Descreve-se aqui um método para produzir citoquina exógena em ratinhos de xenoenxerto derivados de doentes (PDX) por meio de injecção intraperitoneal semanal de uma linha de células de estroma transduzidas por citoquinas. Este método alarga a utilidade de PDX e proporciona a opção para a libertação transitória ou prolongada de citoquinas exógenas numa multiplicidade de modelos PDX.
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Artigo de método
Expressão de citocina exógena em xenotransplantes derivados de pacientes via injeção com uma linha de células estromáticas transduzidas por citocinas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os ratinhos de xenoenxerto derivados de pacientes (PDX) são produzidos por transplante de células humanas em ratinhos deficientes em imunidade. Estes modelos são uma ferramenta importante para o estudo dos mecanismos da hematopoiese normal e maligna e são o padrão-ouro para a identificação de quimioterápias eficazes para muitas malignidades. Os modelos PDX são possíveis porque muitas das citoquinas de rato também actuam em células humanas. No entanto, este não é o caso de todas as citocinas, incluindo muitas que são críticas para o estudo normal e hematopoiese maligna em células humanas. As técnicas que engendram camundongos para produzir citoquinas humanas (modelos transgênicos e knock-in) exigem uma despesa significativa antes que a utilidade do modelo tenha sido demonstrada. Outras técnicas são de trabalho intensivo (injeção de citocinas recombinantes ou lentivírus) e, em alguns casos, exigem altos níveis de especialização técnica (injeção hidrodinâmica de DNA). Este relatório descreve um método simples para a geração de camundongos PDX que possuem células humanas exógenasTokina (TSLP, linfopoietina do estroma tímico) via injecção intraperitoneal semanal de estroma que foram transduzidos para sobre-expressar esta citocina. A utilização deste método proporciona uma fonte in vivo de produção contínua de citoquinas que atinge os níveis fisiológicos de citoquina humana circulante no rato. Os níveis plasmáticos de citoquina humana podem ser variados com base no número de células estromais injectadas, e a produção de citoquinas pode ser iniciada em qualquer ponto da experiência. Este m�odo tamb� inclui ratinhos de controlo negativo de citoquina que s� produzidos de forma semelhante, mas atrav� de injec�o intraperitoneal de estroma transduzido com um vector de controlo. Demonstrou-se previamente que as células de leucemia colhidas a partir de PDX que expressa TSLP, em comparação com PDX de controlo, exibem um padrão de expressão de gene mais parecido com a amostra de paciente original. Juntos, os ratinhos PDX produtores de citoquinas e negativos a citoquinas produzidos por este método proporcionam um sistema modelo que usamos com sucesso para estudar aPapel da TSLP na hematopoiese normal e maligna.
Introdução
Os xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) são um poderoso modelo in vivo para estudar a produção de células hematopoiéticas normais e malignas num ambiente mamífero "nativo". Na maioria das vezes, PDX são produzidos por injeção ou transplante de células humanas em ratinhos deficientes imunológicos. A produção de PDX utilizando células estaminais hematopoiéticas humanas normais permite estudos in vivo de sangue humano normal e desenvolvimento de células imunitárias. O PDX produzido a partir de leucemia ou outras células cancerosas torna possível o estudo de mecanismos oncogénicos e a identificação de terapias eficazes no contexto da gama de paisag....
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Protocolo
Os estudos foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Instituição de Loma Linda e pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) e de acordo com todas as diretrizes federais.
CUIDADO: PDX e tecidos humanos devem ser manuseados de acordo com os procedimentos de segurança para prevenir a transmissão de patógenos transmitidos pelo sangue.
1. Cultura e Expansão de Células Estromáticas Transduzidas por Citocinas
NOTA: Cada vez que o estroma é passado, colher o sobrenadante da cultura (alíquota de 1 mL) e arm....
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Resultados
Uma visão geral do modelo é mostrada na Figura 1 . Uma vez que a produção de citocinas (TSLP + estroma) e o estroma de controlo foram obtidos são expandidos em cultura. Antes da injeção de estroma em camundongos, o sobrenadante de células estromais é avaliado por ELISA para verificar a produção de citocinas ( Figura 2 ) e a citometria de fluxo fosfo (Protocolo # 3) é usada para verificar a atividade da citocina produzida pelo estroma. O sobrenadante é re.......
