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Artigo de método

Expressão de citocina exógena em xenotransplantes derivados de pacientes via injeção com uma linha de células estromáticas transduzidas por citocinas

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DOI:

10.3791/55384

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10 de maio de 2017

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1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

Neste artigo

Resumo

Descreve-se aqui um método para produzir citoquina exógena em ratinhos de xenoenxerto derivados de doentes (PDX) por meio de injecção intraperitoneal semanal de uma linha de células de estroma transduzidas por citoquinas. Este método alarga a utilidade de PDX e proporciona a opção para a libertação transitória ou prolongada de citoquinas exógenas numa multiplicidade de modelos PDX.

Resumo

Os ratinhos de xenoenxerto derivados de pacientes (PDX) são produzidos por transplante de células humanas em ratinhos deficientes em imunidade. Estes modelos são uma ferramenta importante para o estudo dos mecanismos da hematopoiese normal e maligna e são o padrão-ouro para a identificação de quimioterápias eficazes para muitas malignidades. Os modelos PDX são possíveis porque muitas das citoquinas de rato também actuam em células humanas. No entanto, este não é o caso de todas as citocinas, incluindo muitas que são críticas para o estudo normal e hematopoiese maligna em células humanas. As técnicas que engendram camundongos para produzir citoquinas humanas (modelos transgênicos e knock-in) exigem uma despesa significativa antes que a utilidade do modelo tenha sido demonstrada. Outras técnicas são de trabalho intensivo (injeção de citocinas recombinantes ou lentivírus) e, em alguns casos, exigem altos níveis de especialização técnica (injeção hidrodinâmica de DNA). Este relatório descreve um método simples para a geração de camundongos PDX que possuem células humanas exógenasTokina (TSLP, linfopoietina do estroma tímico) via injecção intraperitoneal semanal de estroma que foram transduzidos para sobre-expressar esta citocina. A utilização deste método proporciona uma fonte in vivo de produção contínua de citoquinas que atinge os níveis fisiológicos de citoquina humana circulante no rato. Os níveis plasmáticos de citoquina humana podem ser variados com base no número de células estromais injectadas, e a produção de citoquinas pode ser iniciada em qualquer ponto da experiência. Este m�odo tamb� inclui ratinhos de controlo negativo de citoquina que s� produzidos de forma semelhante, mas atrav� de injec�o intraperitoneal de estroma transduzido com um vector de controlo. Demonstrou-se previamente que as células de leucemia colhidas a partir de PDX que expressa TSLP, em comparação com PDX de controlo, exibem um padrão de expressão de gene mais parecido com a amostra de paciente original. Juntos, os ratinhos PDX produtores de citoquinas e negativos a citoquinas produzidos por este método proporcionam um sistema modelo que usamos com sucesso para estudar aPapel da TSLP na hematopoiese normal e maligna.

Introdução

Os xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) são um poderoso modelo in vivo para estudar a produção de células hematopoiéticas normais e malignas num ambiente mamífero "nativo". Na maioria das vezes, PDX são produzidos por injeção ou transplante de células humanas em ratinhos deficientes imunológicos. A produção de PDX utilizando células estaminais hematopoiéticas humanas normais permite estudos in vivo de sangue humano normal e desenvolvimento de células imunitárias. O PDX produzido a partir de leucemia ou outras células cancerosas torna possível o estudo de mecanismos oncogénicos e a identificação de terapias eficazes no contexto da gama de paisagens genéticas e mutações presentes na população humana. 1 Por conseguinte, PDX são o padrão ouro atual para a investigação biomédica translacional para identificar terapias eficazes e uma ferramenta importante para a compreensão dos mecanismos de progressão do câncer. Os modelos PDX são uma ferramenta essencial para auxiliar a pesquisa em doenças de disparidades de saúde Lesões genéticas ou qualquer doença em que as variações da paisagem genética de um paciente possam contribuir substancialmente para a oncogénese e para o resultado do tratamento.

Os modelos PDX de rato-humanos são possíveis porque muitas citoquinas de murganho imitam adequadamente os seus análogos humanos na activação dos receptores de citoquinas de células humanas enquanto estão dentro do rato. Por exemplo, a interleucina-7 (IL-7) proporciona um sinal crítico para o desenvolvimento de células B humanas. 2 Neste caso, IL-7 de ratinho tem homologia suficiente com IL-7 humana que a citoquina de ratinho estimula vias de sinalização em precursores de células B humanas. Entretanto, este não é o caso da linfopoietina do estroma tímico (TSLP) 5,6 , que entre outras citocinas (IL-3, fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator de células estaminais (SCF) ,7 é importante para a produção de células hematopoiéticas humanas normais e malignas Quando as citoquinas humanas e de ratinho apresentam baixa homologia, as citocinas de murganho não activam os seus respectivos receptores em células humanas Para superar este obstáculo foram utilizadas várias estratégias Para desenvolver a expressão de citoquinas humanas em ratinhos PDX, incluindo injecção de citocinas humanas recombinantes, injecção hidrodinâmica de ADN, expressão lentiviral, expressão transgénica e substituição de genes knockin.7 Este relatório descreve um método para a engenharia de PDX para produzir citoquinas humanas através de medicações mediadas por estroma Citoquina ( Figura 1 ).

