Artigo de método

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

1 de maio de 2017

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1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

Neste artigo

Resumo

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precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Resumo

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Há uma demanda crescente para analisar muitas amostras biológicas para a compreensão da doença e descoberta de biomarcadores. estratégias de proteômica quantitativas que permitem a medição simultânea de múltiplas amostras tornaram-se generalizada e reduzir consideravelmente os custos experimentais e tempos. O nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada precursor combinado marcação isotópica e etiquetagem isobárica (cPILOT), que aumenta a amostra multiplexagem de marcação isotópica tradicional ou abordagens de marcação isobáricas. cPILOT global pode ser aplicada a amostras provenientes de células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros e dá informação sobre a abundância relativa de proteína em diferentes condições de amostra. cPILOT funciona por 1) usando condições de baixa tampão de pH para selectivamente péptido dimethylate terminais N e 2) utilizando condições de tampão de pH elevado para rotular aminas primárias de resíduos de lisina com reagentes isobáricas comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais / Reagentes). O grau demultiplexagem amostra disponível é dependente do número de etiquetas precursor utilizado e o reagente de marcação isobárica. Aqui, apresentam-se uma análise de 12-Plex utilizando luz e dimetilação pesada combinada com reagentes isobáricas seis-plex para analisar 12 amostras de tecidos de rato em uma única análise. multiplexagem aumentada é útil para reduzir o tempo e custo experimental e mais importante ainda, permitindo a comparação entre muitas condições de amostra (réplicas biológicas, estágio da doença, tratamentos medicamentosos, genótipos, ou pontos de tempo longitudinais) com polarização menos experimental e erro. Neste trabalho, a abordagem cPILOT global é utilizado para analisar o cérebro, coração e tecidos do fígado em todo repetições biológicas dos controles modelo do rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. CPILOT global pode ser aplicada ao estudo de outros processos biológicos e adaptada para aumentar a multiplexagem amostra para maior do que 20 amostras.

Introdução

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Proteomics muitas vezes envolve a análise de muitas amostras utilizadas para melhor compreender os processos de doença, de cinética enzimática, modificações pós-traducionais, resposta a estímulos ambientais, de resposta a tratamentos terapêuticos, a descoberta de biomarcadores, ou mecanismos de drogas. Os métodos quantitativos podem ser utilizados para medir as diferenças relativas nos níveis de proteína através das amostras e pode ser livre de marcador ou envolver a marcação isotópica (metabólica, químicos, ou enzimáticos). Os métodos de marcação de isótopos estáveis ​​têm crescido em popularidade, porque eles permitem muitas amostras a ser analisadas simultaneamente e são adequados para as amostras a partir de diferentes células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros. Marcação isotópica métodos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, aumentar o rendimento experimentalenquanto reduz o tempo de aquisição, custos e erro experimental. Estes métodos usam espectros de massa precursor para medir a abundância relativa de proteínas a partir de picos peptídicos. Em contraste, os reagentes de marcação isobáricas 8, 9, 10 gerar is repter que, ou são detectadas em MS / MS ou MS 3 11 e espectros estes picos são usados para informar sobre abundâncias relativas das proteínas.

O atual estado-da-arte no multiplexagem proteómica ou é uma análise de marcação isobárica 10-Plex 12 ou 12-Plex 13. Multiplexagem amostra melhorada (isto é,> 10 amostras) os métodos têm sido desenvolvidos pelo nosso laboratório para os tecidos 14, 15, 16, 17, e por outro para a análise de células 18 sup>, 19, 20, 21 tecidos, ou péptidos segmentados 22. Desenvolvemos uma técnica de multiplexagem reforçada chamado precursor de marcação isotópica combinado com marcação isobárica (cPILOT). CPILOT global é útil para a obtenção de informações sobre as concentrações relativas de todas as proteínas em diferentes condições de amostra (≥12) 14. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho geral cPILOT. Peptídeos trípticos ou Lys-C são selectivamente marcado na extremidade N-terminal com dimetilao usando baixo pH 2 e nos resuos de lisina com 6-Plex reagentes usando pH elevado. Esta estratégia dobra o número de amostras que podem ser analisadas com os reagentes isobáricas que ajuda a reduzir os custos experimentais e, adicionalmente, reduz passos experimentais e tempo.

