Avaliação simultânea de Cerebral Hemodinâmica e de espalhamento de luz Propriedades do In Vivo Cérebro de Rato Utilizando Imagem de Reflexão Difusa Multispectral

Summary

A avaliação simultânea da hemodinâmica cerebral e das propriedades de dispersão da luz do tecido in vivo do cérebro de rato é demonstrada utilizando um sistema de imagem de reflexão difusa multiespectral convencional.

Abstract

A avaliação simultânea da hemodinâmica cerebral e das propriedades de dispersão de luz do tecido cerebral de rato in vivo é demonstrada usando um sistema convencional de imagem de refletância difusa multiespectral. Este sistema é construído a partir de uma fonte de luz branca de banda larga, uma roda de filtro motorizada com um conjunto de filtros de interferência de banda estreita, um guia de luz, uma lente coletora, uma lente de zoom de vídeo e uma câmera monocromática de dispositivo acoplado carregado (CCD). Uma janela craniana elipsoidal é feita no osso do crânio de um rato sob anestesia com isoflurano para capturar imagens de refletância difusa multiespectral in vivo da superfície cortical. A regulação da fração inspirada de oxigênio usando um dispositivo de mistura de gases permite a indução de diferentes estados respiratórios, como normóxia, hiperóxia e anóxia. Uma análise de regressão múltipla baseada em simulação de Monte Carlo para as imagens de refletância difusa multiespectral medidas em nove comprimentos de onda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 e 760 nm) é então realizada para visualizar os mapas bidimensionais de hemodinâmica e as propriedades de espalhamento de luz do cérebro de rato in vivo.

Introduction

A técnica de reflexão difusa multicêntrica é a técnica mais comum para obtenção de um mapa espacial de sinais ópticos intrínsecos (IOSs) no tecido cortical. Os IOS observados no cérebro in vivo são atribuídos principalmente a três fenômenos: variações na absorção de luz e propriedades de dispersão devido à hemodinâmica cortical, variação na absorção dependendo da redução ou oxidação de citocromos nas mitocôndrias e variações nas propriedades de dispersão da luz induzidas por alterações morfológicas ¹ .

A luz na gama espectral visível (VIS) para infravermelho próximo (NIR) é efetivamente absorvida e dispersa pelo tecido biológico. O espectro de reflectância difusa do cérebro in vivo é caracterizado por espectros de absorção e dispersão. Os coeficientes de dispersão reduzidos μ _s ' do tecido cerebral na faixa de comprimento de onda VIS-para-NIR resultam numa exposição de espectro de dispersão monótonaMagnitudes menores em comprimentos de onda mais longos. O espectro do coeficiente de dispersão reduzido μ _s '(λ) pode ser aproximado para estar na forma da função de lei de potência ^{2 , 3} como μ _s ' (λ) = a × λ ^-b . O poder de dispersão b está relacionado com o tamanho dos dispersores biológicos no tecido vivo ^{2 , 3} . Alterações morfológicas do tecido e redução da viabilidade do tecido cortical vivo podem afetar o tamanho dos dispersores biológicos ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

Um sistema ótico para a imagem de reflexão difusa multiespectral pode ser facilmente construído a partir de uma lâmpada incandescenteFonte óptica, componentes ópticos simples e um dispositivo monocromático carregado acoplado (CCD). Portanto, vários algoritmos e sistemas óticos para a imagem de reflexão difusa multiespectral foram utilizados para avaliar a hemodinâmica cortical e / ou a morfologia do tecido ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} .

O método descrito neste artigo é utilizado para visualizar tanto a hemodinâmica como as propriedades de dispersão da luz do tecido cerebral de rato in vivo utilizando um sistema de imagem de reflexão difusa multiespectral convencional. As vantagens deste método em relação às técnicas alternativas são a capacidade de avaliar alterações espaciotemporais tanto na hemodinâmica cerebral como no tecido corticalmorfologia, assim como a sua aplicabilidade para vários modelos animais para a disfunção cerebral. Portanto, o método será adequado para investigações de lesão traumática cerebral, ataque epiléptico, acidente vascular cerebral e isquemia.

Protocol

cuidados com os animais, preparação e protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Tóquio de Agricultura e Tecnologia. Por esta metodologia, o rato é alojado num ambiente controlado (24 ° C, 12 h ciclo de luz / escuro), com comida e água disponível ad libitum.