No m�odo aqui demonstrado, os ratinhos PDX s� manipulados para expressar a citoquina humana, TSLP, ou para servir como controlos negativos para citoquinas. Os PDX que expressam TSLP são conseguidos por injecções intraperitoneais semanais de células estromais que foram transduzidas para expressar níveis elevados de TSLP humana.Os ratinhos PDX de "controlo" de citocinas negativas são igualmente manipulados; Embora o estroma de controlo seja transduzido com um vector de controlo. Este método atinge os níveis fisiológicos normais de TSLP humana em ratinhos PDX injectados com o estroma TSLP +. Nenhuma TSLP detectável é observada em ratinhos PDX que recebem o estroma negativo para citoquina. Nós selecionamos a linha de células de estroma humana HS-27A para nossos estudos porque cresce robustamente em cultura e mostra um nível muito baixo de produção de citocinas que não suporta a proliferação de células progenitoras isoladas em co-culturas. 8 Para a expressão de TSLP humano, o estroma foi transduzido com um vector lentiviral de auto-inactivação de geração avançada derivado de uma estrutura anterior descrita 9 , e inclui o elemento cPPT / cts e o elemento regulador pós-transcricional da hepatite de marmota (WPRE) para aumentar a expressão do transgene. O gene TSLP humano foi construído neste vector sob o controlo do factor de alongamento-1(EF-1) para conseguir uma expressão robusta, constitutiva e de longo prazo.

A engenharia deste modelo de PDX realçado por citocina humana consiste em 4 etapas principais. Primeiro, o estroma transduzido é expandido in vitro e avaliado por ensaio imunoenzimático (ELISA) para produção de citocinas estáveis ​​e de alto nível. Em segundo lugar, verifica-se a actividade da citoquina humana produzida pelas células estromais transduzidas (e falta de actividade das citocinas a partir do estroma de controlo) utilizando citometria de fluxo fosfo. As linhas celulares conhecidas por serem sensíveis à citoquina de interesse (neste caso, TSLP) são incubadas com sobrenadante de células estromais e ensaiadas quanto à fosforilação induzida por citoquinas. Em terceiro lugar, os ratinhos são injectados com estroma humano transduzido e depois o plasma de rato é avaliado por ELISA para níveis de citoquina humana semanalmente. Em quarto lugar, as células hematopoiéticas humanas são transplantadas e os efeitos funcionais in vivo da citoquina humana são avaliados num alvo conhecido ( Eg. População de células).

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Figura 1: Modelo PDX concebido para produzir citoquina humana exógena em ratinhos. ( 1A ) Experiência de projeto e obtenção de células de estroma humanas transduzidas ( 1B ) Obter células humanas (células-tronco hematopoiéticas, células de leucemia, etc. ) para gerar camundongos PDX (xenoenxertos derivados de pacientes). ( 2A ) Injectar estroma de engenharia e ( 2B ) células humanas de transplante em ratinhos deficientes em imunidade de acordo com o calendário experimental. ( 3A-B ) Monitorizar as concentrações de citoquinas no sobrenadante do estroma e no plasma do rato por ELISA. ( 4 ) Colher células humanas e avaliar os efeitos funcionais in vivo da citoquina humana presente no PDX. Por favor, clique aquiPara ver uma versão maior desta figura.

A entrega de citoquinas humanas através de células estromais oferece vantagens e desvantagens quando comparado com outros métodos de entrega / produção de citoquinas humanas em ratinhos PDX. Em comparação com a injecção de citoquina humana recombinante, a administração mediada por estroma é geralmente menos dispendiosa (o custo da cultura de células do estroma é inferior ao custo da citocina recombinante) e menos intensivo em trabalho (uma injecção por semana versus várias injecções por semana). A questão da meia-vida de citoquinas curtas também é atenuada uma vez que o estroma produz continuamente a citocina exógena. A administração de citoquina através de uma injecção hidrodinâmica de ADN pode ser menos dispendiosa do que a administração através de estroma. No entanto, é similarmente transitória e pode exigir mais habilidade técnica do que a simples injecção intraperitoneal semanal necessária para a entrega mediada por estroma. A express� do gene lentiviral no ratinho pode proporcionarNsient método de entrega de citoquinas; Entretanto, em nossas mãos os níveis fisiológicos de TSLP não foram alcançados. Além disso, este método é intensivo em mão de obra, exigindo produção contínua de vetor lentiviral. Os murganhos transgénicos ou knock-in oferecem expressão a longo prazo estável de citoquina e podem ser manipulados para expressão específica de tecido, o que pode ser uma vantagem. Por outro lado, a expressão transgénica do gene da citoquina humana sobre o fundo de rato imuno deficiente requerido para ratinhos PDX, necessita de um imenso investimento de recursos antes de o valor do modelo ter sido estabelecido. Além disso, os modelos transgénicos não permitem geralmente a opção de variar o momento da iniciação de citoquinas ou o nível de produção de citoquinas in vivo . Estes podem ser conseguidos com a entrega mediada por estroma simplesmente mudando o ponto de tempo para o início da injeção de células estromais ou a dose de células estromais injetadas.

