Preparação de cromossomas se espalha a partir do Mouse espermatócitos

Resumo

Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.

Resumo

Mamíferos meiose é um processo dinâmico de desenvolvimento que ocorre em células germinativas e pode ser estudado e caracterizado. Usando um método para espalhar núcleos na superfície de slides (ao invés de deixá-los de altura), podemos demonstrar uma técnica otimizada em espermatócitos de rato que foi descrita pela primeira vez em 1997. Este método é amplamente utilizado em laboratórios para estudar mamíferos meiose porque produz uma infinidade de núcleos de alta qualidade, passando por substages da prófase I. seminíferos túbulos primeiro são colocados em uma solução hipotônica para inchar espermatócitos. Em seguida, espermatócitos são liberados em uma solução de sacarose para criar uma suspensão de células e núcleos são espalhados em lâminas de vidro encharcada de fixador. Na sequência de imunocoloração, uma diversidade de proteínas pertinentes aos processos meióticos pode ser examinada. Por exemplo, proteínas do complexo synaptonemáticos, uma estrutura tripartida que conecta os cromossomo eixos/núcleos de homologs juntos podem ser facilmente visualizadas. Proteínas de recombinação meiótica, que estão envolvidas na reparação de quebras da dobro-costa de DNA por recombinação homóloga, também podem ser immunostained para avaliar a progressão da prófase eu. Aqui descrevemos e demonstrar em detalhe uma técnica amplamente utilizada para estudar mamíferos meiosis em espermatócitos de ratos machos juvenis ou adultos.

Introdução

Ratos são usados extensivamente como um organismo modelo para estudar meiose em mamíferos. Ambos os processos de desenvolvimento normais e defeitos que ocorrem durante a meiose podem ser avaliados. A linha do tempo e a progressão das características salientes que ocorrem durante a prófase I e substages, bem como uma infinidade de proteínas específicas envolvidas nos processos fundamentais para a regulação da meiose pode ser caracterizado no tipo selvagem e ratos mutantes. Vários processos especializados que ocorrem durante a meiose, que pode ser estudado em detalhe (revisto em Handel e Schimenti¹). Estes incluem formação de ruptura da dobro-Cos....

Protocolo

Todos os métodos envolvendo ratos utilizaram alta ética e padrões de bem-estar e foram aprovados pelo Comitê de uso na faculdade de medicina da Universidade de Drexel e institucional Cuidado Animal.

1. preparação de soluções e instrumentos necessários

1. Prepare o tampão de extração hipotônica (HEB) em 50 mL de água de grau de laboratório ultrapura, pH 8,2-8,4 (tabela 1). Fazer a solução fresca cada vez, lembre-se no gelo e usar até 2 horas de preparação se espalha; Isto é necessário para otimizar a redução e a protease, inibir a atividade dos TDT e PMSF, respectivamente. Use 10 mL de HEB para cada par de testículos de rato.

Resultados

A capacidade desse método para fornecer um grande número de superfície espalhar núcleos contendo homologs intactas depende de três fatores principais: 1) tempo de incubação apropriada dos túbulos seminíferos no buffer hipotônica (ou seja, HEB) para obter adequadamente inchou maturação núcleos que estourou, mas não se desintegram de prolongada incubação em HEB, 2) micropipetting as gotas de sacarose de células para obter uma suspensão separada dos núcleos que não são aglutinados e 3) incli.......

Discussão

Para obter o elevado número de núcleos de maturação bem espalhados, de boa qualidade, as etapas mais críticas do presente protocolo incluem o tempo de incubação apropriada dos túbulos seminíferos no HEB, apropriado de picagem de túbulos seminíferos, e a técnica empregada para a suspensão de células de sacarose se espalhou o fixador slides revestido. Nós incubar túbulos seminíferos dos testículos dos machos de tipo selvagem, variando de pós-Natal dia 15 à idade adulta em HEB para 45 min, enquanto os testículos de comparàv.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Photo-Flo 200	Kodak	1464510
16% Paraformaldeído (solução aquosa de formaldeído)	Microscopia Eletrônica Ciências	RT 15710	Diluir a solução a 16% em estoques de trabalho a 4% com 1X PBS e congelar alíquotas a -20 ° C
Teflon impresso 3 anéis de	Microscopia Eletrônica Sciences	63418-11
Lâminas de vidro de extremidade fosca premium não carregadas	Várias marcas		Limpe as lâminas em álcool etílico ou isopropílico e deixe secar antes de usar; etiquete as lâminas na extremidade fosca com um marcador permanente ou lápis, dependendo do uso subsequente das lâminas
Tesouras cirúrgicas (pontas afiadas e rombas)	Ferramentas	de Ciência Fina14001-12	Diferentes marcas de um tipo semelhante funcionarão
Tesouras cirúrgicas de ponta fina (pontas afiadas)	Fine Science Tools	14058-11	Diferentes marcas de um tipo semelhante funcionarão
Pinças retas de ponta fina	Fine Science Tools	11050-10	Diferentes marcas de um tipo semelhante funcionarão
Pinças de ponta média curvada	Fisher	16100110	Marcas diferentes de um tipo semelhante funcionarão
Cabo de bisturi	Fine Science Tools	10003-12	Marca diferente de um tipo semelhante funcionará
Mouse anti-SYCP3	Abcam	ab97672	Use a 1:300
Proteína anti-centrômero (derivada do soro de paciente CREST humano)	Anticorpos Incorporados	15-234-0001	Use a 1:50
Câmara			Usamos placas de cultura quadradas Nunc 500 cm2/well com papel umedecido toalhas
Microscópio de campo amplo com epifluorescência	Microssistemas		Qualquer modelo padrão
Frascos Coplin	Várias marcas		Capacidade de 50 ml; 40 mm (1,6 pol.) de diâmetro, comporta 10 lâminas (costas com costas)
Placas de Petri	Várias marcas		100 x 15 mm de diâmetro, poliestireno estéril não tratado

lâminas comerciais umidificada Leica comerciais comerciais