Meiose é o processo de desenvolvimento pelo qual gâmetas são formadas através de uma única rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação do cromossomo. Mamíferos meiose pode ser examinado, utilizando uma técnica para preparar os cromossomas se espalha. Aqui, vamos demonstrar um método de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.
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Artigo de método
Preparação de cromossomas se espalha a partir do Mouse espermatócitos
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Resumo
Resumo
Mamíferos meiose é um processo dinâmico de desenvolvimento que ocorre em células germinativas e pode ser estudado e caracterizado. Usando um método para espalhar núcleos na superfície de slides (ao invés de deixá-los de altura), podemos demonstrar uma técnica otimizada em espermatócitos de rato que foi descrita pela primeira vez em 1997. Este método é amplamente utilizado em laboratórios para estudar mamíferos meiose porque produz uma infinidade de núcleos de alta qualidade, passando por substages da prófase I. seminíferos túbulos primeiro são colocados em uma solução hipotônica para inchar espermatócitos. Em seguida, espermatócitos são liberados em uma solução de sacarose para criar uma suspensão de células e núcleos são espalhados em lâminas de vidro encharcada de fixador. Na sequência de imunocoloração, uma diversidade de proteínas pertinentes aos processos meióticos pode ser examinada. Por exemplo, proteínas do complexo synaptonemáticos, uma estrutura tripartida que conecta os cromossomo eixos/núcleos de homologs juntos podem ser facilmente visualizadas. Proteínas de recombinação meiótica, que estão envolvidas na reparação de quebras da dobro-costa de DNA por recombinação homóloga, também podem ser immunostained para avaliar a progressão da prófase eu. Aqui descrevemos e demonstrar em detalhe uma técnica amplamente utilizada para estudar mamíferos meiosis em espermatócitos de ratos machos juvenis ou adultos.
Introdução
Ratos são usados extensivamente como um organismo modelo para estudar meiose em mamíferos. Ambos os processos de desenvolvimento normais e defeitos que ocorrem durante a meiose podem ser avaliados. A linha do tempo e a progressão das características salientes que ocorrem durante a prófase I e substages, bem como uma infinidade de proteínas específicas envolvidas nos processos fundamentais para a regulação da meiose pode ser caracterizado no tipo selvagem e ratos mutantes. Vários processos especializados que ocorrem durante a meiose, que pode ser estudado em detalhe (revisto em Handel e Schimenti1). Estes incluem formação de ruptura da dobro-Costa (DSB) de DNA e reparação, recombinação, formação de complexos synaptonemáticos e segregação do cromossomo.
Um aspecto importante de estudar processos meióticos é a capacidade de examinar os núcleos contendo cromossomos homólogos que são visualmente e opticamente resolvidos para melhor distinguem e identificam os substages da prófase I. prófase que é composto por 5 substages que são caracterizadas por características específicas, incluindo a formação do complexo synaptonemáticos (SC). O SC é um andaime proteína tripartite que permite emparelhamento e DNA dobro-Costa reparação de homologs. Durante leptonema, homologs alinhar como elementos axiais do SC são estabelecidos. Em seguida fixação dos elementos centrais para o complexo de synaptonemáticos durante zygonema facilita a conexão física e pareamento (sinapse) entre pares de homologs. Durante pachynema, sinapse de homologs torna-se completa e os cruzamentos de DNA são formados a partir de reparação de uma população seleto de DNA dupla-quebras através de recombinação homóloga. O SC desmonta durante diplonema, permitindo homologs para desynapse, mas permanecem conectados em seus centrómeros e em locais de cruzamentos de DNA. Finalmente, durante diacinese, homologs recondense e ocorre a transição para a metáfase1.
Historicamente, superfície-propagação da cromatina meiótica rendeu alguns núcleos, especialmente aqueles das primeiras fases da prófase eu2. Como resultado, esses métodos foram modificados para melhorar a separação de células de tecidos (testículo ou ovário), a técnica de espalhamento de cromatina meiótica e o rendimento dos núcleos meiótico de alta qualidade para avaliação2,3, 4. Além disso, este método provou para ser útil na preservação nuclear e cromatina ligado proteínas em núcleos meióticos, como demonstrado por técnicas de immunolocalization publicada a5,6,7. Portanto, o método inicialmente descrito por Peters2 e demonstrado aqui rende muitos núcleos de maturação explosão separado contendo homologs passando pelos leptóteno, zygote, paquíteno, diplóteno e diacinese substages da prófase eu.
