perfusão com o caudal utilizado (1.000 s ^-1). Esta abordagem mostrou controlável e reprodutível.

Contactar ativação da coagulação às vezes é visto como um artefato simplescoleta de sangue e deve ser evitado ao interpretar os tempos de coagulação. Portanto, foi demonstrado que, na ausência de inibidores, a coagulação induzida pelo contacto começa em 16,7 min (± 3,7 min) de perfusão. Na presença de CTI para inibir a activação de contacto FXIIa-mediada, coagulação não é iniciada durante o curso arbitrariamente definida da experiência (30 min). Esta janela de experimentação é suficientemente longo para discernir amostras que são pro- ou anti-trombótico. Apesar de coagulação através da activação de contacto pode ser uma consequência indesejada de sangue entrar em contato com superfícies artificiais, nossos dados demonstram um efeito da dose biológica clara de plaquetas. Isso pode ser importante para a medicina de transfusão, porque os resultados recentes sobre FXII, plaquetas polifosfatos ^10, a distribuição fosfatidilserina ²² e micropartículas de plaquetas ²³ têm realmente reavaliado contato via de coagulação como um importante contribuinte para a hemostasia, eespecialmente no contexto de trombose ^24. Por exemplo, o rendimento variável de transfusões de plaquetas em pacientes ou a expressão fosfatidilserina variável de plaquetas inclinadas pode, assim, induzir a variabilidade na eficácia terapêutica de coagulação se bem sucedida é mostrado para depender destes factores.

Por co-imobilização rhTF lipidado com colagénio, a via de coagulação extrínseca, ou via TF, é activado durante a deposição de plaquetas em colagénio. Este estende-se o ensaio para o seu modo mais abrangente, como um modelo para ferimentos que trazem o sangue em contacto com as células e tecidos de suporte de TF. Os nossos dados mostram que a co-imobilização do colagénio e TF diminui o momento de início da coagulação, mas não altera a taxa de coagulação. É de notar que a quantidade de rhTF imobilizado à superfície é uma variável importante neste modelo ^{25, 26} e deve ser normalizada dentro de um determinado estudo. Na presenCE de CTI, a via de TF pode ser estudada exclusivamente (não mostrado) por activação de contacto é evitado.

Em conclusão, a nossa configuração experimental combina um modelo de transfusão por reconstituição de sangue trombocitopênica com plaquetas inclinadas e um modelo de hemostasia por deposição de plaquetas dependente de cálcio e formação de fibrina sob fluxo hidrodinâmico. Este ensaio será utilizado para responder a perguntas sobre a natureza pró-coagulante de plaquetas inclinadas e as técnicas de preparação de concentrado de plaquetas efeitos tem sobre este assunto.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 mL	BD	A00434
Seringa de 10 mL	BD	309604
Seringa de 2 mL	BD	307727
Alexa Fluor 405	Life Technologies	A30100	O manual do fabricante foi seguido para rotulagem do
vacutainer de	Becton, Dickinson and Company	368650	Agulha de coleta de sangue com suporte pré-anexado
Tubo de vácuo BD com EDTA	Becton, Dickinson and Company	368856
tubo vacutainer BD com citrato de sódio	Becton, Dickinson and Company	366575
Tampão de bloqueio	na preparação da casa	na preparação da casa	1,0% (p / v) de albumina de soro bovino e 0,1% (p / v) de glicose na HBS
Calceína AM	Sondas moleculares	C1430
Tampão de coagulação	na preparação da casa	preparação in house	10 mM CaCl2 e 3,75  mM MgCl2 em
tubo cônico HBS 15 mL	Greiner bio-one	1888271
tubo cônico 50 mL	Greiner bio-one	227261
inibidor de tripsina de milho (CTI)	Enzyme Research Laboratories	CTI
Álcool desnaturado	Fiers	T0011.5
DiOC6	Sigma-Aldrich	318426	3,3′-Iodeto de dihexiloxacarbocianina - solução de 1 mM em bomba
microfluídica DMSO Exigo	Cellix	EXIGO-PC-FS7.0-MF
Fibrinogênio	Sigma-Aldrich	F3879	Rotulado internamente com AF 405 - concentração de estoque 10.7  mg/mL
Analisador de hematologia	Sysmex	pocH-100i
HEPES tamponado com solução salina (HBS)	in house preparação	em casa	10 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico salino tamponado (HEPES) (0,9% (p/v) NaCl), pH 7,4
Horm Collagen	Takeda/Nycomed	1130630	Colágeno nativo do tendão equino (tipo I) Solução isotônica de glicose para diluir o colágeno é caixa umidificada suplementada
	Cellix	HUMID-BOX
Banho-maria de incubação	GFL	1013
Microscópio	Zeiss	Axio Observer Z1	equipado com colibri-LED e câmera CCD de alta resolução
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	Multiflow8
Marca		A03429
Ponteiras de pipeta 100-1000	Greiner bio-one	740290
Ponteiras de pipeta 1-10	Eppendorf	A08928
Ponteiras de pipeta 2-200	Greiner bio-one	739280
Agitador orbital de concentrado de plaquetas	Helmer	PF-48i
Toalhetes de precisão	Kimtech	5511
Solução de pepsina	Instrumento Hanna	HI7073L	2 g de pepsina por 75 ml de solução, solução de limpeza de proteínas com pepsina
Fator de Tecido Humano Recombinante Innovin	Dade Berhing	B4212-40	rhTF com fosfolipídios sintéticos
Microscópio de software	Zeiss	N / A	ZEN 2012
Dispositivo de encaixe estéril	Terumo BCT	TSCD
Centrífuga de mesa	Eppendorf	521-0095
Rolo de tubo	Ratek	BTR5-12V
Selador de tubulação	Terumo BCT	AC-155
Vena8 pino conector de seringa	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro + Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	Biochip revestido
Vena8 Agulhas	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Tubulação	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 Biochips	Cellix	VDY1-400-100-01-02	Misturador
vórtice	VWR	58816-121
ZEN2012 software	Zeiss