O método de administração de citoquinas mediado por células estromaisOd detalhado aqui foi usado para desenvolver PDX para avaliar o papel da TSLP no desenvolvimento de células B humanas normais 4,6 e leucemia linfoblástica aguda de células B de alto risco. 6 Este método proporciona um método alternativo de administração de citoquinas para utilização na geração de modelos semelhantes com citocinas humanas diferentes da TSLP. Este modelo também pode ser útil para gerar dados preliminares que podem ajudar a determinar se o valor de uma citocina transgénica ou citoquina knock-in PDX modelo seria digno do investimento de tempo e dinheiro substancial.

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Protocolo

Os estudos foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Instituição de Loma Linda e pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) e de acordo com todas as diretrizes federais.

CUIDADO: PDX e tecidos humanos devem ser manuseados de acordo com os procedimentos de segurança para prevenir a transmissão de patógenos transmitidos pelo sangue.

1. Cultura e Expansão de Células Estromáticas Transduzidas por Citocinas

NOTA: Cada vez que o estroma é passado, colher o sobrenadante da cultura (alíquota de 1 mL) e armazenar a -80 ° C para quantificação futura do nível de citoquinas através do ensaio ELISA.

  1. Preparar meio de cultura R10 e meio de congelação como descrito na Tabela de Materiais.
  2. Gerar 10 , 11 ou obter estroma de controle (transduzido com vetor vazio) e estroma produtor de citocinas (TSLP +)."> 6 Armazenar em azoto líquido (LN 2 ) até à sua utilização Descongelar as células do estroma como descrito 12 e plaqueá-las em 5 ml de meio R10 em frascos de cultura de células T-25 separadas Células de cultura numa incubadora a 37 ° C com 5% CO 2. Esta é pós-descongelamento "passagem # 1".
  3. Uma vez que o estroma é confluente (24-48 h), células de passagem por tripsinização utilizando 1 × tripsina EDTA (0,25%) e re-plaqueamento num frasco de cultura T-150. Este é pós-descongelamento "passagem # 2".
  4. Quando o estroma atinge a confluência nos frascos T-150 (3-4 dias mais tarde), passa-se as células por tripsinização. Use esta suspensão de células para necessidades experimentais.
    1. Expansão celular em múltiplos frascos
      1. Dividir as células colhidas entre três frascos T-150 e cultura até confluentes. Repita este passo se a expansão do estroma for necessária. A contagem de células típicas de estroma humano (HS-27A) na confluência num balão T-150 é ~ 5 x 10 6 .
    2. Célulasenfurecer-se
      1. Transferir a suspensão de células colhidas para um tubo cónico e centrifugar a 500 xg durante 5 min, decantar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de congelação. Congelar e armazenar em LN 2 ~ 1,5 x 10 6 células por frasco.
    3. Para injecções intra-periotoneais de estroma em ratinhos, prossiga para o passo 4.1.

2. Ensaios ELISA para monitorizar a produção de citocinas in vitro a partir de estroma transduzido

  1. Compre o kit de ensaio ELISA comercialmente disponível para detectar a citoquina de interesse.
  2. Descongelar o sobrenadante de células estromais do estroma produtor de citocinas e de produção de citocinas (TSLP +) colhido nas passagens precoce, média e tardia ( Figura 2 ).
  3. Determine a concentração de TSLP em amostras de sobrenadante utilizando um kit ELISA de acordo com as instruções do fabricante. 13 Compilar estes dados em série para monitorizar a estabilidade da produção de citoquinas durante a cultura celular E ( Figura 2A-B ).
    1. Identificar e descartar estroma produtor de citoquinas com expressão de citoquinas reduzida ou subóptima, bem como quaisquer frascos correspondentes em armazenamento ( Figura 2A-B ).
    2. Identificar e manter o estroma produtor de citocinas que demonstram concentrações estáveis ​​de citocinas de alto nível. Use estes thaws para experimentos.
  4. Utilizar o kit ELISA para monitorizar rotineiramente o estroma ao longo da duração da cultura celular (pelo menos 1 vez durante passagens precoces, médias e tardias pós-descongelamento) para assegurar a produção estável de citocinas ou, no caso do estroma de controlo, a ausência de produção de citoquinas .

