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Artigo de método

Maturação de cardiomiócitos estaminais humanas derivadas de células em Biowires Usando Electrical Stimulation

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DOI:

10.3791/55373

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6 de maio de 2017

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Heart & Stroke/Richard Lewar Centre of Excellence, University of Toronto, 4Laboratory of Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Neste artigo

Resumo

A plataforma biowire cardíaca é um método in vitro utilizado para amadurecer embrionário humano e cardiomiócitos derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (HPSC-CM) através da combinação de cultura de células tridimensional com estimulação eléctrica. Este manuscrito apresenta a configuração detalhada da plataforma biowire cardíaca.

Resumo

cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (HPSC-CMS) têm sido uma fonte de células promissor e, assim, encorajados a investigação de suas possíveis aplicações na pesquisa cardíaca, incluindo a descoberta de medicamentos, modelagem de doença, a engenharia de tecidos e medicina regenerativa. No entanto, as células produzidas por protocolos existentes exibir uma gama de imaturidade comparado com cardiomiócitos ventriculares adulto nativas. Muitos esforços têm sido feitos para amadurecer HPSC-CMs, com apenas maturação moderada alcançado até agora. Portanto, um sistema de engenharia, chamado biowire, foi concebida, fornecendo pistas tanto físicas e eléctricas para levar HPSC-MC para um estado mais maduro in vitro. O sistema utiliza uma plataforma microfabricado para semear HPSC-CMs em colagénio do tipo I gel ao longo de um fio de sutura molde rígido para montar em tecido cardíaco alinhados (biowire), que é submetido a estimulação do campo eléctrico com uma frequência progressivamente crescente. Em comparação com os controlos não estimulados,estimulada biowired cardiomiócitos exibem um maior grau de maturação estrutural e electrofisiológica. Tais alterações são dependentes da taxa de estimulação. Este manuscrito descreve em detalhe a concepção e criação de biowires.

Introdução

terapia baseada em celular é uma das mais promissoras e investigados para alcançar cardíaca reparação / regeneração. Ele foi auxiliado por engenharia de tecidos cardíaco e o co-entrega de biomateriais 1, 2. A maioria das fontes celulares disponíveis têm sido estudados em modelos animais para os seus efeitos potencialmente benéficos sobre danificados, doentes, ou corações com idades entre 3. Em particular, os esforços significativos foram feitos para usar células-tronco pluripotentes humanas (HPSC) derivada de cardiomiócitos (HPSC-CM), uma fonte de células autólogas potencialmente ilimitado para a engenharia de tecido cardíaco. HPSC-CMs pode ser produzido usando vários protocolos estabelecidos 4, 5, 6. No entanto, as células obtidas a exibir os fenótipos fetais semelhante, com uma gama de características imaturas em comparação com cardiomiócitos ventriculares do adulto 7, 8. Isso pode ser um obstáculo para a aplicação de HPSC-CMs como modelos de tecido cardíaco de adultos na pesquisa de descoberta de drogas e no desenvolvimento de adultos modelos de doenças cardíacas 9.

De modo a ultrapassar esta limitação de imaturidade fenotípica, novas abordagens têm sido investigado activamente para promover a maturação de cardiomiócitos. Os primeiros estudos revelaram propriedades pró-maturação eficazes em cardiomiócitos de ratos neonatais através cíclico mecânico 10 ou estimulação eléctrica 11. Compactação do gel e estimulação mecânica cíclico também foram exibidas para melhorar alguns aspectos da HPSC-CM maturação 12, 13, com realce mínimo das propriedades de manuseamento electrofisiológicos e de cálcio. Portanto, um sistema de plataforma chamado "fio biológica" (biowire) foi concebido, fornecendo ambas as pistas estruturais e estimulação do campo eléctricon para melhorar a maturação de HPSC-CMs 14. Este sistema utiliza uma plataforma microfabricado para criar tecido cardíaco alinhados que é passível de estimulação do campo eléctrico. Isso pode ser usado para melhorar a maturidade estrutural e eletrofisiológica da HPSC-CMS. Aqui, descrevemos os detalhes de fazer tais biowires.

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Protocolo

1. Projeto mestre e fabricação

NOTA: Use litografia suave para a fabricação do dispositivo. Faça um mestre SU-8 de duas camadas para a moldagem de polidimetilsiloxano (PDMS).

