Artigo de método

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

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DOI:

10.3791/55382

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16 de fevereiro de 2017

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1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 4Department of Biomedical Research, National Jewish Health

Neste artigo

Resumo

Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.

Resumo

células B reativas com um antígeno específico geralmente ocorrem com uma frequência de <0,05% dos linfócitos. Durante décadas, os pesquisadores buscaram métodos para isolar e enriquecer essas células raras para estudos de seu fenótipo e biologia. As abordagens são inevitavelmente baseadas no princípio de que as células B reconhecem o antígeno nativo em virtude dos receptores de superfície celular que são representativos na especificidade dos anticorpos que eventualmente serão secretados por suas filhas diferenciadas. Talvez a abordagem mais óbvia para o problema envolva o uso de antígenos conjugados com fluorocromo em conjunto com a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). No entanto, a utilidade desses métodos é limitada pela frequência celular e pela taxa alcançável de análise e isolamento por classificação eletrônica. Um novo método para enriquecer células B raras específicas de antígenos usando nanopartículas magnéticas que resulta em enriquecimento de alto rendimento de células B reativas a antígenos de grandes populações de células iniciais é descrito. Este método permite um melhor monitoramento do fenótipo e da biologia das células reativas ao antígeno antes e após o encontro com o antígeno in vivo, como após a imunização ou durante o desenvolvimento da autoimunidade.

Introdução

Diluição limitante análise de frequência do precursor de células secretoras de anticorpos sugerem que as células B reactivas a um antigénio particular ocorre tipicamente a uma frequência de 0,05 a 0,005% no repertório normal, dependendo do estado de vacinação e tamanho / número de epítopos presentes no antigénio. A baixa frequência destas células tornou difícil para estudar alterações do seu estatuto durante o desenvolvimento de respostas imunitárias, tais como a seguir a vacinação ou a exposição a um antigénio estranho, ou durante o desenvolvimento da auto-imunidade. Anteriormente, os investigadores assumiram isolamento das células B de antigénio reactivo usando técnicas que vão desde a placas revestidas com antigénio ou adsorventes de coluna, para reajuste de glóbulos vermelhos revestidos com o antigénio, a célula de triagem 1, 2, 3, 4, 5, 6 fluorescência-activado. though estas técnicas têm tido êxito na identificação e isolamento de células de antigénio-reactivo B, os resultados variaram em termos de rendimento, pureza e escalabilidade. Recentemente, desenvolveram um novo método para detectar e enriquecer subpopulações de linfócitos B raros usando nanopartículas magnéticas. O método permite o enriquecimento com um rendimento relativamente elevado e pureza a partir de grandes populações de partida, e é compatível com a análise das respostas ao antigénio. Por enriquecimento de populações de células em suspensão, o método elimina restrições que estão associadas com a geometria de placas ou colunas revestidas com antigénio, e o rendimento limite. Finalmente, uma vez que as células enriquecidas permanecem associadas com o antigénio e um repórter fluorescente, que pode ser adicionalmente purificado por separação por FACS. Tal como aqui descrito, temos usado esta abordagem para o estudo de células B de sangue tétano toxóide-reactivo periféricos antes e após a imunização de seres humanos, assim como células B auto-antigénio de reactivo de pacientes com diversas autoidistúrbios mmune, incluindo diabetes do tipo 1, doença de Graves e doença de Hashimoto 7. O método funciona igualmente bem no ratinho e humano, e é compatível com a análise de células de antigénio-reactivo B a partir de uma variedade de tecidos (manuscrito em preparação).