3. Ensaios de Citometria de Fosfotograma para Avaliar a Actividade da Citocina Produzida por Stroma

NOTA: Avaliar o sobrenadante do estroma manipulado antes da primeira experiência para verificar a bioactividade relevante da citocina produzida pelo estroma para a experiência individual.Ef "> 6 Uma vez validado o estroma de engenharia, não são necessários mais testes, a menos que sejam introduzidos estromas que tenham sido produzidos com um novo vetor.

  1. Compre linhas de células de leucemia MUTZ5 e / ou MHH-CALL4 (sensíveis a TSLP), 14 citoquinas humanas recombinantes e anticorpos aprovados para utilização em ensaios de citometria de fluxo fosfo para detectar alvos de fosforilação a jusante apropriados.
  2. Descongelou o sobrenadante colhido do controlo e do estroma que expressa citocinas.
  3. Plantar as linhas celulares de leucemia em meio R20 (ver Tabela de Materiais ) a uma concentração de 0,2 x IO6 células por poço numa placa de cultura de tecidos de 96 poços. Placa 3 poços por condição para permitir ensaios em triplicado. Incubar durante 2 h a 37 ° C. Este tempo permite a perda de qualquer fosforilação que ocorreu durante as condições de cultura anteriores.
    NOTA: 12 poços por linha celular proporcionam ensaios em triplicado para cada condição experimental mostrada no passo 3.4.
    4. <Após 2 h em cultura, transferir as células de cada poço para tubos separados de 4 mL e centrifugar a 500 xg durante 5 min, a 4 ° C. Decantar o sobrenadante.
    1. Re-suspender as células em 200 μL para cada uma das seguintes condições experimentais (realizar ensaios em triplicado): 1) meio de controlo negativo apenas, 2) meio de controlo positivo com citocina recombinante a concentração (s) de saturação (TSLP a 15 ng / ML, etc ), 3) estrama-sobrenadante de controlo do estroma de controlo, e 4) sobrenadante de citocina-estroma do estroma produtor de citoquinas.
  4. Incubar as células durante a duração especificada por fosfo-ensaio comercial específico ( por exemplo, 30 min para fosfo-STAT5 em MUTZ5 ou MHH-CALL4 em resposta a TSLP).
  5. Centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C e decantar o sobrenadante.
  6. Realizar a citometria de fluxo fosfo-coloração por protocolo do fabricante e coletar dados de citometria de fluxo. 15
  7. Analisar dados de citometria de fluxo. 15
    1. Portão em células intactas com base no espalhamento de luz (FSC, indica tamanho de célula) e lado (SSC, indica granularidade de célula).
    2. Determine a intensidade fluorescente mediana (IMF) das células intactas em cada amostra. Comparar a IMF média obtida a partir dos valores em triplicado do sobrenadante de células estromais com o dos controlos de meios positivos e negativos.

4. Injeção de Stroma Transduzido por Citocina em Ratos

NOTA: cultura HS-27A estroma para um mínimo de 3 post-thaw passagens antes de injectá-los em ratos para garantir células saudáveis ​​e adequada citocina produção.

  1. Preparação do estroma
    1. Transferir a suspensão de células estromais colhidas para um tubo cônico e alíquota de 10 μL para a contagem de hemocitómetro; Obter contagem de células vivas usando azul de tripano. 16 Centrifugar o restante ceLl de suspensão a 500 xg durante 5 min.
    2. Aspirar o sobrenadante das células sedimentadas e ressuspender suavemente as células no volume necessário de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para injecção de ratinho (dependendo do número de ratos a injectar).
      NOTA Concentra�o de c�ulas estrom�icas t�icas para injec�o de ratinho: 0,5 x 10 6 -5 x 10 6 c�ulas por rato em 200 � de PBS.
    3. Manter a suspensão de células estromais a 4 ° C (ou em gelo) até imediatamente antes da injeção. Assegurar que a suspensão celular seja pelo menos à temperatura ambiente (RT) (~ 25 ° C) para a injecção de ratos.
  2. Injeção de células estromal
    1. Desinfecte a capa de segurança biológica, monte os materiais para injeções e coloque a gaiola do mouse dentro.
    2. Misturar suavemente a suspensão de células por inversão antes de extrair 200 μL numa seringa de tuberculina.
    3. Usando técnicas padrão de injeção intra-peritoneal, 17Restringir o rato e administrar a suspensão celular de 200 μL na cavidade peritoneal. Os detalhes foram previamente demonstrados por Machholz et al. 18

