A prevenção da triquinose humana em muitos países do mundo baseia-se na análise laboratorial de amostras de músculo de animais susceptíveis por métodos de digestão, dos quais o método de agitador magnético é considerada o padrão ouro.
Artigo de método
Método agitador magnético para Detecção de
Neste artigo
Resumo
Resumo
Triquinose é uma doença debilitante em seres humanos e é causada pelo consumo de carne crua ou mal cozida de animais infectados com larvas de nematóides do género Trichinella. As fontes mais importantes de infecções humanas em todo o mundo são carne de caça e carne de porco ou produtos suínos. Em muitos países, a prevenção da triquinelose humana baseia-se na identificação de animais infectados por meio da digestão artificial de amostras de músculo de carcaças de animais susceptíveis.
Existem vários métodos baseados na digestão da carne, mas o método de agitador magnético é considerada o padrão de ouro. Este método permite a detecção de larvas de Trichinella por microscopia após a digestão enzimática das amostras de músculo e subsequentes passos de filtração e sedimentação. Embora este método não requer equipamento especial e caro, controlos internos não pode ser utilizado. Portanto, a gestão de qualidade rigoroso deve ser AplicD ao longo do teste. O objetivo do presente trabalho é fornecer instruções de manuseio detalhadas e pontos críticos de controle do método com analistas, com base na experiência do Laboratório de Referência da União Europeia para Parasitas e do Laboratório Nacional de Referência da Alemanha para Trichinella.
Introdução
Nemátodos do género Trichinella pode ser detectado em músculos estriados de carnívoros e onívoros mamíferos, aves e répteis em todo o mundo. Estes nematóides zoonóticas pode atingir os seres humanos quando crus ou carne semi-cru e produtos de carne derivados de suínos, cavalos e animais de caça são ingeridos. Esta zoonose pode ser uma doença grave em humanos caracterizados por sinais patognomônicos e sintomas, por exemplo, diarreia, febre, edema periorbital e mialgia e possíveis complicações como miocardite, doença tromboembólica e encefalite 1.
Trichinella spiralis é o agente etiológico mais comum de infecção por triquinas em animais domésticos e selvagens e faz com que a maioria das infecções humanas em todo o mundo. Na Europa, Norte e Oeste da África e Ásia Ocidental, Trichinella britovi é outra fonte de infecções humanas. Além disso, outros dez táxons são menos comumente relatada como o causador agentes da doença humana e são encontrados em diferentes regiões do mundo, geralmente em 2 animais selvagens. Além de animais selvagens, como javalis, ursos, morsas e texugos, carne de porco representa a mais importante fonte de infecção humana no mundo inteiro.
A melhor maneira de evitar a triquinose é abster-se de comer produtos de carne crua e cozinhar qualquer carne, especialmente carne de caça a temperaturas seguras (> 65 ° C durante 1 min, ou seja, para mudar a cor da carne do rosa ao marrom no núcleo do produto de carne) 3. A União Europeia e USDA tenha especificado tempos e temperaturas de congelamento e de culinária para os produtos suínos que podem ser usados para matar larvas de T. spiralis na carne 4, 5. Além disso, as recomendações para a inactivação de triquinas na carne e produtos à base de carne foram publicados pela Comissão Internacional sobre a triquinose"xref"> 6. Na Europa, além da introdução de condições de habitação controladas em rebanhos suínos comerciais onde o risco de infecção Trichinella é desprezível, a prevenção da triquinose humana baseia-se na análise laboratorial de amostras de músculo de animais suscetíveis 4.