1. Construção de um sistema convencional Multispectral reflectância difusa imagem

1. Montagem nove filtros de interferência de banda estreita ópticos com comprimentos de onda centrais de 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, e 760 nm para os orifícios de filtro do filtro roda motorizada.
2. Construir um sistema de imagem multi-espectral usando uma fonte de luz branca de banda larga, uma roda de filtro motorizado com o conjunto de cima de filtros de interferência de banda estreita, uma guia de luz, uma lente de recolha, uma lente zoom de vídeo, e uma câmara CCD monocromática. A disposição de elementos ópticos, mostrado na Figura 2, pode ser referido para thé um procedimento de construção.
   NOTA: O ângulo de iluminação é de aproximadamente 45 ° em relação à superfície da amostra.
3. Ligar a fonte de luz de lâmpada de halogéneo para iluminar a superfície da amostra através de um filtro de interferência, o guia de luz, e a lente de recolha.
4. Abra o software de operação da câmera CCD.

2. Preparação de animais

NOTA: Neste protocolo, o rato não foi utilizado para as futuras experiências e foi sacrificado imediatamente após as medidas de imagens multiespectrais.

1. Ligar o orifício de entrada de uma câmara de indução para o orifício de saída de uma máquina de anestesia com um tubo. Conectar o orifício de saída da câmara de indução para o orifício de entrada da máquina de anestesia com um segundo tubo.
2. Colocar o rato para a câmara de indução e induzir a anestesia com 5,0% de isoflurano. Manter a anestesia, a uma profundidade tal que o rato não responde a pitadas dedo do pé. euower a 2,0% de isoflurano utilizando um botão rotativo na máquina de anestesia.
3. Fixar a cabeça do rato em um quadro estereotáxico. Anexar um bocal para anestesia à armação estereotáxica.
4. Ligar o orifício de entrada do bocal para a porta de saída do aparelho de anestesia com um tubo. Conectar o orifício de saída do bocal até o porto de entrada da máquina de anestesia com um tubo.
5. Raspar a região da cabeça além do local da incisão prospectivo usando cortadores de cabelo até a superfície da pele aparece.
6. Fazer uma incisão longitudinal de aproximadamente 20 mm long ao longo da linha média da cabeça, usando um bisturi cirúrgico (Figura 1 (a)) e expor os tecidos conjuntivos subcuteos (Figura 1 (b)).
7. Remover os tecidos conjuntivos subcuteos utilizando uma cureta afiada ou uma pinça e puxá-lo para ambos os lados da cabeça para expor o crânio de osso (Figura 1 (c)).
8. Escavar uma vala elipsoidal sobre o osso do crânio no interior do sutur cranianaES (sutura coronal, sagital de sutura e sutura lambdóide) utilizando uma broca de alta velocidade (Figura 1 (d)).
9. Lenta e homogeneamente escavar o osso do crânio dentro da vala usando a broca de alta velocidade.
10. Pressione levemente na superfície do crânio afinada com a ponta da pinça para estimar a espessura e força óssea depois de um vaso sanguíneo cerebral aparece. Se a região adelgaçada crânio deprime facilmente, terminar a redução do osso do crânio com a broca de alta velocidade.
11. Cortar a linha de fronteira elipsoidal do crânio diluído fragmentada utilizando a ponta da pinça ou pequenas tesouras cirúrgicas.
12. Remover o crânio diluído a partir da superfície do cérebro lenta e suavemente usando a pinça.
13. Suavemente banhar a janela craniana com solução salina fisiológica e cobri-lo com uma placa de vidro transparente, aproximadamente, 0,1 mm de espessura.

3. Regulamentação da fração inspirada de oxigênio

NOTA: O condi respiratóriação pode ser alterada através do controlo da fracção de oxigénio inspirada (FiO _2).

1. Usando um tubo, ligar o primeiro porto de um conector de tubo em forma de Y (conector 1) para a primeira porta de outro conector de tubo em forma de Y (conector 2).
2. Ligar o orifício de entrada do bocal para a segunda porta de conector do tubo 1.
3. Usando um tubo, ligar a terceira porta de conector do tubo 1 para um dispositivo de oxigénio monitor de concentração.
4. Com um tubo, ligar a segunda porta de ligação de tubo 2 para a porta de saída de um aparelho de anestesia.
5. Usando um tubo, ligar a terceira porta de ligação de tubo 2 para a porta de saída de um dispositivo de mistura de gás.
6. Conectar um orifício de entrada do dispositivo de mistura de gás a uma alta pressão de 95% _{de O2} - 5% de CO ₂ do cilindro de gás, utilizando um tubo.
7. Ligue a outra porta de entrada do dispositivo de mistura de gás a uma alta pressão de 95% de N ₂ - 5% cilindro de gás de CO ₂ usando um tubo.
8. Alterar as taxas de fluxo de gás Sf O ₂ e N _2, utilizando os botões rotativos no dispositivo de mistura de gás.
9. Verificar e regular a FiO _2, utilizando o dispositivo de oxigénio monitor de concentração.