5. Coleta sérica de sangue e monitorização do plasma para a citoquina humana exógena em ratinhos

  1. Coleta de sangue através do snip da cauda
    1. Desinfecte o cofre de biossegurança e monte o dispositivo de retenção do mouse, tesouras e outras ferramentas / suprimentos para o procedimento.
    2. Coloque o mouse em um restrainer e segure o tubo para minimizar o movimento do mouse.
    3. Desinfecte a cauda ea tesoura cirúrgica com álcool isopropílico. Aplicar creme anestésico tópico na cauda.
    4. O uso de tesoura cirúrgica muito afiada corta cerca de 0,5 a 1 mm da ponta da cauda do rato. Recolher aproximadamente 80 μL de sangue periférico utilizando tubos capilares heparinizados.
      NOTA: Se o sangue for coletado com este método mais de seisMes, a remoção da cauda deve ser conservadora com respeito à quantidade de cauda removida. Como snips progridem a cauda do diâmetro aumenta, hemorragias mais rápido, e cicatrização leva mais tempo.
  2. Separação de plasma
    1. Transferir o sangue usando uma seringa de bulbo (para expulsá-lo dos tubos capilares) para um tubo de microtainer K 2 EDTA marcado; Inverter 20 vezes para evitar a coagulação.
      OBSERVAÇÃO: Normalmente, a coagulação sangüínea do ponto de corte da cauda é rápida. No entanto, se a hemorragia persistir mais de ~ 2 min use um lápis / pó estéril para auxiliar a coagulação.
    2. Centrifugar os tubos de coleta de sangue de acordo com as instruções do fabricante e alíquota do plasma para armazenamento (-20 ° C) até que esteja pronto para o ensaio ELISA.
    3. Se forem necess�ios dados de quimerismo de c�ulas de murganho humano a partir do sangue de ratinho, tratar a pelete remanescente como descrito no passo 6.3.1. Caso contrário, descarte o sedimento de células sangüíneas.
  3. ELISA modificado para microvolumeUmes de plasma de rato
    NOTA: O procedimento de ELISA do fabricante foi modificado a partir do volume de amostra recomendado de 100 μL para um volume de 40 μL para acomodar os microvolumes recolhidos a partir de ratinhos. Não é possível executar as amostras de plasma de ratinho in vivo em triplicado com estes volumes limitados. Ao final da experiência ~ 500 μL de sangue post-mortem é coletado via punção cardíaca. As concentrações de citocinas avaliadas em 100 μL de plasma de eutanásia são utilizadas para validar os dados in vivo de 40 μL para cada rato.
    1. Descongelar amostras congeladas de plasma de ratinho.
    2. Diluir seriamente os padrões de ELISA e plaqueá-los em triplicado a 40 μL por poço.
    3. Adicionar 40 μL de cada amostra de plasma de rato à placa ELISA.
      NOTA: Se uma amostra de rato for inferior a 40 μL, em seguida, leve o volume até 40 μL com tampão ELISA. Registre esse volume de diluente e use-o para calcular um fator de diluição para cada amostra diluída. QuandoA análise dos dados de ELISA multiplica a concentração da amostra diluída pelo fator de diluição da amostra para determinar a concentração real de citocinas na amostra original.
    4. Ensaio ELISA completo de acordo com as instruções do fabricante.