  1. Desenhe o dispositivo usando um software de desenho e desenho ( Figura 1A , à esquerda). Desenhe cada camada do mestre separadamente. Imprima o desenho do dispositivo em duas fotomassagens a 20.000 dpi, correspondendo às duas camadas do mestre 15 . Definir o padrão do dispositivo como transparente ea área circundante como escuro; As máscaras servem como molde para transferir opticamente o padrão de dispositivo para SU-8 por litografia (como descrito por outros 15 ).
  2. Distribuir cerca de 4 mL de SU-8 50 no centro de uma bolacha de silício de 4 polegadas. Revestimento do SU-8 50 uniformemente sobre a bolacha usando um revestidor rotativo girando a 2.000 rotações por minuto (RPM) por 30 s. Asse a bolacha numa placa de aquecimento a 95 ° C durante 10 min. Expor a bolacha para ultravioleta (UV) light a 200 mJ / cm 2.
  3. Pour cerca de 4 mL de SU-2050 8 para o centro da pastilha e centrifugação a 2500 RPM, durante 30 s. Coza no 95 ° C placa de aquecimento durante 15 min. Arrefecer até à temperatura ambiente (TA).
  4. Repita o passo 1.3 mais duas vezes.
  5. Cobrir a pastilha revestida com a foto-mascara transparência da primeira camada. Expor a bolacha de luz UV a 270 mJ / cm 2 para fazer a primeira camada. Coza no 95 ° C placa de aquecimento durante 15 min.
  6. Fazer a segunda camada de SU-2050 8, repetindo o passo 1.3 duas vezes.
  7. Alinhar a máscara da segunda camada para as características sobre a primeira camada utilizando um alinhador de máscara. Em seguida, expor a luz UV a 240 mJ / cm2. Cozer a 95 ° C durante 15 min.
    NOTA: O tempo de exposição é determinada pela dose de UV total requerida e a intensidade de saída de luz UV medida no dia antes do uso.
  8. Desenvolver a bolacha, submergindo-o em acetato de propileno glicol monometil éter (PGMEA) e agitação a 200 rpm durante 30 min num agitador orbital.
  9. Lugar, colocaro mestre em uma placa de Petri e cuidadosamente verter a mistura de PDMS (base relativamente ao agente reticulante, na proporção de 10: 1 em peso) no centro da bolacha. Cobrir todas as características e evitar bolhas de ar.
  10. Calor num forno a 70 ° C durante 2 h. Utilizar uma lâmina afiada para cortar em torno da borda do molde biowire PDMS (figura 1A, direita). Descasque as PDMS do mestre. Aparar o dispositivo com a lâmina. Coloque o molde biowire PDMS em uma bolsa de esterilização e de vapor em autoclave a 121 ° C durante 20 min.
  11. Em uma cabine de segurança biológica (BSC), coloque os PDMS biowire modelo para uma placa de Petri. Use pinças para prender e montar um pedaço de fio de sutura cirúrgica esterilizada de seda (6-0) no centro do canal do micropoço PDMS por assentando-o nas ranhuras em ambas as extremidades do canal (Figura 1B-I).

2. Criação da Estimulação Elétrica Câmara

  1. Fazer um par de peças de policarbonato retangular (comprimento x largura x espessura: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) e utilizá-los como a estrutura da câmara de estimulação eléctrica (Figura 2).
  2. Perfurar dois buracos 3 milímetros de largura 2 cm de distância ao longo da linha central de cada peça da estrutura de policarbonato.
  3. Cortar duas peças de 1,5 cm de comprimento hastes de carbono. Perfurar um furo 1 mm de largura através da haste de carbono cerca de 3 mm da extremidade. Um fio de fio de platina através do orifício de haste de carbono e apertar o fio enrolando-o em torno da haste de carbono. Anexar um grampo para a outra extremidade do fio de platina para a ligação posterior com o estimulador eléctrico.
  4. Inserir as varetas de carbono para as peças da estrutura de policarbonato. Coloque a estrutura montada com as varetas de carbono dentro de um poço de uma placa de seis poços.
  5. Pour 2 ml de PDMS no poço. Mergulhe a parte inferior dos quadros de policarbonato em PDMS, mantendo o nível da superfície PDMS perto, mas não chegar ao fundo das hastes de carbono. Calor num forno a 70 ° C durante 2 h.
  6. Leve a câmara de estimulação elétrica dos seis-bem placa e colocá-lo em uma bolsa de esterilização para a esterilização por vapor a 121 ° C durante 20 min.