A técnica de preparação de superfície-propagação núcleos (também chamados de análise de propagação de cromatina) é amplamente utilizada para estudar meiose nos campos da biologia reprodutiva e celular. Slides contendo núcleos de propagação da superfície podem ser posteriormente immunostained com anticorpos para proteínas de interesse ou submetidos a coloração prata e depois analisaram com microscopia. O método é semelhante para os ratos masculinos e femininos, embora modificações foram descritas para ratos fêmeas2. É crucial para não overmince túbulos seminíferos. Núcleos devem também ser bem espalhados para que seguir immunostaining homologs e proteínas associadas são claramente vistas com microscopia. Núcleos de propagação da superfície podem ser preparados em apenas algumas horas e qualquer immunostained imediatamente ou armazenados a-80 ° C por um período máximo de 3 semanas antes de descongelar e imunocoloração. No entanto, óptimos resultados melhores são obtidos para algumas proteínas se immunostaining é executada imediatamente, ou dentro de 2 semanas de preparação de superfície-propagação núcleos. Slides podem ser immunostained com um protocolo padrão usando anticorpos para proteínas de interesse, seguido de incubação com anticorpos secundarios conjugados para fluorescente proteínas ou corantes, em seguida, fotografada com microscopia de fluorescência8. No pós-Natal dia 15-21 há tecido suficiente por par de tipo selvagem testículos a produzir slides de 6-10, e os ratos mais velhos (incluindo adultos) produzirá mais slides. No entanto, ratos de tipo selvagem 6 semanas de idade e mais velhos também irão produzir mais pós-meiose células (ou seja, espermátides) nas corrediças de imunocoloração a seguir. Além disso, todos os substages da prófase eu pode ser observado em ratos jovens e adultos. Os testículos dos machos no pós-natal dias 10 a 15 renderá muitos mais células leptóteno e zygote. Os ratos mais velhos que pós-Natal dia 14 a 15 renderá mais núcleos paquíteno e diplóteno.
Aqui descrevemos e demonstrar um método amplamente utilizado de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato.
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Protocolo
Todos os métodos envolvendo ratos utilizaram alta ética e padrões de bem-estar e foram aprovados pelo Comitê de uso na faculdade de medicina da Universidade de Drexel e institucional Cuidado Animal.
1. preparação de soluções e instrumentos necessários
- Prepare o tampão de extração hipotônica (HEB) em 50 mL de água de grau de laboratório ultrapura, pH 8,2-8,4 (tabela 1). Fazer a solução fresca cada vez, lembre-se no gelo e usar até 2 horas de preparação se espalha; Isto é necessário para otimizar a redução e a protease, inibir a atividade dos TDT e PMSF, respectivamente. Use 10 mL de HEB para cada par de testículos de rato.
- Prepare uma solução de sacarose 100 mM (frescos de cada vez), acrescentando 0,342 g de sacarose a 10 mL de laboratório ultrapura água de grau. Ajustar o pH a 8.2
- Preparar a solução fixador (1% paraformaldeído (PFA), 0,15% Triton X-100, pH ajustado a 9.2 com 1 N HCl ou 1 NaOH de N) mensal fresco e loja em temperatura ambiente protegido da luz. Diluir um 16% comercialmente PFA partido estoque disponível para 4% em 1X PBS para uso como um estoque de trabalho e em seguida armazenar alíquotas de 4% a-20 ° C.
- Para preparar a solução de fixador, adicionar 10 mL de solução a 4% PFA e 600 µ l de 10% Triton X-100 a 30 mL de 1X PBS, misture bem e ajustar o pH a 9.2 com 1 N HCl ou 1 N NaOH. Armazene a solução fixador em um tubo cônico de 50 mL, embrulhado em papel de alumínio à temperatura ambiente (para não mais de 4 semanas).