cPILOT é flexível como nós desenvolvemos outros métodos para estudar modi oxidativo pós-translacionalções, incluindo as proteínas de 3-nitrotirosina modificado 14 e péptidos contendo cisteina, com S-nitrosilação (oxcyscPILOT) 23. Também desenvolvemos um aminoácido abordagem selectiva, cPILOT cisteína (cyscPILOT) 17. MS 3 aquisição com uma parte superior de iões de 11 ou selectiva-y 1 -Permutadores método 15 pode ajudar a reduzir a interferência de iões repórter e melhorar a exactidão quantitativa de cPILOT. O uso de MS no 3 o método de aquisição requer um instrumento de alta resolução com um analisador de massa Orbitrap apesar dos instrumentos de armadilha de iões de baixa resolução, podem também trabalhar 24.

Anteriormente, cPILOT tem sido usado para estudar proteínas hepáticas 16 de rato modelo da doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos como realizar análise cPILOT mundial usando cérebro, coração e homogeneizados de fígado para estudar o papel do periphery na doença de Alzheimer. Esta experiência incorpora replicação biológica. Devido à versatilidade de cPILOT, os usuários interessados ​​podem usar a técnica para estudar outros tecidos para uma série de problemas e sistemas biológicos.

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Protocolo

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Ética declaração: Ratos foram comprados a partir de um sem fins lucrativos, instituição independente, a investigação biomédica e alojados na Divisão de Recursos Animais de Laboratório da Universidade de Pittsburgh. Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Pittsburgh.

1. Extração de Proteínas e produção de péptidos para a etiquetagem Chemical

  1. Extracto de proteína a partir de tecido, células, ou fluidos corporais.
    1. Homogeneizar 60-90 mg de tecido (por exemplo, cérebro, coração, fígado e) em solução salina de tampão fosfato (PBS 1x) com ureia 8 M (500 mL), utilizando um homogeneizador mecânico. Os inibidores de protease ou de fosfatase pode ser adicionado ao tampão, se necessário. Neste projeto, eles não foram usados. Utilizar os seguintes parâmetros para o homogeneizador: lisar os grânulos da matriz A, 4 m / s, 20 s. tecido cardíaco pode exigir até 9 ciclos de homogeneização.
      NOTA: Protease ou inibidor de fosfatase s pode ser adicionado ao tampão, se necessário. Eles não foram utilizados neste estudo.
      1. Remover homogeneizado de tecido a partir do tubo de lise e transferir para um tubo de micro-centruga. Lavar tubos de lise com 100-500 ul de PBS com 8 M de ureia e combinar a solução de lavagem com o homogeneizado de tecido.
    2. Centrifugar os tecidos homogeneizados (9447 xg, 4 ° C, 15 minutos) e recolher o sobrenadante.
  2. Determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: A diluição adicional com tampão pode ser necessário se a concentração de proteína é muito alta. As concentrações resultantes para amostras a partir destes tecidos eram entre 6-13 ug / uL.
    1. Opcional: adicionar um padrão interno de controlo da qualidade (por exemplo, caseína alfa bovina ou outra proteína exógena) com o padrão ug proporção 1: amostra de proteína de 100 ug.
jove_title "> 2. Digestão Amostra