No seu formato básico, células mononucleares de sangue periférico são primeiro incubadas com o antigénio biotinilado, juntamente com anticorpos para antigénios de superfície celular necessárias para a análise fenotípica. Esta etapa de rotulagem é seguida pela lavagem e fixação, e adição de estreptavidina acoplada a medida de corante-vermelho fluorescente para a detecção das células de ligação biotinilado-antigénio (Figura 1). Estudos anteriores identificaram as células B específicas do antigénio de um modo semelhante, mas utilizando antigénios directamente conjugado com um fluorocromo 8, 9, 10, 11. Embora esta seja uma dignaabordagem, a utilização de antigénios biotinilados em conjugação com estreptavidina permite uma maior amplificação de sinal (por conseguinte, uma melhor diferenciação de células não-ligação e de ligação), em particular quando os antigénios são pequenos 12, 13, 14. Uma consideração adicional é a utilização de estreptavidina em vez de avidina desglicosilada devido estreptavidina é, diminuir a ligação não específica. Além disso, usamos corante vermelho-distante-fluorescente como fluorocromo, devido à sua fotoestabilidade, rendimento quântico (brilho), e seu pequeno tamanho (~ 1,3 kDa). Fluorocromos proteínas, como ficoeritrina (~ 250 kDa) e aloficocianina (~ 105 kD) 15 não são ideais porque eles potencialmente conter muitos epítopos antigênicos. A utilização de um pequeno composto orgânico corante fluorescente de um único epítopo, tal como corante vermelho-distante-fluorescente, reduz a complexidade da população de células isoladas.

Uma vez que as células são biotinilados-Antigen e adsorvido dye-estreptavidina far-vermelho-fluorescente, eles são enriquecidos usando nanopartículas magnéticas corante conjugado anti-far-vermelho-fluorescente. Nanopartículas individuais não são detectados pela maior parte dos citómetros de fluxo e, portanto, não necessitam de ser removidos antes da purificação por separação por FACS e ensaios a jusante 16. selecção magnética para células B específicas do antigénio enriquece a população de interesse, eliminando o tempo e custo da triagem eventos raros usando um citómetro de fluxo.

Abaixo, mostramos resultados representativos de enriquecimento de células tétano-específicas do toxóide B de um assunto antes e sete dias após a imunização com toxóide tetânico reforço. Nós escolhemos esta aplicação particular como um exemplo para demonstrar a capacidade do presente método para o enriquecimento de células B específicas de antigénio seguintes aguda na estimulação in vivo. Quando acoplada com citometria de fluxo, este método é capaz de enriquecer e diferenciação específica de antigénio naïve, memória, ecélulas plasmablast B e permite ao pesquisador acompanhar as mudanças em sua freqüência ao longo do tempo. Além disso, incluir um outro ensaio a jusante possível, por exemplo, um ensaio ELISPOT, o que demonstra que as células conservam a capacidade de segregar anticorpos após o enriquecimento. Outra aplicação do presente método pode envolver a transferência adoptiva de células enriquecidas em um hospedeiro. Nós mostramos anteriormente células de manter a capacidade para actuar como antigénios das células para as células T específicas de antigénio seguintes isolamento e transferência apresentando (dados não mostrados). Assim, há uma série de ensaios a jusante possíveis que podem ser acopladas com o método, que em conjunto informa a compreensão da resposta imunitária específica do antigénio. Nós descrevemos o método abaixo, incluindo controles para determinar o rendimento global, pureza, especificidade celular, e dobre-enriquecimento.