6. Transplantação de células hematopoiéticas em ratinhos

  1. Sublethal irradiação para condição medula óssea para transplante
    NOTA: A Loma Linda University (LLU) usa uma fonte de radiação Cobalt-60. Os animais são colocados num dispositivo de retenção de torta que está posicionado a 80 cm da fonte de radiação num campo de 20 x 20 cm e com uma camada de 0,5 cm de Lexan no topo do dispositivo de retenção. O tempo de exposição é calculado para atingir uma dose de 225 cGy com base na calibração mais recente da fonte (actualmente 2-3 min para esta fonte).
    1. Os ratinhos irradiados sub letalmente (dose de irradiação corporal total de 225 cGy máximo para ratinhos deficientes em imunidade).
    2. Transplante células hematopoiéticas ~ 24 h depois via <Injeção intravenosa da veia da cauda.
  2. Transplante de células hematopoiéticas intra-venosas
    1. Preparar suspensões de células humanas para transplante num volume de 200 μL de PBS estéril por ratinho: células estaminais hematopoiéticas CD34 + (HSC): 1 x 10 5 a 5 x 10 5 células por ratinho e linhas de células de leucemia / amostras de doentes: 1 x 10 6 a 5 x IO6 células por ratinho.
    2. Manter as células a 4 ° C (transporte em gelo) até imediatamente antes do transplante. Assegurar que as células estejam pelo menos à temperatura ambiente antes do transplante.
    3. Desinfecte o capuz de bio-segurança e prepare a área do capô para injeções de transplante.
    4. Coloque o mouse na gaiola de aquecimento por pelo menos 5 minutos para permitir a dilatação das veias da cauda.
    5. Misturar suavemente a suspensão celular e extrair 200 μL numa seringa de tuberculina. Com segurança, coloque a agulha de lado onde permanecerá estéril.
    6. Coloque o mouse em uma restrição e desinfetar a cauda com álcool isopropílico.
    7. Utilizando técnicas de injecção intravenosa convencionais, 17 injectam a suspensão de células humanas na veia da cauda de rato.
      NOTA: As injeções de veias de cauda podem levar várias tentativas, especialmente para um manipulador de animais novatos. Kovacscics e Raper JoVE vídeo 19 fornece demonstração detalhada desta técnica animal.
    8. Monitorar a recuperação do mouse por ~ 5 min. Registre quaisquer eventos adversos durante a injeção ( por exemplo , células derramadas, hemorragia grave, traumatismo de cauda excessivo).
  3. Análise do quimerismo de células humanas em sangue periférico de ratinho
    1. Obter o sedimento de células sanguíneas remanescente no tubo microtainer após a separação do plasma (passo 5.2.3).
    2. Para a lise dos glóbulos vermelhos (RBC), ressuspender o sedimento de sangue remanescente num volume de PBS igual ao plasma removido (para substituir o volume de plasma) e misturar bem (vórtex / pipeta).
    3. Transferir cada amostra de sangue ressuspensa para um tubo de 4 mL marcadoE depois adicionar tampão de lise de RBC a cada tubo numa proporção de 1: 9 (900 μL de tampão de lise de RBC para 100 μL de sangue ressuspenso). Incubar durante 5 min à RT. Centrifugar (5 min, 500 xg) e decantar.
    4. Realizar a segunda incubação do tampão de lise de RBC (5 min à RT). Centrifugar e decantar como antes.
    5. Lavar as células restantes em ~ 1 mL de PBS. Centrifugar e decantar como antes.
    6. Ressuspender o sedimento num volume de PBS apropriado para a coloração por citometria de fluxo padrão (isto varia de acordo com o fabricante e os protocolos de laboratório individuais). 20 Utilizar anticorpos de imunofenotipagem validados para a citometria de fluxo para identificar células de ratinho (CD45 + de rato) e células humanas (CD45 + humano) 6 , 21 Bem como marcadores de leucócitos humanos adicionais específicos para a linhagem celular de interesse.
      NOTA: Recomenda-se tomar um pequeno volume (5 μL-20 μL) de cada amostra de rato para criar "amostras agrupadas"; A utilizar para amostras de controlo não coradas, de viabilidade e de isotipo. É a melhor prática ter controlos de isotipo e não corados para cada condição experimental.