4. Aquisição das Multispectral de reflectância difusa Imagens

1. Aquisição de imagens de referência
   NOTA: Os componentes ópticos utilizados nesta experiência, tais como a fonte luminosa, de fibra óptica, e os detectores têm as suas próprias características espectrais. Portanto, a intensidade da luz que passou através destes componentes deve ser gravado como uma imagem de referência. A imagem de referência é uma imagem tirada com um difusor branco padrão iluminado com a luz da fonte de luz.
   1. Coloque o difusor branco padrão no palco horizontalmente.
   2. O foco da lente da câmara sobre a superfície do difusor branco, rodando o anel de zoom no barril.
   3. Ajustar o tempo de integração da câmera selecionando o valor apropriado nadrop-down lista de tempos de integração no software de operação da câmara para que a maior quantidade de luz produz um sinal que é aproximadamente 75% das contagens máximas. Enquanto observa o histograma de valores de pixel, ajustar o tempo de integração até que o nível de intensidade de sinal é de aproximadamente 75% das contagens máximas.
   4. Selecione o comando "salvar" no menu arquivo para salvar uma imagem em um arquivo.
   5. Alterar a localização do filtro, rodando a roda de filtro.
   6. Guardar uma imagem aos outros comprimentos de onda de acordo com o processo descrito acima. O nome do arquivo deve identificar a amostra e o comprimento de onda utilizado (por exemplo, W500, W520, W540 ... W760).
2. Aquisição de imagens de exemplo
   Nota: Imagens da intensidade da luz difusa refletida de cérebro de rato expostos em nove comprimentos de onda são capturados e salvos no disco rígido de um computador pessoal utilizando as mesmas condições de aquisição.
   1. Delicadamente, coloque o rna no palco e, lentamente, ajustar o nível do palco para que a câmara pode focar na superfície do cérebro de rato.
   2. Selecione o comando "salvar" no menu arquivo para salvar uma imagem em um arquivo.
   3. Alterar a localização do filtro, rodando a roda de filtro.
   4. Guardar uma imagem aos outros comprimentos de onda de acordo com o processo descrito acima. O nome do arquivo deve identificar a amostra e o comprimento de onda (por exemplo, R500, R520, R540 ... R760).
3. Aquisição de imagens escuras
   NOTA: A câmara CCD pode gerar uma intensidade de luz em resposta a um sinal eléctrico. No entanto, existe alguma saída menor devido ao ruído nos circuitos elétricos e detectores, mesmo se a luz não entra no detector; isso é chamado de ruído atual escuro. Para medir com precisão a intensidade espectral da luz, a componente de corrente escura deve ser gravado como uma imagem escura e então subtraído a partir do sinal medido. A imagem escura é uma tomada de imagemn com o percurso da luz bloqueada.
   1. Desligue a fonte de luz lâmpada de halogéneo.
   2. Bloquear o caminho da luz ao sistema de câmera CCD usando uma placa de blindagem.
   3. Selecione o comando "salvar" no menu arquivo para salvar uma imagem em um arquivo. O nome do arquivo deve identificar a amostra (por exemplo, Escuro).

5. Visualizando o conteúdo de hemoglobina eo espalhamento de luz Parâmetro

NOTA: Um conjunto de imagens por reflexão multiespectrais é salva no disco rígido de um computador pessoal e analisados ​​offline. Uma análise de regressão múltipla auxiliado por uma simulação de Monte Carlo ¹⁹ das imagens de reflectância difusa multi-espectrais em nove comprimentos de onda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, e 760 nm) é então realizada para visualizar o bidimensional mapas de concentração de hemoglobina oxigenada, a concentração de hemoglobina desoxigenada, a concentração total de hemoglobina, saturação de oxigénio cerebral regional, e fezestering poder. O algoritmo detalhada foi publicada nas literaturas ^{17, 18.}