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Protocolo

1. Isolamento de PBMC humanas

  1. Colete de 30-50 ml de sangue, utilizando tubos de coleta de sangue heparinizado.
    NOTA: A quantidade de sangue usado depende da questão experimental particular e frequência no sangue de células B específicas para o antigénio de interesse. O sangue heparinizado podem ser processados ​​imediatamente ou agitadas suavemente durante a noite à temperatura ambiente, durante o processamento do dia seguinte. O atraso no processamento tem muito pouco efeito sobre a eficácia do enriquecimento e está associada com o mínimo de perda de viabilidade.
  2. Misture sangue completo a 1: 1 com solução estéril, de magnésio e de cálcio temperatura ambiente livre de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
  3. Num tubo de 50 ml estéril, adicionar 10 ml de solução de gradiente de densidade temperatura ambiente. Armazene as garrafas de gradiente de densidade abertos no escuro a 4 ° C, mas quente à temperatura ambiente antes do uso.
  4. Se possível definir a arma pipeta para o ajuste lento e / ou aplicar muito pouco, mas consistente, a pressão de gatilho para lentamentecamada de 30-35 ml de sangue diluído em cima do gradiente de densidade, tendo cuidado para não misturar os dois.
    NOTA: Colocar a ponta da pipeta contra o bordo das 50 ml cónica, enquanto a adição do sangue diluído irá ajudar a assegurar um fluxo constante consistente.
  5. Centrifuga-se a 400 xg durante 30 min a 20 ° C, com o travão de desligado.
  6. Retirar a camada superior, que contém plasma e plaquetas, tendo o cuidado de não perturbar a camada de células mononucleares abaixo.
  7. Usando uma pipeta estéril, recolher a camada de células mononucleares (buffy coat) e coloque em um tubo de 50 ml estéreis diferentes.
  8. Adicionar PBS à suspensão de células até um volume de 50 ml. Centrifuga-se a 400 xg durante 10 min a 20 ° C, com travão.
  9. Remover o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 10 ml de PBS. Contagem de células e determinar a viabilidade utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado.
  10. Ressuspender as células em 10 7 células / ml e colocar em gelo até estar pronta para posterior processamento.