  1. Adiciona-se 100 ug (100 x 10 -6 g) de proteína de cada amostra para tubos etiquetados individualmente micro-centrífuga. O volume é dependente da concentração de proteína (ver passo 1.2).
  2. Adicionar ditiotreitol (DTT) (40: 1 de reagente para provar razão molar) a cada amostra. Incubar a 37 ° C durante 2 h. O cálculo para a razão molar é baseada fora a massa de proteína de albumina de soro bovino (BSA), que é de 66,5 x 10 3 g / mole.
  3. Adicionar iodoacetamida (IAM) (80: 1 de reagente para provar razão molar) a cada amostra. Incubar em gelo no escuro durante 2 h. Esta reacção é realizada em gelo durante 2 h, para evitar reacções secundárias.
  4. Adicionar L-cisteína (40: 1 de reagente para provar razão molar) a cada amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  5. Adiciona-se 20 mM de tampão Tris com 10 mM de CaCl2 (pH 8,2) para diluir ureia para uma concentração final de 2 M.
  6. Adicionar L-1-tosilamido-2 feniletil clorometil-cetona (TPCK) tripsina -treated (50: Um substrato para a enzima razão molar) a cada amostra e incubar a 37 ° C durante 24 h.
  7. Extingue-se a digestão de proteínas por flash-congelação da amostra em azoto líquido e armazenar a -80 ° C até processamento adicional.

Dessalinização 3. Amostra

  1. Re-acidificar as amostras pela adição de ácido fórmico (FA). Adicionar suficiente FA para se obter uma concentração final de 0,1%. Se as amostras são inicialmente a -80 ° C, descongelar as amostras em gelo antes de re-acidificação.
  2. De-sal utilizando os péptidos C 18 lipofílico hidrofílico em relação (HLB) cartuchos de 10 mg tal como previamente descrito 16.
  3. Secam-se as amostras por centrifugação de vácuo (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) para um volume de ~ 10 mL.

4. dimetilao Rotulagem (N-terminais)

  1. Reconstituir péptidos em ácido acético a 1% (0,25 mg / mL) dissolvido em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou água de grau de nano-puro. Remover a 50 μ; G de porção para um novo tubo de micro-centruga (1,5 mL) e armazenar o restante à temperatura de -80 ° C.
  2. Adiciona-se 8 mL de 60 mM (4%) CH 2 O (37% p / v) ou 60 mM (4%) 13 CD 2 O (20% p / v) às amostras para marcação com luz ou dimetilao pesado, respectivamente . Tipicamente, 4 uL de reagente é adicionado por 25 ug de péptidos (Passos 4.2, 4.3, 4.6).
  3. Adicionar 8 mL de mM de NaBH3CN ou 24 mM NaBD 3 CN 24 para as amostras marcadas com luz ou dimetilao pesada, respectivamente.
  4. Vortex e agitar num agitador de tubo durante ~ 10 min a temperatura ambiente.
  5. Extingue-se as reacções através da adição de 16 uL de 1% de amoníaco (~ 28-30% v / v) durante 5 min. Tipicamente, 8 uL de reagente é adicionado por 25 ug de péptidos.
  6. Re-acidificar as misturas reaccionais através da adição de 8 pL de 5% de FA (98% v / v).
  7. Combinar a luz e péptidos pesados dimetilada (Figura 1) para gerar um total de seis amostras. Ver Tabela 1 para uma descrição de etiquetagem da amostra e a concentração utilizada para este estudo.
  8. Realizar a dessalinização da amostra de acordo com os passos 3.2 e 3.3.

5. Isobaric Marcação (resíduos Lys)

  1. Reconstituir 100 ug de péptidos dimetilada (1 ug / uL) em 100 mM de bicarbonato de amónio tri-etil (BTEA) (pH ~ 8,5).
  2. Preparar reagentes isobáricas como indicado no protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais / Reagentes).
  3. Adicionar reagentes isobáricas solubilizadas (41 ul) aos péptidos e vortex durante ~ 10 s. Agitar as amostras num agitador tubo de micro-centrífuga durante ~ 1 h. Extingue-se a reacção com 8 mL de hidroxilamina (10% w / v) e incuba-se as amostras durante 15 min à temperatura ambiente.
  4. Reúnem-se os seis amostras marcadas em uma única mistura e desalt (Passos 3,1-3,3) ou armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
    NOTA: Para melhorar a cobertura proteoma e profundidade, uma estratégia de separação multi-dimensional é sugeridotais como de permuta de catiões forte (SCX).