Para fins de segurança alimentar, ensaios de digestão são os únicos procedimentos confiáveis para a detecção direta de larvas de triquinas na carne 3, 7. Mesmo se houver várias variações do ensaio de digestão, o método de agitação magnética é o método internacionalmente aceite de referência 3, 4, 7. Este ensaio baseia-se na detecção de Trichinella larvae em tecidos do músculo estriado. Após a digestão enzimática de amostras de músculo e subsequentes etapas de filtração e sedimentação, Trichinella larvas são identificados por microscopia. Dependendo obrigações comerciais e legislação nacional, há uma infinidade de pequenas variações no protocolo geral do método de agitador magnético. Aqui, detalhes técnicos são baseados nas exigências da UE 4, especificações ISO 8, diretrizes de TIC 6, ea experiência do Laboratório de Referência da União Europeia para Parasitas (EURLP) e do Laboratório alemão de referência para Trichinella.
Protocolo
1. Preparações
- coleta de amostras
Nota: O método de agitador magnético pode ser utilizado para as amostras musculares individuais ou agrupados.- Recolher amostras dos locais de predilecção apropriados e em uma quantidade adequada 9. Refira-se às exigências do país ou para as recomendações de TIC, OIE ou ISO.
- Para a União Europeia, por exemplo, tirar uma amostra de 1 g de um dos pilares do diafragma na zona de transição para a parte tendinosa de suínos domésticos. Certifique-se de que todas as amostras musculares estão livres de toda a gordura e fáscia.
- Se a língua é testado, remover a camada superficial antes do teste.
- Tome cuidado se as amostras são congeladas, como a maioria das larvas Trichinella não são congelar resistente e desenrole após a morte, são menos resistentes à digestão e tendem a aderir às paredes do recipiente, resultando em diminuição da sensibilidade do ensaio.
Nota: Se congelado, o dobro do tamanho da amostra em lleste e aumentar o tempo de sedimentação (ver abaixo).
- Recolher amostras dos locais de predilecção apropriados e em uma quantidade adequada 9. Refira-se às exigências do país ou para as recomendações de TIC, OIE ou ISO.
- Preparação do líquido de digestão
- Adicionar HCl a 25% (16 ± 0,5 mL) para 2 L de água da torneira pré-aquecida a 46-48 ° C em um copo de vidro de 3 litros. Muito baixo de uma temperatura resulta na digestão incompleta; muito alto de uma temperatura desactiva as propriedades enzimáticas da pepsina.
- Colocar uma barra de agitação no recipiente, e agita-se a solução sobre uma placa pré-aquecida (46-48 ° C).
- Adicionar 10 ± 0,2 g de pepsina (1: 10000 NF, 1: 12500 BP, 2000 FIP) para a solução ácida.
Nota: A qualidade da pepsina é de extrema importância e atividade da enzima deve ser certificado pelo produtor. Por razões de segurança laboratoriais e manter a actividade da pepsina, a sequência da adição de componentes de fluidos de digestão devem ser respeitados.
- Preparação de amostras do músculo
- Pique até 100 g de amostras de músculo em um liquidificador ou moedor. Para facilitar blending, adicione 2 mL pré-aquecido água para as amostras e misture em velocidade máxima para 2 - 3 s.
- Antes da segunda mistura, abrir o misturador e transferir qualquer amostra de músculo no topo da margem da borda tigela de mistura para a parte inferior e a mistura de repetição. Continue misturando com rajadas de 2 - 3 s até que não haja pedaços visíveis de carne permanecem.
Nota: Muito pouco de mistura pode resultar na digestão incompleta, enquanto muito mistura pode danificar o Trichinella larvas presentes nas amostras 6.
2. Procedimento
- Digestão de amostras do músculo
- Transferir 1 L de fluido de digestão em forma de cilindro. Transfira a carne moída no copo e difundir no fluido de digestão com uma colher ou garfo. Enxaguar a taça tampa do copo misturador, lâmina e liquidificador com 500 ml do líquido de digestão pré-aquecido para a 3 L proveta.
Nota: lavagem incompleta pode resultar na perda de Sensitivity. - Cobrir a proveta com folha de alumínio e manter uma temperatura constante de 44-46 ° C e monitor com um termómetro.