2. Coloração de células

  1. Remover 1-2 x 10 6 células para cada compensação de fluorescência / controle FMO necessário, se for o caso. Centrifugar restante das células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio.
  2. Ressuspender as células em tampão estéril filtrada, frio FACS (PBS + 1% de albumina de soro bovino (BSA) + 0,01% de azida de sódio) a 3-6 x 10 7 células / ml (em remover um tubo de centrífuga de 1,5 ml). Certifique-se de que o tampão FACS é frio e mantê-lo em gelo durante todo o processo de coloração.
    1. Dividir a população de células em quartos (AD) quando optimizar o ensaio. Use fracção A para enriquecer as células B específicas do antigénio de interesse, usa frações B e C para determinar a especificidade do enriquecimento / coloração (ver 2.5 e 2.6 abaixo), e fração de uso D para determinar a frequência eo número de células antígeno-específicas em a população não enriquecido para permitir o cálculo de rendimento e dobre-enriquecimento.
  3. Adicionar re bloqueando FcyR humanaagente de fracções AD em gelo para evitar a ligação de anticorpos aos receptores de Fc.
    NOTA: Siga as instruções do fabricante para as condições adequadas.
  4. Adicionar anticorpos fluorocromo-conjugados com antigénios de superfície celular de interesse para AD fracções durante 30 minutos em gelo no escuro, tendo cuidado para não incluir fluorocromos que podem reagem de forma cruzada com os anticorpos anti-corante vermelho-distante-fluorescente acopladas a nanopartículas magnéticas.
    NOTA: Estes incluem anticorpos conjugados a corantes fluorescentes infravermelho próximo, Cy5, Cy5.5, e Cy7. Qualquer mancha de viabilidade que são adicionados deve ser compatível com o uso de um fixador. Se não se pretende analisar as células que utilizam FACS, mas determinar a frequência secretoras de anticorpo, por exemplo, por ELISPOT, a coloração da superfície com anticorpos é desnecessária.
  5. Para testar a especificidade do ensaio, incubar Fracção B com uma quantidade suficiente de antigénio não marcado durante 30 min em gelo, de tal modo que a maioria dos receptores, com uma afinidade de pelo menos10 -6 M estão bloqueadas.
    NOTA: Tipicamente, uma boa concentração de partida de um excesso de 50-100 vezes a quantidade de antigénio considerado suficiente no ponto 2.6 abaixo (por exemplo 50-100 mM). Isto deve bloquear as células B com uma elevada afinidade para o antigénio não marcado para se ligar ao antigénio biotinilado, que é adicionado no passo 2.6 abaixo, permitindo, assim, a confirmação da especificidade das células enriquecidas. Esta etapa pode ser completada em conjunto com o passo 2.4 acima.
  6. Adicionar antigénio biotinilado para as Fracções A, B e D. Incubar em gelo durante 30 min.
    NOTA: A concentração de antigénio biotinilado deve ser titulado para determinar a quantidade óptima necessária para assegurar a detecção e a separação de células a partir de células espectadoras ligação não-específica adequada. Tipicamente, uma boa concentração de partida de teste é 1-5 uM.
    NOTA: Para as Fracções A e D, este passo pode ser realizado simultaneamente com a etapa 2.4 acima. Para Fracção B, esta etapa deve ser feito após o passo 2.5 (lavagem em betwpassos een é desnecessária).
  7. Omitir antigénio biotinilado de Fracção C, a fim de determinar qualquer ligação de células B a outros reagentes no protocolo, tais como estreptavidina corante vermelho-distante-fluorescente e as esferas magnéticas.
  8. Lavar as células duas vezes por suspensão das células em 1 ml de tampão FACS frio por 5 x 10 7 células e centrifugação a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
  9. Após a lavagem final, dilui-se suspensão de células de concentrado em 1 ml de 2% de formaldeído por 5 x 10 7 células e deixar assentar no escuro em gelo durante 5 min.
    NOTA: A fixação das células neste ponto assegura que o antigénio biotinilado permanece ligado ao BCR para o restante do processo. Para as células viáveis ​​- para análise a jusante, como em ELISPOTs ou transferências adoptivas, omitir o passo de fixação.
  10. Lavar as células duas vezes com 1 ml de tampão FACS frio por 5 x 10 7 células e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender em 1 ml FACS frio tampão por 5 x 107 células.
  11. Adicionar corante 1-2 ug de estreptavidina-far-vermelho fluorescente / ml e incubar em gelo durante 20 min no escuro. Titula-se a quantidade de estreptavidina para cada aplicação.
  12. Lavar as células duas vezes com 1 ml de tampão de FACS frio por 5 x 10 7 células e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. preparação Fracção D é completado neste ponto, uma vez que não irá sofrer enriquecimento utilizando as esferas magnéticas.
    NOTA: Este exemplo vai ser utilizada para determinar a frequência e o número de células B específicas do antigénio na amostra. Isto irá ser utilizado para determinar o rendimento e dobra-enriquecimento alcançado por enriquecimento.

3. Magnetic Enriquecimento à base de nanopartículas

  1. Ressuspender as células a partir de amostras de CA em 1 ml de tampão frio de separação (PBS + BSA a 0,5% + EDTA a 2 mM) por 5 x 10 7 células e passar através de um filtro de 40 um para eliminar quaisquer aglomerados que podem obstruir a coluna.
  2. Adicionar Anti-Cy5 / nanopartículas de corante Anti-far-vermelho-fluorescente. for resultados óptimos, a concentração de nanopartículas deve ser titulada para cada utilização, mas um bom ponto de partida é de 50 ul por suspensão de 5 x 10 7 células / ml. Girar no escuro a 4 ° C durante 10 min.
  3. Lavar duas vezes com 1 ml de tampão de separação a frio a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 1 ml de tampão frio separação por 5 x 10 7 células.