3. enzimática dissociação de HPSC-CMs

  1. HPSC induzir a diferenciação em cardiomiócitos utilizando um protocolo estabelecido 4.
    NOTA: Resumidamente, gerar cardiomiócitos via corpo embrióide estabelecido (EB) na haste protocolos forma pró através da suplementação sequencial com proteína morfogenética do osso 4, factor de crescimento de fibroblastos básico, activina A, factor de crescimento endotelial vascular, e Dickkopf homólogo 1 4. Use EBs do dia 20-34 de diferenciação para fazer biowires.
  2. Recolher os CEs a partir da placa de baixa ligação com uma ponta de pipeta P1,000 e transferir para um tubo cónico. Sedimentar por centrifugação durante 5 min a 125 xg e RT. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet com pré-aquecida, 37 ° C colagenase de tipo I contendo 1% de desoxirribonuclease I (ADNase I). Incubar a 37 ° C durante 2 hpara a digestão.
  3. Adicionam-se 5 mL de pré-aquecida, 37 ° C do meio de lavagem e centrifuga-se durante 5 min a 125 xg e RT. Descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento com 2 mL de solução de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar a 37 ° C durante 5 min.
  4. Adicionar 1 mL de meio de paragem contendo 3% (v / v) de ADNase I.
  5. Anexar uma agulha 20 G (0,9 mm) para uma seringa de 5 mL e passar a suspensão através de EB que 3-5 vezes.
  6. Adicionar 7 mL de meio de lavagem e centrifugar a 280 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em modificado por Dulbecco Iscove médio (IMDM) e guardar no gelo. Determinar o número de células com um hemocitómetro. Tome 0,5 x 10 6 culas e sedimento por centrifugação a 280 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante.
  7. Pré-cool todos os componentes do gel em gelo antes de misturá-los num tubo estéril. Misturar os seguintes componentes de gel de colagénio (concentração final): 2,1 mg / ml de colagénio tipo I da cauda de rato, glicose 24,9 mM, NaH 23,8 mMCO 3, NaOH a 14,3 mM, HEPES 10 mM e 10% de matriz extracelular em meio 1x M199. Adicione o colágeno e matriz extracelular passado. Misturar por pipetagem cima e para baixo.
  8. Ressuspender 0,5 x 10 6 culas com 3,5 mL de gel de colagénio e misturar bem.
  9. Utilizar uma ponta de pipeta P10 para adicionar 4 uL da suspensão de células para a 0,5 cm de comprimento do canal (Figura 1B-II). Ajustar a posição do fio de sutura com uma pinça estéril se necessário.
  10. Cubra o fundo da placa de Petri com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS), tomando cuidado para não tocar no gel. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
  11. Substituir o PBS com 12 mL de meio de cultura (por exemplo, caule ou pró meio recomendado pelo fabricante de células), o suficiente para cobrir as células (Figura 1B-III). Cultura numa incubadora a 37 ° C durante 1 semana. Alterar o meio de todos os outros dias.

4. Estimulação Elétrica para Biowire Cultivo

  1. DentroO BSC, adicione 2 mL de PBS a cada poço de uma placa de seis poços que vai abrigar uma câmara de estimulador elétrico. Use pinças estéreis para colocar suavemente o dispositivo de estimulação elétrica autoclavado no poço. Descarte o PBS do poço.
  2. Cubra as hastes de carbono com 5 mL de meio de cultura pré-aquecido. Use pinças estéreis para montar os biowires na câmara de estimulação elétrica e orientá-los perpendicularmente às hastes de carbono ( Figura 2 ).
  3. Coloque a tampa em cima da placa de seis poços, mas deixe fios de platina suficientes chegar fora da placa para conectar com o estimulador elétrico. Colocar a placa de seis poços numa incubadora de cultura de células a 37 ° C e ligar o fio de platina ao estimulador eléctrico.
  4. Estimular os biowires usando um estimulador elétrico com a seguinte configuração: pulso repetitivo bifásico, duração de pulso de 1 ms, 3 V / cm, e 1 pulso por segundo (PPS). Aumentar o PPS a cada 24 h para os seguintes valores: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15, e 6. Alterar o meio de todos os outros dias.
  5. Observar a contractilidade dos cardiomiócitos em resposta à estimulação eléctrica sob um microscópio com aumento de 10x.
    NOTA: Depois de uma semana de estimulação, os biowires torna-se maduro (veja a seção de resultados).

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Resultados

O racional para o uso de uma sutura no biowires é servir como um molde para a formação de construções 3D que se alinham em um eixo e imitam a forma de fibras cardíacas. Mostramos que após sete dias de cultura no biowire, as células remodelaram o gel ao redor da sutura ( Figura 3A ). As células foram montadas ao longo do eixo da sutura para formar o tecido cardíaco alinhado ( Figura 3 ). Após 7 dias de pré-cultura, os biowires foram submetidos a 7 dias de...