- Agita-se a digestão de fluido durante 30 min para criar um vórtice sem salpicos de profundidade até que as partículas de carne desapareçam. Dependendo do tipo de carne testada (por exemplo, carne de animais selvagens), aumentar o tempo de digestão, até um máximo de 60 minutos.
- Transferir 1 L de fluido de digestão em forma de cilindro. Transfira a carne moída no copo e difundir no fluido de digestão com uma colher ou garfo. Enxaguar a taça tampa do copo misturador, lâmina e liquidificador com 500 ml do líquido de digestão pré-aquecido para a 3 L proveta.
- A filtração e sedimentação do líquido de digestão
- Para determinar a quantidade de tecido não digerido, ajustar a escala a zero, pese a peneira antes de usar, e anote o seu peso. A peneira deve estar limpa e desprovida de quaisquer partículas de tecido, o que poderia dificultar as larvas Trichinella atingir o funil de sedimentação. Verifique se o funil de separação é nivelado verticalmente.
- Após a digestão, enchimento com o líquido de digestão através de um crivo de 180 um para uma ampola de separação de vidro. A largura do funil de separação de vidro não deve be maior do que 55% do comprimento para permitir uma boa sedimentação larva. Tome cuidado para evitar qualquer excesso.
- Para evitar a perda de sensibilidade, lavar bem o copo de vidro e a peneira com cerca de 200 ml de água da torneira de um frasco de lavagem e transferir a água da lavagem para o funil de sedimentação de vidro. Ter o cuidado de lavar cuidadosamente as bordas do recipiente de 3 L. Levantar o crivo e lavar a área sob a peneira completamente.
- Determinação da quantidade de tecido não digerido
Nota: devido a erros na execução do método, o tecido muscular pode permanecer no peneiro, como bem fáscia e do tecido conjuntivo, que não são digeríveis. A quantidade de tecido não digerido é determinada durante o primeiro passo de sedimentação de 10 minutos (ver 2.5). Isto permite cerca de 30 min para a peneira para secar, tal como água residual pode influenciar o peso determinado do tecido não digerido.- Coloque uma toalha de papel em uma escala, e pesar o crivo que tem os undigestecidos ted.
- Subtrair o peso peneira antes da filtração do peso peneiro com tecidos não digeridos. O processo de digestão é considerada satisfatória se não mais do que 5% do peso inicial da amostra permanece no peneiro (isto é, 5 g / 100 g de material de partida).
- Se a quantidade de tecido não digerido é superior a 5%, repetir o teste usando amostras de músculo fresco. Se o tecido restante é predominantemente composta de tecido muscular não digerido e amostras frescas não estão disponíveis, digerir os restos não digeridos novamente e analisar, em adição às amostras originais.
- A sedimentação do líquido de digestão
- Manter o líquido de digestão filtrada no funil de separação durante 30 min. Se deixado em repouso, as larvas Trichinella vai assentar no fundo do funil.
- Se forem utilizadas amostras congeladas, aumentar o tempo de sedimentação para um máximo de 60 minutos.
- Uma vez que a sedimentação é completa, abra totalmente a torneirado funil de separação para permitir que, pelo menos, 40 ml do fluido de digestão rápida fugir em um cilindro de medição (80 mL se amostras do músculo tinha sido previamente congelado).
- Em primeiro lugar, vamos metade do fluido para dentro do cilindro e, em seguida, abrir completamente a válvula na direcção oposta para permitir que 10 mL de fluido de digestão para passar. Finalmente, abrir a torneira de passagem no sentido oposto por mais 10 ml. Este procedimento garante que Trichinella larvas não são presos na torneira.
Nota: velocidade suficiente é necessária para evitar larvas restante no funil de separação, diminuindo a sensibilidade.
- A sedimentação do líquido de digestão no cilindro
- Deixar o sedimento no cilindro, durante 10 min para permitir que as larvas se sedimentar. Retirar 30 ml de sobrenadante por aspiração com uma pipeta, sem perturbar o sedimento de 10 mL.