- Preparar soluções de lavagem (enquanto slides estão secando o passado 30 min) com 200 Photo-Flo: 0,4% Photo-Flo 200/PBS (320 µ l de Photo-Flo 200 em 80 mL de 1X PBS) e 0,4% Photo-Flo 200/dH2O (160 µ l de Photo-Flo 200 em 40 mL de água de grau de laboratório ultrapura). Use uma jarra de Coplin 50ml repleta de 40 mL de soluções para lavar slides 10 ou menos de cada vez.
- Preparem-se os seguintes instrumentos: 1 par de tesouras cirúrgicas (para cortar a pele), 1 par de tesouras cirúrgicas de ponta fina (para entalhar o peritônio), 2 pares de pinças de ponta fina em linha reta (para dissecar para fora cada testículo), 1 lâmina de barbear de borda reta (para entalhar cada testículo), curva de 2 pares de pinças de ponta (para imobilizar cada testículo e espremer para fora dos túbulos seminíferos), 50 mL frascos de Coplin, Teflon impresso 3 slides de anel, 1 Bisturi com lâmina de tamanho 11, câmara umidificada, pratos de Petri 100 x 15mm, marcador permanente de ponta fina ou lápis e um agitador rotativo de plataforma.
- Prémio de lugar sem carga deaner final fosco corrediças de vidro vertical em uma jarra de Coplin 50ml repleto de fixador solução até o uso.
Nota: O lápis é preferencial se slides serão usados posteriormente em procedimentos que requerem a etanol, tais como hibridação de fluorescência in situ .
- Prémio de lugar sem carga deaner final fosco corrediças de vidro vertical em uma jarra de Coplin 50ml repleto de fixador solução até o uso.
2. núcleos de maturação se espalhando
- Eutanásia em um rato masculino de acordo com as orientações institucionais (por exemplo, deslocamento cervical com ou sem CO2 asfixia).
- Use P10 - P20 machos avaliar células meióticas na primeira onda da espermatogênese; rotineiramente usamos P15 - P17 machos para obter células de todos os substages da prófase I. testículos adultos irão fornecer células de prófase, eu também, mas eles também irão produzir células mais postmeiotic, como espermátides.
- Colheita e pesar os testículos (gravar os pesos emparelhados); em seguida, colocá-los em uma placa de Petri contendo algumas gotas de frio HEB para mantê-los húmida.
- Segure o testículo contra o fundo do prato com pinça de ponta curva e usar uma lâmina de borda reta para fazer uma pequena incisão vertical através da cápsula do testículo. Mantendo ainda o testículo contra o fundo do prato com uma pinça, use um segundo conjunto de pinças de ponta curvada ou lâmina de barbear borda reta para apertar suavemente os túbulos seminíferos do testículo.
- Coloque os túbulos em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de frio HEB, tendo o cuidado de evitar colocar pedaços da cápsula para o tubo. Repita essas etapas com o testículo segundo.
- Incube os túbulos seminíferos congelada no tubo cônico contendo HEB no gelo por 30-60 min, dependendo do tamanho dos testículos. Incubar os túbulos seminíferos de um par de testículos, pesando 30 mg ou menos por 30 min, túbulos de um par de testículos, pesando 31 a 50 mg por 30-45 minutos e maiores testículos durante 60 minutos. Não altere as vezes para um único testículo.
Nota: O tempo de incubação ideal pode variar dependendo da experiência do experimentador, os reagentes utilizados e os ratos que está sendo analisados. - Enquanto os túbulos seminíferos estão incubando em HEB, use um marcador ou um lápis para rotular as extremidades foscas de slides deaner com mouse, número, data e número do slide. Em seguida, coloque as lâminas previamente limpas em uma jarra de Coplin contendo a fixador solução.
- Após incubação, despeje túbulos e HEB limpa uma placa de Petri e túbulos separados em grupos de diâmetro aproximadamente 3 mm. Cada grupo produz 2 slides e o número de slides rendido depende do tamanho dos testículos.