6. troca catiônica forte

  1. Execute SCX conforme o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    1. Prepara ~ 1 ml de soluções de formiato de amónio (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, e 500 mM) com 10% de acetonitrilo (ACN), 0,1% de FA (pH 3).
    2. Remover a tampa vermelha a partir do topo da ponta da pipeta e toque a ponta da pipeta com a suspens de embalagem para assegurar que o material de embalagem é para a parte inferior da ponta da pipeta.
      NOTA: Critical: Não jogue fora a ponta da pipeta até o final do protocolo.
    3. Colocar a placa de centrífuga para o topo de um tubo de micro-centruga (2 mL) e fixar a ponta da pipeta para dentro.
    4. Adicionar 150 uL de tampão de reconstituição SCX para pontas de pipeta.
    5. Centrifugar as pontas de pipeta para 6 min à temperatura ambiente (4000 xg). Repita este passo mais duas vezes e descartar os resíduos.
    6. Dissolve-se o peptides em 150 uL de tampão de reconstituição de SCX. Certifique-se de que o pH é de 3.
    7. Adicionar peptídeos para as pontas de pipetas, centrífuga (ver 6.1.5), e manter o eluente.
    8. Transferir o filtro e pipeta para um novo tubo de micro-centruga (2 mL) e adicionar 150 mL de solução de formato de amónio 20 mM. Centrifugar durante 6 min à temperatura ambiente (4000 xg) e manter o eluente.
    9. Repetir o passo 6.1.8 mais sete vezes, utilizando concentrações sucessivas (isto é, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM e 500 mM) de formiato de amónio.
  2. Transferir as oito fracções SCX para tubos de micro-centrifugação (1,5 mL) e concentrá-las utilizando evaporação centrífuga (ver passo 3.3).

7. Cromatografia Luida-Espectrometria de Massa em Tandem (LC-MS / MS) e MS 3

  1. Reconstituir os péptidos em água grau de espectrometria de massa com 0,1% de FA, filtrar, e colocar num frasco de auto-amostrador. peptídeos filtro como follOWS:
    1. Adicionar péptidos reconstituídos para um tubo de micro-centruga contendo um filtro de 0,65? M (ver Materiais Tabela).
    2. péptidos centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Remover filtro, descartar, e adicionar péptidos filtrados para um frasco de auto-amostrador.
  2. Prepare os buffers de fase móvel como se segue: 3% (v / v) de ACN com 0,1% de FA (A) e 100% de ACN com 0,1% de FA (B).
  3. Injectar 6 uL de cada amostra de fracção de SCX numa coluna armadilha embalado a 2 cm com 18 C-prima (5? M, 200 A de tamanho de poro).
    NOTA: a limpeza da amostra sobre a armadilha é como se segue: 3 min, 0% de B; 3 mL / min usando um sistema de cromatografia líquida de 2D (ver Materiais Tabela).
  4. Execute o método de separação analítica. Utilizar uma coluna ID de 75 um x 13,2 centímetros de laser puxou-ponta capilar de sílica fundida embalados com material de C 18 (5? M, 100 Â). O gradiente é: 0-5 min, 10% de B; 5-40 min, 10-15% de B; 40-90 min, 15-25% de B; 90-115 min, 25-30% de B; 115-130 min, 30-60% de B; 130-135 min, 60-80% de B; 135-145 min, 80% de B, 145-150 min, 80-10% de B; 150-180 min, 10% de B; 300 nL / min, 180 min.
  5. Execute o de aquisição de dados para o espectrômetro de massa, enquanto o método de separação analítica está em execução.
    NOTA: Os parâmetros para a verificação levantamento MS são como se segue: 400-1,600 m / z, a resolução de 60.000, o controlo automático de ganho (AGC) alvo 1 x 10 6 de iões, o tempo máximo de injecção de 500 ms. Parâmetros para CID-MS / MS são os seguintes: Topo 1-7 ou aquisição dependente dos dados Topo 8-14 (DDA), 3 m / z largura isolamento, 500 de sinal mínimo, 35% da energia de colisão normalizada (NCE), 0,25 q activação , 10 ms de tempo de activação, a 3 x 10 4 AGC, 50 ms de tempo máximo de injecção. Parâmetros para HCD-MS 3 são como se segue: 200 de sinal mínimo, 4 largura m / z isolamento, 60% NCE, o tempo de activação 0,1, 3 x 10 5 AGC, 250 ms de TI, 300-1,300 m / z intervalo de selecção MS / MS , excluir ião progenitor não fragmentado.
  6. Realizar cada análise em duplicado, tanto para o topo 1-7 e superior 8-14 corridas.
    NOTA: Para as amostras executado em um modelo mais recente de um instrumento contendo uma Orbitrap ou um espectrómetro de massa Tribrid, DDA parâmetros irão variar e pode ser optimizado para incluir mais de MS / MS e MS 3 varrimentos. Além disso, para instrumentos Tribrid, selecção precursor síncrono (SPS) -MS 3 deve ser empregue.