- Para reduzir a quantidade de fibras de tecido na amostra, adicionar 30 mL de água da torneira para o sedimento e sair para o outro a 10 m. Repita até que o líquido é clara.
- Remover o sobrenadante e transferir os 10 ml lavado sedimentos para uma placa de Petri em grade ou bacia para a contagem das larvas. Lavar o cilindro com 10 mL de água da torneira e, em seguida, adicionar a água à amostra.
Observação: Como grandes quantidades de detritos no interior da amostra pode impedir a identificação das larvas Trichinella (Figura 1), mais passos de lavagem deve ser realizada, se necessário.
- Exame microscópico
- Use um triquinoscópio ou um estereomicroscópio com uma fonte de luz sub-estágio transmitida de intensidade ajustável em um 15 a ampliação de 20x para examinar as amostras imediatamente após as etapas de lavagem.
- Após o vazamento da amostra na placa de Petri em grade, examine o prato / bacia sistematicamente rede pela grade. Se não houver estruturas suspeitos são encontrados, mova suavemente o líquido na placa de Petri em grade ou bacia para a contagem das larvas em uma forma circular para permitir que qualquer la Trichinellarvae, que foram potencialmente negligenciado, a acumular-se no centro da placa de Petri. Repetir o exame.
- Se uma estrutura suspeito é encontrado, aumentar a ampliação de 40 - 100X. Remover Trichinella larvae do prato / bacia com uma pipeta e recolher num tubo com 90% de etanol.
- Após o prato completo foi examinado, repetir o procedimento, a partir da agitação suave do prato / bacia. Repita o procedimento pelo menos três vezes ou até não mais larvas são encontradas.
- Contar o número de larvas. Correlacionam-se com a quantidade de tecido muscular testado e presente como larvas por grama (GLP).
- Se muitas larvas estão presentes no fluido de digestão para determinar o número de larvas de forma confiável, o retorno do fluido contendo as larvas para o cilindro de medição, enxaguar com água da torneira de um frasco de lavagem, e deixar que as larvas se depositam no fundo.
- Depois de um tempo de sedimentação de 10 minutos, reduz-se o sobrenadante a um volume definido (por exemplo,10 mL). Para determinar o volume exacto, transferir o sobrenadante para um novo cilindro com uma pipeta.
- Suspender larvas homogeneamente no fluido, por agitação vigorosa. Durante o movimento de agitação, adicionar 12 gotas de 20 ul de suspensão de larvas para uma placa de Petri.
- Examine cada gota por microscópio. Determinar o número de larvas em 240 mL e apagar a contagem mais alta e mais baixa. Extrapolar o número de larvas para o volume total (por exemplo 10 ml) de sobrenadante.
Nota: A qualidade do microscópio estéreo é de suma importância para a identificação de larvas de Trichinella. - Quando as larvas são coletadas em um tubo por uma pipeta, verifique cuidadosamente que as larvas não ficar na parede da pipeta, mas transferidos para o tubo.
Nota: achados triquinas positiva a partir de amostras colectivas deve ser rastreada a partir da piscina para a carcaça de origem. Aqui, o tamanho da piscina deve ser progressivamente reduzido até que a carcaça positiva é idencado. O tamanho da amostra também pode ser aumentada durante este processo para aumentar a sensibilidade. Sempre que o exame de uma amostra colectiva produz um resultado positivo ou duvidoso, uma amostra de 20 g é retirada de cada porco. As amostras de 20 gramas provenientes de cinco suínos devem ser reunidas e examinadas usando o método descrito. Desta forma, serão examinadas amostras de 20 grupos de cinco suínos. Se forem detectadas triquinas numa amostra combinada de cinco suínos, amostras de 20 gramas são recolhidos a partir dos porcos individuais no grupo e cada um é examinado separadamente até que seja detectada a carcaça positiva de origem.