Nota: Nós obtemos 8 slides de tipo selvagem e 6 slides da subfertile Chtf18-nula P16 testículos (que são menores devido à diminuição da números de meiótico e mitótico das células germinativas,8). Um testículo adulto com peso igual ou superior a 100 mg seria esperado para produzir 16 slides. - 23 lugar µ l da solução de sacarose 100 mM em um anel de Teflon um impresso, 3 anel slide e adicionar um grupo de túbulos seminíferos para o anel. Em seguida, usando curvas dica pinça para segurar a moita, picar delicadamente túbulos com uma lâmina de barbear 11 tamanho até que a solução se torna opaco.
Nota: Não overmince, pois isso resultará em cromossomos fragmentados. Note-se que os cromossomos fragmentados também podem ser indicativos de um fenótipo mutante. - Remova os detritos, adicione outra 23 μL de solução de sacarose e usar uma micropipeta para suavemente Pipetar a mistura acima e para baixo algumas vezes para ajudar a separar as células em suspensão.
- Retirar a lâmina de imersão no Coplin frasco contendo solução fixador e incline o slide sobre o frasco para que uma gota generosa recolhe no canto inferior do slide.
- Pipetar 20 µ l de suspensão de células de sacarose a partir do anel do slide impresso 3 anel Teflon para o fixador da gota em um premium fosco lâmina de vidro e pipetar a suspensão acima e abaixo de 2 - 3 vezes.
Nota: A gota de fixador deve ser grande o suficiente no volume para que a adição de 20 µ l de suspensão de células de sacarose para permite a cobertura em slide inteiro quando a mistura é espalhada (ver 2.11 abaixo).
- Pipetar 20 µ l de suspensão de células de sacarose a partir do anel do slide impresso 3 anel Teflon para o fixador da gota em um premium fosco lâmina de vidro e pipetar a suspensão acima e abaixo de 2 - 3 vezes.
- Lentamente, incline o slide para o lado oposto da gota para espalhar a suspensão de células ao longo do comprimento do slide. Em seguida, incline lentamente a lâmina traseira para espalhar a suspensão de células ao longo da largura do slide para cobri-lo completamente. Evite a propagação da suspensão sobre a mesma área do slide mais de uma vez caso contrário que as células se sobrepõem uns aos outros.
- Coloque o slide flat em uma câmara umidificada imediatamente e repita etapas 2.8 para 2.11 até todos os grupos de túbulos seminíferos têm sido usadas para fazer slides. É importante não mover a câmara umidificada durante o processo de secagem para evitar rasgar e sobreposição de células.
- Permitir que os slides incubar em uma câmara umidificada coberta em temperatura ambiente por 2,5 h para que secam lentamente e não completamente. Alta umidade e secagem lenta nesta etapa são importantes para garantir a adequada divulgação da cromatina. Então remova a tampa da câmara e permitir slides secar ao ar completamente um adicional 30 min.
- Coloque os slides (de costas ou em um padrão em ziguezague) em uma jarra de Coplin contendo 0,4% Photo-Flo 200/1 X PBS solução e lavar as lâminas duas vezes, 5 min cada, agitando suavemente o Coplin jar em uma plataforma girando o agitador. Use a solução fresca para cada lavagem e manter slides de mouses diferentes em frascos separados para cada uma das lavagens.
- Lave as lâminas em uma jarra de Coplin contendo 0,4% Photo-Flo 200/dH2O solução por 5 min uma vez enquanto agita.
- Remover slides de Coplin o jar (última lavagem), cuidadosamente Limpe as bordas e o fundo dos slides para remover o excesso de líquido e coloque os slides em uma posição angular, quase-vertical para secar. Um experimentador que é proficiente nesta técnica pode processar e preparar os núcleos de propagação da superfície de 4 ou 5 ratos em um dia.
- Uma vez seco (15-20 min), processo slides imediatamente para a mancha da imunofluorescência ou loja a-80 ° C em uma caixa de slides hermeticamente fechado, protegida da luz por um período máximo de 3 semanas (dependendo das proteínas alvo sendo avaliadas; melhores resultados podem ser obtidos se manchado o mesmo dia ou dentro de 2 semanas).