8. Análise de Dados 16

  1. Pesquisar os arquivos RAW usando software de análise de proteína contra um banco de dados apropriado, como rato UniProt.
    NOTA: É importante criar dois fluxos de trabalho para cada arquivo RAW, a fim de procurar a luz e peptídeos dimetilado pesados.
  2. Pesquisa os arquivos RAW usando os seguintes parâmetros: tripsina com duas clivagens perdidas, gama de massa de péptido 300-6,000 Da, 15 ppm pai tolerância massa, uma tolerância Da fragmentação. modificações estáticos: dimetilao luz (28,031, de péptido N-terminal) ou hdimetilao eavy (36,076 Da, ptido N-terminal), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
    NOTA: Às vezes o pico dimetilada pesado é ~ 7 Da (35,069 Da, ptido N-terminal) é a partir da luz dimetilado pico e, portanto, deve ser incorporada no fluxo de trabalho de pesquisa para péptidos dimetilado pesados. modificações dinâmicos: oxidação (15,995 Da, H), TAG isobárica 6-Plex (229,163 Da, K). Incluem uma pesquisa da base de dados de engodo para proporcionar taxas de detecção falso (por exemplo, 1 e 5%) e um nó de quantificação para procurar as intensidades de iões repórter de etiquetas isobáricas.
  3. Estatisticas
    1. dados de exportação para um programa de folha de cálculo electrónica, a fim de normalizar os valores de iões repórter proteína. Para cada proteína, dividir ambos os rácios de iões repórter mediana ou intensidades de iões repórter em bruto pela proporção mediana do padrão interno ou intensidades de iões repórter matérias do padrão interno, respectivamente. Use o software estatístico adequado, tais como um programa de planilha eletrônica, Perseus, ou R para determinar alterações significativas entre condições de amostra.

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Resultados

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cPILOT utiliza química à base de amina de péptidos quimicamente etiqueta na extremidade N-terminal e resuos de lisina e melhora as capacidades de multiplexação de amostra. A Figura 2 mostra os dados de MS representante que é obtido a partir de uma análise cPILOT 12-Plex de cérebro, coração, fígado e tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. Como mostrado na Tabela 1, duas réplicas biológicas para ratinhos ...

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Discussão

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cPILOT permite a medição simultânea de mais do que 12 amostras originais. A fim de assegurar a etiquetagem bem sucedido em ambos os resíduos do N-terminal e lisina de péptidos, é imperativo ter o pH correcto para cada conjunto de reacções e para executar a primeira reacção dimetilao para rotulagem péptido. dimetilao selectiva na extremidade N-terminal é realizada por ter um pH em ~ 2,5 (± 0,2). Isto é conseguido através da exploração das diferenças de pKa de um dos grupos amino de lisina e o N-terminus. A pH 2,5, a lisi...