Resultados
Após a digestão, a forma das larvas infectantes muscular pode variar, tornando a identificação mais difícil. Formas típicas incluem larvas bem enrolada, larvas levemente enrolada ou em forma de C ou larvas completamente desenrolado (Figuras 2B - 2C). O número de larvas encontradas por grama pode variar consideravelmente e pode variar de uma larva de algumas centenas de larvas.
A morfologia da larva músculo infecciosa é mostrado na Figura 2A. Trichinella larvas são de 0,7 a 1,5 mm de comprimento e aproximadamente 0,3 mm de largura. O esôfago é estreito e tem uma extremidade ligeiramente arredondada. A cutícula é suave. Na metade anterior da cavidade do corpo, o stichosome, uma estrutura constituída por um tubo delgado longo rodeado por uma fileira de 45 a 55 células grandes (stichocytes), pode ser observada. O reto também é arredondada, sem quaisquer projecções ou apêndices 10, 11.
t "> Outras estruturas, além de larvas de Trichinella, podem ser encontrados após a digestão do músculo Alguns exemplos são mostrados nas Figuras 3A -.. 3F animais selvagens são frequentemente infectados com outros parasitas ou as amostras de músculo disponíveis para testes são contaminadas durante o processo de evisceração por animado ou estruturas inanimados / organismos. o comprimento das larvas, a aparência das extremidades anterior e posterior e a ocorrência da ajuda stichosome para discriminar entre os vários géneros de nemátodos 12.
Figura 1: exame microscópico de Trichinella Larvas após (a) insuficiente e (B) Passos Enxaguamento suficiente. As barras de escala indicam a 100 uM. Por favor clique aqui para ver uma maior version desta figura.
Figura 2: Morfologia do infecciosa Trichinella Larvas Mostrando reto, Stichosome e Esôfago do Larva (A). Possíveis formas de larvas muscular após digestão que mostra (B) bem enrolada e levemente enrolada larvas e (C) que se move desenrolado larvas. As barras de escala indicam a 100 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplos de Achados ao fundo após a digestão de Muscle As amostras com o Magnetic Método Agitador. (A) de cabelo cerdas-like deverme terra encontrada em javali; (B) Alaria alata de javali; (C) da fibra muscular de javali; (D) Metastrongylus sp. de javali; Fibras (E) planta encontrada no javali (F): Toxocara sp. larva de javali. As barras de escala indicam a 100 uM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
Embora o método de agitador magnético pode ser facilmente realizada, não cumprir rigorosamente a detalhes técnicos leva a sensibilidade insuficiente, pondo assim em risco a saúde do consumidor. Os pontos críticos de controle foram destacadas no texto acima. Além disso, a utilização de equipamento adequado é crucial para o resultado positivo do teste. Todos os navios devem ser feitas de vidro e pipeta pontas revestidas com silicone para reduzir a aderência de larvas para a superfície.
A sensibilidade do método de digestão depende da densidade larvar nos músculos e a quantidade de amostra de músculo testado. Para obter uma densidade larvar de 3-5 gpl de tecidos musculares, uma sensibilidade de 100% foi relatado, mas abaixo de 1 gpl a sensibilidade caiu para 40% 13. Dependendo da espécie hospedeira animais testados, a sensibilidade do teste pode ser melhorada através do aumento da quantidade de amostra utilizada. o ifardo nfection em vida selvagem é geralmente baixa, portanto, maiores tamanhos amostras são utilizados 14. Os locais de predilecção também variam entre os animais hospedeiros. Aqui, a digestibilidade inferior de alguns tecidos musculares, tais como a lingueta deve ser tomado em consideração, que também pode resultar em tamanhos de amostra maior 15.
Além disso, é importante entender que o método de agitação magnética não incluir controlos internos. Portanto, o gerenciamento de garantia de qualidade da amostragem de documentação é essencial para obter resultados precisos e precisos. A qualidade do desempenho do laboratório para detecção de triquinas larvas em amostras do músculo deve ser monitorizada através da participação regular de cada analista em ensaios de proficiência.