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Discussão
Este manuscrito descreve um método simples, rápido e relativamente rentável para a engenharia de PDX para expressar citoquina humana exógena. A estratégia descrita aqui é baseada em injecções intraperitoneais semanais de uma linha de células de estroma transduzidas para expressar a citoquina humana, TSLP. Antes da realização dos métodos aqui descritos, o estroma manipulado para expressar níveis elevados da citocina de interesse (TSLP) e o estroma de controlo manipulado de forma semelhante foram gerados. Nos protocolos a.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant, Departamento de Patologia e Anatomia Humana, Departamento de Ciências Básicas e Centro de Disparidades de Saúde e Medicina Molecular da Escola de Medicina da Universidade de Loma Linda e por uma bolsa para promover a pesquisa colaborativa e translacional da Universidade de Loma Linda (KJP). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes de laboratório úmido | |||
| T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, capacidade de 7 mL, 25cm² área de cultura | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Frasco tratado com cultura de tecidos, capacidade de 250 mL, 75 cm² área de cultura e tampa ventilada | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Frasco Tratado para Cultura de Tecidos, capacidade de 600 mL, 150 cm² área de cultura & tampa ventilada | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| pipetas sorológicas de 10 mL Falcon | 357551 | ||
| tubos cônicos de polipropileno de 15 mL | Fisher | 05-539-12 | |
| Tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL Falcon | 352054 | ||
| tubos cônicos de polipropileno de 50 mL | |||
| de 2,0 mL, pontas de | 4230659 | Corning Inc. / Fish | |
| 2707509 | er | ||
| 200 μ Ponteiras de pipeta L | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| 10 μ Pontas de pipeta L | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis com Membrana SFCA, Nalgene Rapid-Flow | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem calício e magnésio, 1&vezes; | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| Human TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| 3% Ácido Acético com Azul de Metileno | Stemcell Technologies | 7060 | |
| Azul de Tripano | Corning | 25-900-Cl | |
| "Tripsina" 1x 0,25% Tripsina 2,21 mM EDTA em HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| " R10" meio de cultura celular, % do volume total (faz 565 mL) | - | - | Receita de Laboratório |
| RPMI, 88,5% (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, 9,9% (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamina, 0,99% (5,6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicilina-Estreptomicina, 0,50% (2,8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Mercaptoetanol, 0,10% (560 µ L) | MP | 190242 | |
| " R20" meio de cultura celular, % do volume total (faz 195 mL) | - | - | Receita de Laboratório |
| RPMI, 76,84% (150 mL) | veja acima | ||
| FBS, 20,49% (40 mL) | veja acima | veja acima | |
| 2mM L-glutamina, 1,02% (2 mL) | veja acima | veja acima | |
| 1 mM de piruvato de Na, 1,02% (2 mL) | veja acima | veja acima | |
| Penicilina-estreptomicina, 0,51% (1 mL) | veja acima | veja acima | |
| 2-Mercaptoetanol, 0,10% (0,1 M), 0,10% (200 µ L) | veja acima | veja acima | |
| " Meio de congelamento", % do volume total | - | - | Receita de laboratório |
| " R10" médio, 45% | ver receita "R10" | - | |
| FBS, 20% | ver acima | 35-011-CV | |
| DMSO, 10% | Corning | 25-950-CQC | |
| D(-)(+)-Trealose di-hidratada, 5% | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| Nome | Empresa< | strong>Número Catolog | Comentários |
| Biologics < / strong> | |||
| "HS-27" HS-27A linha de estroma humano | ATCC | CRL-2496 | |
| "CALL-4" MHH-CALL-4 linha celular, leucemia precursora de células B humanas | DSMZ | ACC 337 | |
| " Ratos NSG" ACENO. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, homem ou mulher, 6 anos – 8 semanas | de camundongos JAX | # 005557 | |
| Linha celular MUTZ-5, leucemia precursora de células B humanas | DSMZ | ACC 490 | |
| Proteína TSLP humana recombinante | R & D Systems | 1398-TS-010 | |
| Nome | Empresa | Número Catolog | Comentários |
| Anticorpos de citomery de fluxo (clone)* | |||
| Anti-mouse CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (o nome alternativo é IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Corante de viabilidade fixável eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig κ cadeia leve FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig λ cadeia leve FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-Cy5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, camundongo anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Nome | Company | Número Catolog | Comentários |
| Outros materiais e equipamentos | |||
| Animal Implantável Nano Transponder com Cânula | Trovan | ID-100B(1.25) | |
| EMLA creme anestésico lidocaína (obtido por prescrição através de instalações de cuidados com animais) | prescrição | prescrição | |
| BD½ cc Seringa de Insulina LO-DOSE U-100 28G½ | BD | #329461 | |
| BD Microtainer Tubes com K2EDTA | BD | #365974 | |
| Centrífuga | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| Tubos Capilares FisherBrand (Heparinizados) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemocitômetro | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Gaiola de Torta de Rato | Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Limitador de Iluminador de Cauda de Mouse Braintree | Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Trovan | IM-300(1.25) | ||
| µ Quant | Bio-Tek Instruments Inc. | MQX200 | |
| FlowJo | FlowJo, LLC | Versão 10 | |
| *Todos os anticorpos são anti-humanos, salvo indicação em contrário. |
Referências
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al.
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Reimpressões e permissões