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Divulgações

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Os autores não têm interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Os autores reconhecem a Universidade de Pittsburgh start-up fundos e NIH, concessão NIGMS R01 (GM 117191-01) para RASR.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Água - MS GradeFisher ScientificW6-44 L quantidade não é necessária
Acetonitrila - MS GradeFisher ScientificA955-44 L quantidade não é necessária
Ácido AcéticoJ.T. Baker9508-01
Solução de hidróxido de amônio (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Formato de amônioAcros Organics208-753-9
Ácido fórmicoFluka Analytical94318-250ML-F
BCA kit de ensaio de proteína PierceThermo Fisher Scientific23227
UreiaBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Ditiotreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Iodoacetamida (IAM)Acros Organics144-48-9
L-cisteínaSigma Aldrich, Química168149-25G
L-1-tosilamido-2 feniletil cloro-cetona (TPCK) - tratada com tripsina de pâncreas bovinoSigma Aldrich, Life ScienceT1426-100MG
Solução de formaldeído (CH2O); 36,5 - 38% em H2OSigma Aldrich, Ciências da VidaF8775-25ML
Solução de formaldeído (13CD2O); 20% em peso em D2O, 98 átomos % D, 99 átomos % 13CSigma Aldrich, Química596388-1G
Cianoborohidreto de sódio; grau de reagente, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Cianobororodeuterito de sódio; 96% de átomos D, 98% CPSigma Aldrich, Química190020-1G
Troca de Alimentos Fortes (SCX) kit de preparação de amostrasde pontas de spin Protea BioSciencesSP-155-24kit
Tampão de bicarbonato de trietil amônio (TEAB)Sigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Kit de Marcação Isobárica (TMT 6 plex) - 6 reações (1 x 0,8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Cloridrato de hidroxilaminaSigma Aldrich, Química255580-100G
Misturador de vórtice padrãoFisher Scientific2215365qualquer misturador pode ser usado
Oasis HLB 1 cc (10 mg) cartuchos de extraçãoWaters186000383Estes são cartuchos C18
Coletor de vácuo Visiprep SPE, DL (revestimento descartável), modelo de 24 portasSigma Aldrich57265Um modelo de 12 portas também é suficiente
Speed-vacThermo ScientificSPD1010qualquer marca de speed vac é suficiente
Câmara de banho de águaThermo Scientific2825/2826Qualquer marca de câmara de banho de água com temperaturas controladas é suficiente.
Homogeneizador Mecânico (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D com amostrador automático Nano LC AS-2Sciex-Estemodelo não está mais disponível. Qualquer nano LC com um amostrador automático é suficiente.
Espectrômetro de massa LTQ Orbitrap VelosThermoScientific-Estemodelo não está mais disponível. Outros instrumentos de alta resolução (por exemplo Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion ou Orbitrap Fusion Lumos) podem ser usados.
Software de proteína (e.g. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Balança analíticaMettler ToledoAL54
Placa de agitaçãoVWR12365-382Qualquer marca de placas de agitação é suficiente
Medidor de pH (compatível com Tris)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Qualquer marca de medidor de pH é suficiente Buffer de
pH 10Fisher Scientific06-664-261Qualquer marca de buffer de pH 10 é suficiente
pH 7 bufferFisher Scientific06-664-260Qualquer marca de tampão de pH 7 é suficiente
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific05-408-129Qualquer marca de tubos eppendorf de 1.5 mL são suficientes
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pkFisher Scientific04-408-120Qualquer marca de tubos eppendorf de 0.6 mL são suficientes
0.65 µ m Unidades de filtro centrífugo MC DV MDMilliporeUFC30DV00
2 mL, 72 unidadesThermo Scientific69720
C18 material de embalagem (5  µ m, 100 &)BrukerPM5/61100/000Este item não está mais disponível na Bruker. Material de embalagem alternativo com especificações listadas será suficiente
C18 material de embalagem (5  µ m, 200 &)BrukerPM5/61200/000Este item não está mais disponível na Bruker. Material de embalagem alternativo com especificações listadas será suficiente
tubos de microcentrífuga de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
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