Outras limitações do método são que a etapa de identificação do final do músculo larvas por microscopia é altamente subjectiva e HEAvily dependente do conhecimento da morfologia das larvas pelo analista examinar.
Um método alternativo interessante para contornar este problema é o método agitador magnético / isolamento por filtragem seguida por detecção de larvas por um teste de aglutinação em látex. No entanto, de acordo com a legislação da UE este método só é considerado equivalente para o ensaio de carne de suínos domésticos, mas não para os animais que estão em maior risco de infecção como javali 4. A identificação do antigénio de larvas com anticorpos monoclonais torna o teste mais objectiva, mas nega o laboratório a possibilidade de determinar o número de larvas por grama de carne 16.
Outras variações do método de agitador magnético incluem a técnica de método / sedimentação digestão de amostras combinadas assistida mecanicamente, a escavação amostra colectiva assistida mecanicamenteMétodo estion / na técnica de isolamento do filtro, eo método de digestão automática de amostras combinadas técnica de até 35 g. Estas técnicas são todas baseadas na digestão artificial da carne e a visualização e a contagem de larvas de Trichinella, mas diferem no equipamento utilizado para os passos de filtração e sedimentação.
As larvas isolado pode ainda ser identificado ao nível da espécie por um teste molecular (por exemplo, PCR multiplex) 17. De acordo com a legislação da UE, todas as amostras positivas devem ser encaminhadas para o laboratório nacional de referência ou para EURLP para a determinação da espécie de triquinas.
Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Pedimos gentilmente agradecer Sabine Reckinger para excelente assistência técnica e apoio.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Faca, Tesoura, Pinça | Corte amostras e remoção de tecido não digerível | ||
| Liquidificador | Com uma lâmina cortante afiada | ||
| Agitador | Com placa de aquecimento controlada termostaticamente | ||
| Haste | Revestida a teflon, com aproximadamente 5 cm de comprimento | ||
| Funil | Capacidade de pelo menos 2 L, de preferência equipado com tampões de segurança de Teflon. A largura não deve ser maior que 55% do comprimento para permitir uma boa sedimentação da larva. | ||
| Suportes, anéis e braçadeiras | |||
| Peneira | Tamanho da malha 180 microns, diâmetro externo 11 cm, com malha de aço inoxidável | ||
| Funil | Diâmetro interno não inferior a 12 cm, para apoiar as peneiras | ||
| Copo | Capacidade 3 L | ||
| Cilindro | Capacidade 50 a 100 mL, ou tubo de centrífuga | ||
| Stereo-microscópio | Com uma fonte de luz transmitida subestágio de intensidade ajustável ou triquinoscópio com mesa horizontal | ||
| Placas | de Petri9 cm de diâmetro, marcados na parte inferior em 10 &vezes; Áreas de exame quadradas de 10 mm usando um instrumento pontiagudo ou uma bacia de contagem de larvas para o tricinoscópio | ||
| Folha | Alternativamente, uma tampa para cobrir os copos | ||
| Ácido | |||
| Pepsina | Força: 1:10.000 NF (Formulário Nacional dos EUA) correspondendo a 1:12.500 BP (Farmacopeia Britânica) e a 2.000 FIP (Fé d & eacute; ração internacional de farmácia), ou pepsina líquida estabilizada com mínimo de 660 unidades da Farmacopeia Europeia/mL | ||
| Etanol | 70-90% de álcool etílico | ||
| Água da torneira | Aquecida a 46-48 ° C antes de usar | ||
| Balança | Precisão de pelo menos 0,1 g | ||
| Bandeja | Capacidade 10 a 15 L, para coletar o suco digestivo restante | ||
| Pipetas e porta-pipetas | Tamanhos diferentes (1, 10 e 25 mL) | ||
| Termômetro | Precisão de 0,5 ° C, faixa de temperatura pelo menos de 20 & C a 70 ° C | ||
| Sifão | Para água da torneira |
Referências
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Reimpressões e permissões