7. Avaliação Funcional da Actividade de Citocinas In Vivo

  1. Rato eutanásia e colheita de tecidos
    1. Eutanizar ratinhos via asfixia com CO 2 no momento experimental designado.
    2. Colher sangue através de punção cardíaca e recolher plasma conforme descrito nas etapas 5.2.1-5.2.2.
      NOTA: Recolher o sangue antes de outros tecidos, porque começa a coagular imediatamente após a morte.
    3. Processo do sangue do rato, alíquota e armazenar plasma como no passo 5.2.2.
      1. Em um momento posterior, avaliar a concentração exógena de citocinas no plasma obtido na eutanásia via ELISA de acordo com o protocolo do fabricante. Avaliar e comparar as concentrações exógenas de citoquinas no plasma de murganhos da série in vivoSangue e as amostras de plasma de eutanásia (descritas na secção 5.3).
    4. Adicionar PBS à amostra de sangue remanescente para substituir o volume e o processo do plasma como descrito nos passos 6.3.1 e 6.3.2. Realizar ensaios de citometria de fluxo imediatamente ou ressuspender células em meio de congelamento para armazenamento LN 2 .
  2. Colheita medula óssea (BM) e baço de camundongos PDX e preparar suspensões de células individuais como descrito anteriormente. 22
  3. Obter contagens de células para cada amostra de tecido de rato PDX utilizando ácido acético a 3% com azul de metileno (lisam-se membranas celulares e RBCs deixando núcleos intactos de células vivas) numa diluição 1: 1 e contam as células utilizando um hemocitómetro. Tabular as contagens de células totais para amostras de medula óssea e baço para cada animal.
  4. Centrifugar (500 xg, 15 min) suspensões celulares e decantar o sobrenadante. Realizar ensaios de citometria de fluxo da medula óssea e / ou células do baço imediatamente ou ressuspender em meio de congelamento para LN 2 armazenamento.
    NOTA: Congelar 10 alíquotas de BM (para futuros ensaios bioquímicos) e ~ 5 alíquotas de baço (para futuros transplantes de PDX) por ratinho.
  5. Imunofenotipagem para identificar efeitos funcionais in vivo
    1. Preparar uma mistura-mestre (MM) de anticorpos de citometria de fluxo para imunofenótipo de população (s) hematopoiética (s) responsiva (s) à citoquina de interesse e um segundo MM de anticorpos de controle de isotipo ( Figura 5 e Tabela de Materiais).
    2. Descongelar as partes al�uotas de tecido PDX (banho de contas a 37�) preparadas no passo 7.4.
    3. Lave as células descongeladas transferindo-as para um tubo cónico e adicionando pelo menos 3 vezes o volume de PBS. Centrifugar (500 xg, 5 min) e decantar o sobrenadante.
    4. Repita o passo de lavagem (7.5.3).
    5. Criar alíquotas agrupadas tomando ~ 10 μL-20 μL de células de cada amostra de PDX para o controlo não manchado, o controlo de viabilidade e os controlos de isotipo (ver passo 6.4.6 nota). Mancha todas as amostras, exceto o uNstained, com um corante de viabilidade fixable (marcador de célula morta), incubar e lavar de acordo com o protocolo do fabricante.
    6. Mancha cada amostra de células PDX com fenotipagem-MM de acordo com o protocolo de coloração de citometria de fluxo padrão; Mancha similarmente a amostra (s) de controlo de isotipo reunida com o isotipo-MM. Incubar todas as amostras, lavar com PBS e fixar as amostras por re-suspensão em paraformaldeído a 1%.
    7. Coletar dados de citometria de fluxo e analisar dados usando uma estratégia apropriada para a (s) população (ões) de células de interesse ( Figura 5 ). Uma passagem típica é a seguinte:
      1. Definir células intactas por desenho de um portão FSC e SSC que exclui detritos.
      2. Identificar a população de células vivas por gating em células que são negativas para o marcador de células mortas (este é o "total de células vivas").
      3. Utilizar sub-gates dentro das "células vivas totais" para definir as populações de células com o imunofenótipo desejado (ver Figura 5).
      4. Obtenha oFrequência de populações de células subconjunto dentro da contagem de células vivas total a partir da análise de citometria de fluxo. 6 , 21
    8. Calcular o número de células alvo em cada tecido multiplicando a frequência do subconjunto de células B, dentro das células vivas totais (obtidas no passo 7.5.6.4) pelas contagens de células vivas totais por tecido obtido no passo 7.3 (% de subconjunto de células B x " Hemocitómetro contagem de células ", ver Tabela 1 )
    9. Comparar as contagens de células de populações de células alvo entre ratinhos PDX de controlo e ratinhos PDX que expressam citoquina (TSLP +) PDX para determinar os efeitos funcionais in vivo da citoquina humana exógena ( Tabela 1 ).

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Resultados

Uma visão geral do modelo é mostrada na Figura 1 . Uma vez que a produção de citocinas (TSLP + estroma) e o estroma de controlo foram obtidos são expandidos em cultura. Antes da injeção de estroma em camundongos, o sobrenadante de células estromais é avaliado por ELISA para verificar a produção de citocinas ( Figura 2 ) e a citometria de fluxo fosfo (Protocolo # 3) é usada para verificar a atividade da citocina produzida pelo estroma. O sobrenadante é re...