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Discussão

Este manuscrito descreve a configuração e a implementação da plataforma de engenharia, biowire, para melhorar a maturao de HPSC-CMs. O dispositivo pode ser feito em instalações de microfabricação padrão, e biowires pode ser produzido com técnicas de cultura de células comuns e um estimulador elétrico.

Para nosso conhecimento, não há nenhum método relatado semelhante ao biowires. Esta estratégia revela que a melhoria das propriedades de maturação foram dependentes do regime de estimulação elé...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa-in-aid from the Heart and Stroke Foundation of Canada (G-14-0006265), subvenções de funcionamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (137352 e 143066), e um subsídio da Fundação JP Bickell (1013821 ) à SSN.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido L-ascórbicoSigmaA-4544hPSC-CM composto de meios de cultura
AutoCADAutodesk, IncSoftware para projetar dispositivo
Hastes de carbono, Ø 3 mmComponente da câmara do estimulador elétrico
Colágeno, tipo 1, cauda de ratoBD Biosciences354249Gel de colágeno: 2,1 mg/mL de colágeno de cauda de rato tipo I em 24,9 mM de glicose, 23,8 mM de NaHCO3, 14,3 mM de NaOH, 10 mM de HEPES, em 1x meio M199 com 10% de Matrigel reduzido por fator de crescimento.
Colagenase tipo I SigmaC01300,2% colagenase tipo I (p/v) e 20% FBS (v/v) em PBS com Ca2+ e Mg2+. Esterilize com 0,22 μ m filtrar e fazer alíquotas de 12 mL. Armazene a -20 ° C.
Desoxirribonuclease I (DNase I)EMD Millipore260913-25MUFaça 1 mg/mL de solução de estoque de DNase I em água. Filtre estéril e armazene alíquotas de 0,5 mL em − 20 ° C
Broca e brocas (Ø 1 mm e 2 mm)DremelFaça furos em armações de policarbonato
Estimulador elétricoGrasss88x
Soro bovino fetal (FBS)WISENT Inc.080-450
D-(+)-Glicose SigmaG5767Componente de gel de colágeno
L-GlutaminaThermo Fisher Scientific25030081
H2OMilliQ18.2 MΩ · cm em 25 &graus; C, ultrapuro, para fazer todas as soluções
HEPESSigmaH4034Componente de gel de colágeno
Placa quenteTorrey PinesHS40
Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)Thermo Fisher Scientific12440053
Máscara alinhadoraEVG EVG 620
Matrigel, fator de crescimento reduzido Corning354230Componente do gel de colágeno
Medium 199 (M199)Thermo Fisher Scientific11825015Componente do gel de colágeno
Monotioglicerol (MTG)SigmaM-6145hPSC-CM composto de meio de cultura
Agitador orbitalVWR89032-088
Penicilina/Estreptomicina (P/S)Thermo Fisher Scientific15070063
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Ca2+ e Mg2+ de 14040133Thermo Fisher
Scientific (6 poços)de 353046Corning
(6 poços), baixa fixaçãoCorning3471
Fios de platina, 0,2 mmComponente da câmara do estimulador elétrico
Polidimetilsiloxano (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Éter monometílico de propilenoglicol acetato (PGMEA)Doe & Ingalls Inc.Para desenvolver a bolsa de wafer
, conversores de abertura92308para esterilização a vapor
Wafer de silício, 4 polegadasUniversityWafer Inc.
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)SigmaS5761Componente do gel
de colágeno Hidróxido de sódioSigmaS8045Componente do gel de colágeno
Revestidor de sprinSistemas de revestimento especiaisG3P-8
Meio de cultura StemPro-34Thermo Fisher Scientific10639011Meio de cultura hPSC-CM. Para fazer 50 mL, adicione 1,3 mL de suplemento, 500 μ L de 100 vezes; L-Glutamina, 250 μ L de 30 mg/mL de transferrina, 500 μ l de 5 mg/mL de ácido ascórbico, 150 μ L de 26 μ l /2 mL de monotioglicerol (MTG) e 500 μ L (1 %) penicilina/estreptomicina.
MeioMeio de lavagem:FBS (1:1)
SU-8 50 MicroChem Corp.fotorresistente, componente mestre
SU-8 2050 MicroChem Corp.fotorresistente, componente mestre
TransferrinRoche10-652-202hPSC-CM composto de meios de cultura
Tripsina / EDTA, 0,25%Thermo Fisher Scientific25200056composto de meios de cultura hPSC-CM
MeioIMDM contendo 1% de penicilina / estreptomicina
Placa Placa de parada de lavagem

Referências

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