1. Subtrair a imagem escura de ambas a imagem de referência e a imagem da amostra em cada comprimento de onda.
2. Normalizar a imagem da amostra pela imagem de referência em cada comprimento de onda λ. Tratar a imagem normalizada, tal como a imagem de reflectância difusa R.
3. Calcular a absorvância (ou densidade óptica) uma imagem, tendo o logaritmo do recíproco da imagem reflectância difusa R em cada comprimento de onda λ:
   (1)
4. Gerar uma matriz tridimensional por empilhamento das imagens de absorvância na ordem dos seus comprimentos de onda, onde o x - plano y mostra a informação estrutural obtida para a superfície do cérebro e o z -axis mostra a informação espectral.
5. PERuma análise de regressão múltipla para o espectro de absorvância A ( λ ) em cada coordenada xy.
6. Utilize o espectro de absorvância A ( λ ) como variável dependente e os espectros de coeficiente de extinção molar da hemoglobina oxigenada ε _HbO ( λ ) e da hemoglobina desoxigenada ε _HbR ( λ ) como variáveis ​​independentes para o passo 5.5 (valores publicados para ε _HbO ( λ ) E ε _HbR ( λ ) são _fornecidos na Tabela 1 ).
7. Verifique os mapas bidimensionais (imagens) dos três coeficientes de regressão múltipla a _HbO , a _HbR e a ₀ .
8. Gere uma matriz tridimensional empilhando as imagens dos coeficientes de regressão múltipla na ordem de um _HbO , um _HbR , e um ₀ , onde o y plano mostra a informação estrutural obtida para a superfície do cérebro e o z -axis mostra os vários coeficientes de regressão.
9. Calcule a concentração de hemoglobina oxigenada C _HbO, a hemoglobina desoxigenada concentração C _HBr, e o poder de dispersão b a partir do conjunto de regressão múltipla coeficientes a _HbO, um _HBr, e um ₀ em cada coordenada xy usando as seguintes fórmulas empíricas (ele valores de β _{HbO, i,} β _{HBr, i,} e β _{0, i} (i = 0,1,2,3) são fornecidos na Tabela 2):
   (2)
   (3)
   (4)
10. Verificar os mapas bidimensionais (imagens) da concentração de hemoglobina oxigenada C _HbO, a concentração de hemoglobina desoxigenada C _HBr, e o poder de dispersão b.
11. Calcular um mapa bidimensional do C _HBT concentração total de hemoglobina pela soma C e _HbO C _HBr em cada x - y de coordenadas.
12. Calcular um mapa bidimensional da saturação de oxigénio cerebral regional RSO ₂ dividindo a concentração de hemoglobina oxigenada C _HbO pelo C _HBT concentração total de hemoglobina em cada x - y de coordenadas.

Results

Imagens espectrais representativas de reflectância difusa adquirido a partir de cérebros de rato in vivo são apresentados na Figura 3. As imagens em 500, 520, 540, 560, 570, e 580 nm visualizar claramente uma rede densa de vasos sanguíneos no córtex cerebral. A deterioração do contraste entre os vasos sanguíneos e o tecido circundante observadas nas imagens em 600, 730, e 760 nm reflecte a diminuição da absorção de luz pela hemoglobina no mais longo e compriment...

Discussion

O passo mais importante neste protocolo é a remoção da região do crânio diluído para fazer a janela craniana; esta deve ser realizada com cuidado para evitar hemorragias inesperadas. Este passo é importante para a obtenção de alta qualidade multiespectrais difundir imagens de reflectância com alta precisão. O uso de um microscópio estereoscópico é recomendado para o procedimento cirúrgico, se possível. Pequenos pedaços de esponja de gelatina são úteis para hemostasia.

O sistema óptico descri...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fonte de luz de lâmpada halógena de 150 W	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tóquio, Japão	LA-150SAE
Guia de luz	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tóquio, Japão	LGC1-5L1000
Lente coletora	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tóquio, Japão	SH-F16
Filtros de interferência l@ 500 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	#65088
Filtros de interferência l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	#65093
Filtros de interferência l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	#65096
Filtros de interferência l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	#67766
Filtros de interferência l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	#67767
Filtros de interferência l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	#65646
Filtros de interferência l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	#65102
Filtros de interferência l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	#65115
Filtros de interferência l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	#67777
Roda de filtro motorizada	Andover Corporation, NH, EUA	FW-MOT-12.5
Câmera CCD monocromática de 8 bits	THE IMAGINGSOURCE, Alemanha	DMK21BU618. H
Lente de zoom de vídeo	Edmund Optics Japan Ltd, Tóquio, Japão	VZMTM300i
Padrão branco espectral com refletância difusa de 99%	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	SRS-99-020