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Discussão

Este manuscrito descreve um método simples, rápido e relativamente rentável para a engenharia de PDX para expressar citoquina humana exógena. A estratégia descrita aqui é baseada em injecções intraperitoneais semanais de uma linha de células de estroma transduzidas para expressar a citoquina humana, TSLP. Antes da realização dos métodos aqui descritos, o estroma manipulado para expressar níveis elevados da citocina de interesse (TSLP) e o estroma de controlo manipulado de forma semelhante foram gerados. Nos protocolos a...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant, Departamento de Patologia e Anatomia Humana, Departamento de Ciências Básicas e Centro de Disparidades de Saúde e Medicina Molecular da Escola de Medicina da Universidade de Loma Linda e por uma bolsa para promover a pesquisa colaborativa e translacional da Universidade de Loma Linda (KJP). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes de laboratório úmido 
T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, capacidade de 7 mL,  25cm² área de culturaThermo Scientific / Fisher156367
T-75 Falcon Frasco tratado com cultura de tecidos, capacidade de 250 mL, 75 cm² área de cultura e tampa ventiladaCorning Inc. / Fisher353136
T-150 Falcon Frasco Tratado para Cultura de Tecidos, capacidade de 600 mL, 150 cm² área de cultura & tampa ventiladaCorning Inc. / Fisher355001
pipetas sorológicas de 10 mL Falcon357551
tubos cônicos de polipropileno de 15 mLFisher05-539-12
Tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL Falcon352054
tubos cônicos de polipropileno de 50 mL
de 2,0 mL, pontas de4230659Corning Inc. / Fish
2707509er
200 μ Ponteiras de pipeta L Denville ScientificP3020-CPS
10 μ Pontas de pipeta LDenville ScientificP-1096-CP
Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis com Membrana SFCA, Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4  BioLegend423001
Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem calício e magnésio, 1&vezes;Corning cellgro/ Mediatech21-031-CV
Human TSLP ELISA Max Deluxe SetBioLegend434204
3% Ácido Acético com Azul de MetilenoStemcell Technologies7060
Azul de Tripano Corning25-900-Cl
"Tripsina" 1x 0,25% Tripsina 2,21 mM EDTA em HBSSThermoFisher25-053
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP-7949
" R10" meio de cultura celular, % do volume total (faz 565 mL)--Receita de Laboratório
RPMI, 88,5% (500 mL) Mediatech10-040-CV   
FBS, 9,9% (56 mL) Mediatech35-011-CV
L-Glutamina, 0,99% (5,6 mL) Mediatech25-005-Cl
Penicilina-Estreptomicina, 0,50% (2,8 mL) Mediatech30-002-Cl
2-Mercaptoetanol, 0,10% (560 µ L) MP190242
" R20" meio de cultura celular, % do volume total (faz 195 mL)--Receita de Laboratório
        RPMI, 76,84% (150  mL)veja acima
        FBS, 20,49% (40 mL)veja acimaveja acima
        2mM L-glutamina, 1,02% (2 mL)veja acimaveja acima
        1 mM de piruvato de Na, 1,02% (2 mL)veja acimaveja acima
        Penicilina-estreptomicina,  0,51% (1 mL)veja acimaveja acima
        2-Mercaptoetanol, 0,10% (0,1 M),  0,10% (200 µ L)veja acimaveja acima
" Meio de congelamento", % do volume total--Receita de laboratório
" R10" médio, 45%ver receita "R10"-
FBS, 20%ver acima35-011-CV
DMSO, 10%Corning25-950-CQC
D(-)(+)-Trealose di-hidratada, 5%Fisher ScientificBP2687-100
NomeEmpresa<strong>Número Catolog Comentários
Biologics  < / strong>
"HS-27" HS-27A linha de estroma humanoATCCCRL-2496
"CALL-4" MHH-CALL-4 linha celular, leucemia precursora de células B humanasDSMZACC 337
" Ratos NSG" ACENO. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, homem ou mulher, 6 anos – 8 semanasde camundongos JAX # 005557
Linha celular MUTZ-5, leucemia precursora de células B humanasDSMZACC 490
Proteína TSLP humana recombinanteR & D Systems1398-TS-010
NomeEmpresaNúmero CatologComentários
Anticorpos de citomery de fluxo (clone)*
Anti-mouse CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (o nome alternativo é IL-7Rα)Miltenyi Biotec130-098-094
CD34 APC (8G12)BD Biosciences340667
CD45 PE-Cy7  (HI30)eBioscience25-0459
"FVD" Corante de viabilidade fixável  eFluor 780 eBioscience65-0865
Ig κ cadeia leve FITC  (G20-193)BD Pharmingen555791
Ig λ cadeia leve FITC (JDC-12)BD Pharmingen561379
IgD PE (IA6-2)BioLegend348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)BD Biosciences551079
pSTAT5 PE,  camundongo anti-STAT5 (pY694)BD PhosphoFlow612567
Nome CompanyNúmero CatologComentários
Outros materiais e equipamentos 
Animal Implantável Nano Transponder com CânulaTrovan ID-100B(1.25)
EMLA creme anestésico lidocaína (obtido por prescrição através de instalações de cuidados com animais)prescriçãoprescrição
BD½ cc Seringa de Insulina LO-DOSE U-100 28G½  BD#329461
BD Microtainer Tubes com K2EDTABD #365974
CentrífugaBeckman CoulterAlegra X-15R 
Tubos Capilares FisherBrand (Heparinizados)Fisher Scientific22-260-950
HemocitômetroFisher02-671-6
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
Gaiola de Torta de RatoBraintree Scientific, Inc.MPC-1
Limitador de Iluminador de Cauda de Mouse BraintreeScientific, Inc.MTI STD
Trovan IM-300(1.25)
µ Quant Bio-Tek Instruments Inc.MQX200
FlowJoFlowJo, LLCVersão 10
*Todos os anticorpos são anti-humanos, salvo indicação em contrário.
Frascos criogênicos Falcon 352098 pipeta de 1 mL de com rosca externa , , , , , Implantador de Empunhadura de Pistola Software de análise de citometria de fluxo

Referências

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