- Se armazenado a-80 ° C, permite slides para a temperatura e lavar em uma jarra de Coplin contendo 1 X PBS ou bloco por 5 min antes da coloração.
Nota: Muitos protocolos de coloração diferente da imunofluorescência proporcionará bons resultados; referem-se para um protocolo de imunocoloração8para Berkowitz et al.
- Se armazenado a-80 ° C, permite slides para a temperatura e lavar em uma jarra de Coplin contendo 1 X PBS ou bloco por 5 min antes da coloração.
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Resultados
A capacidade desse método para fornecer um grande número de superfície espalhar núcleos contendo homologs intactas depende de três fatores principais: 1) tempo de incubação apropriada dos túbulos seminíferos no buffer hipotônica (ou seja, HEB) para obter adequadamente inchou maturação núcleos que estourou, mas não se desintegram de prolongada incubação em HEB, 2) micropipetting as gotas de sacarose de células para obter uma suspensão separada dos núcleos que não são aglutinados e 3) incli...
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Discussão
Para obter o elevado número de núcleos de maturação bem espalhados, de boa qualidade, as etapas mais críticas do presente protocolo incluem o tempo de incubação apropriada dos túbulos seminíferos no HEB, apropriado de picagem de túbulos seminíferos, e a técnica empregada para a suspensão de células de sacarose se espalhou o fixador slides revestido. Nós incubar túbulos seminíferos dos testículos dos machos de tipo selvagem, variando de pós-Natal dia 15 à idade adulta em HEB para 45 min, enquanto os testículos de comparàv...
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem a assistência técnica da Abigail Harris. Eles também reconhecem Paula Cohen e Kim Holloway para ajudar a otimizar o protocolo de preparação de superfície-propagação núcleos de espermatócitos de rato. Os autores também apreciam a leitura crítica do manuscrito por Karen Schindler.
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 GM106262 para K.M.B.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% Paraformaldeído (solução aquosa de formaldeído) | Microscopia Eletrônica Ciências | RT 15710 | Diluir a solução a 16% em estoques de trabalho a 4% com 1X PBS e congelar alíquotas a -20 ° C |
| Teflon impresso 3 anéis de | Microscopia Eletrônica Sciences | 63418-11 | |
| Lâminas de vidro de extremidade fosca premium não carregadas | Várias marcas | Limpe as lâminas em álcool etílico ou isopropílico e deixe secar antes de usar; etiquete as lâminas na extremidade fosca com um marcador permanente ou lápis, dependendo do uso subsequente das lâminas | |
| Tesouras cirúrgicas (pontas afiadas e rombas) | Ferramentas | de Ciência Fina14001-12 | Diferentes marcas de um tipo semelhante funcionarão |
| Tesouras cirúrgicas de ponta fina (pontas afiadas) | Fine Science Tools | 14058-11 | Diferentes marcas de um tipo semelhante funcionarão |
| Pinças retas de ponta fina | Fine Science Tools | 11050-10 | Diferentes marcas de um tipo semelhante funcionarão |
| Pinças de ponta média curvada | Fisher | 16100110 | Marcas diferentes de um tipo semelhante funcionarão |
| Cabo de bisturi | Fine Science Tools | 10003-12 | Marca diferente de um tipo semelhante funcionará |
| Mouse anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Use a 1:300 |
| Proteína anti-centrômero (derivada do soro de paciente CREST humano) | Anticorpos Incorporados | 15-234-0001 | Use a 1:50 |
| Câmara | Usamos placas de cultura quadradas Nunc 500 cm2/well com papel umedecido toalhas | ||
| Microscópio de campo amplo com epifluorescência | Microssistemas | Qualquer modelo padrão | |
| Frascos Coplin | Várias marcas | Capacidade de 50 ml; 40 mm (1,6 pol.) de diâmetro, comporta 10 lâminas (costas com costas) | |
| Placas de Petri | Várias marcas | 100 x 15 mm de diâmetro, poliestireno estéril não tratado |
Referências
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
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- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
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- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
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Reimpressões e permissões