4. Enriquecimento Magnetic Usando LS ou colunas LD

  1. Coloque três LS ou colunas LD no campo magnético de um separador magnético e adicionar 3 ml de tampão de separação para molhar as colunas (ver descrição do produto para determinar qual o tipo de coluna é o mais adequado). Permitir que todos os 3 ml de passar através da coluna e descartar após a sua recolha.
    Nota: Embora a separação de células de nanopartículas magnéticas marcado pode ser realizada utilizando qualquer um dos dispositivos de separação magnéticos que estão comercialmente disponíveis, o laboratório teve o maior sucesso com a utilização de colunas LS, em Terms de rendimento, pureza e eficiência do enriquecimento.
  2. Colocar os tubos três cónicos de 15 ml etiquetados "Fracção A / (B) / (C) negativo", para células seleccionadas negativamente, sob a coluna. Adicionar a partícula magnética células marcadas com a respectiva coluna e permitir que todo o volume para passar através.
  3. Adicionar 3 ml de tampão de separação a frio na parte superior, e permitir que esta passe através da coluna e repetir com 2 ml. Coletar as células selecionadas negativamente e reserve em gelo.
  4. Retirar a coluna do campo magnético e colocar na parte superior de um tubo cónico de 15 ml rotulados "Fracção A / (B) / (C) positivas", para células seleccionadas positivamente.
  5. Encher a coluna ao topo com cerca de 6 ml de tampão de separação e imediatamente mergulhar este volume através da coluna para recolher as células que tinham ligado ao campo magnético utilizando o êmbolo fornecida.
  6. Para aumentar a pureza, as células positivamente seleccionadas pode ser ainda mais enriquecido utilizando uma segunda coluna limpo, repetindo o procedidure.
  7. Girar ambas as fracções negativamente e positivamente seleccionadas a 400 xg durante 10 min a 4 ° C e suspender em volume final desejado. Prosseguir com a análise a jusante, tais como FACS, ELISPOT ou transferência adoptiva.

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Resultados

Análise de pureza, rendimento, e dobre-o enriquecimento usando citometria de fluxo

Populações enriquecidas como descrito acima, inevitavelmente conter células contaminantes que não se ligaram corante estreptavidina far-vermelho-fluorescente, mas estão presos na matriz. Estas impurezas podem ser removidas a partir de populações enriquecidas por separação FACS. Para estimar a pureza das populações enriquecidas, portão em células vi...

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Discussão

Descrevemos aqui um novo método para realizar o isolamento e enriquecimento de células B de ligação ao antigénio a partir de sangue periférico humano. O método é facilmente aplicável a ratinhos e a outros tecidos, tais como o baço e nos nódulos linfáticos, e é compatível com a análise pós-enriquecimento de fenótipo e função (manuscrito em preparação) célula.

O utilizador deve ter conhecimento de um número de variáveis ​​que podem afectar o sucesso deste procedimento. A partir da experiência ...

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Divulgações

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações da JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) e dos Institutos Nacionais de Saúde (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 e F30OD021477).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Variável de antígeno de interessevariávelPelo menos 100 μ g para biotinilar facilmente; se estiver usando proteína, tente usar proteína que tenha sido validada por ELISA. Deve ser transportadora  sem proteínas.
Biotina para rotulagem; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-BiotinaThermo Scientific21335A biotina está disponível em diferentes formulações, como as que contêm vários espaçadores de comprimento, portanto, o tipo usado deve ser determinado pelo pesquisador
Streptavidin-Alexa Fluor 647InvitrogenS21374Pode ser obtido de outros fornecedores.
Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicroesferasMiltenyi Biotech130-091-395
LS ColunasMiltenyi Biotech130-042-401
MACS separadores manuaisMiltenyi Biotechvariável
FormaldeídoDiluir a 2% com PBS; opcional se o ensaio a jusante exigir células
vivas PBS sem cálcio e magnésio
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Sangue total em tubos
Tampão FACS (PBS + 1% BSA + 0,01% azida sódica)
Tampão de separação (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA)
Tubos cônicos de 50 ml Tubos
cônicos de 15 ml
Tubos Eppendorf de 1,5 ml Anticorpos
reativos a marcadores de superfície, Fc Block, mancha discriminante viva/morta, se necessário
Suprimentos ELISPOT, se necessário
de coleta heparinizados

Referências

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