Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

Summary

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Abstract

Há uma demanda crescente para analisar muitas amostras biológicas para a compreensão da doença e descoberta de biomarcadores. estratégias de proteômica quantitativas que permitem a medição simultânea de múltiplas amostras tornaram-se generalizada e reduzir consideravelmente os custos experimentais e tempos. O nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada precursor combinado marcação isotópica e etiquetagem isobárica (cPILOT), que aumenta a amostra multiplexagem de marcação isotópica tradicional ou abordagens de marcação isobáricas. cPILOT global pode ser aplicada a amostras provenientes de células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros e dá informação sobre a abundância relativa de proteína em diferentes condições de amostra. cPILOT funciona por 1) usando condições de baixa tampão de pH para selectivamente péptido dimethylate terminais N e 2) utilizando condições de tampão de pH elevado para rotular aminas primárias de resíduos de lisina com reagentes isobáricas comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais / Reagentes). O grau demultiplexagem amostra disponível é dependente do número de etiquetas precursor utilizado e o reagente de marcação isobárica. Aqui, apresentam-se uma análise de 12-Plex utilizando luz e dimetilação pesada combinada com reagentes isobáricas seis-plex para analisar 12 amostras de tecidos de rato em uma única análise. multiplexagem aumentada é útil para reduzir o tempo e custo experimental e mais importante ainda, permitindo a comparação entre muitas condições de amostra (réplicas biológicas, estágio da doença, tratamentos medicamentosos, genótipos, ou pontos de tempo longitudinais) com polarização menos experimental e erro. Neste trabalho, a abordagem cPILOT global é utilizado para analisar o cérebro, coração e tecidos do fígado em todo repetições biológicas dos controles modelo do rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. CPILOT global pode ser aplicada ao estudo de outros processos biológicos e adaptada para aumentar a multiplexagem amostra para maior do que 20 amostras.

Introduction

Proteomics muitas vezes envolve a análise de muitas amostras utilizadas para melhor compreender os processos de doença, de cinética enzimática, modificações pós-traducionais, resposta a estímulos ambientais, de resposta a tratamentos terapêuticos, a descoberta de biomarcadores, ou mecanismos de drogas. Os métodos quantitativos podem ser utilizados para medir as diferenças relativas nos níveis de proteína através das amostras e pode ser livre de marcador ou envolver a marcação isotópica (metabólica, químicos, ou enzimáticos). Os métodos de marcação de isótopos estáveis ​​têm crescido em popularidade, porque eles permitem muitas amostras a ser analisadas simultaneament....

Protocol

Ética declaração: Ratos foram comprados a partir de um sem fins lucrativos, instituição independente, a investigação biomédica e alojados na Divisão de Recursos Animais de Laboratório da Universidade de Pittsburgh. Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Pittsburgh.

1. Extração de Proteínas e produção de péptidos para a etiquetagem Chemical

1. Extracto de proteína a partir de tecido, células, ou fluidos corporais.
   1. Homogeneizar 60-90 mg de tecido (por exemplo, cérebro, coração, fígado e) em solução salina de tampão fosfato (PBS ....

Results

cPILOT utiliza química à base de amina de péptidos quimicamente etiqueta na extremidade N-terminal e resuos de lisina e melhora as capacidades de multiplexação de amostra. A Figura 2 mostra os dados de MS representante que é obtido a partir de uma análise cPILOT 12-Plex de cérebro, coração, fígado e tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. Como mostrado na Tabela 1, duas réplicas biológicas para ratinhos .......

Discussion

cPILOT permite a medição simultânea de mais do que 12 amostras originais. A fim de assegurar a etiquetagem bem sucedido em ambos os resíduos do N-terminal e lisina de péptidos, é imperativo ter o pH correcto para cada conjunto de reacções e para executar a primeira reacção dimetilao para rotulagem péptido. dimetilao selectiva na extremidade N-terminal é realizada por ter um pH em ~ 2,5 (± 0,2). Isto é conseguido através da exploração das diferenças de pKa de um dos grupos amino de lisina e o N-terminus. A pH 2,5, a lisi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Água - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantidade não é necessária
Acetonitrila - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantidade não é necessária
Ácido Acético	J.T. Baker	9508-01
Solução de hidróxido de amônio (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Formato de amônio	Acros Organics	208-753-9
Ácido fórmico	Fluka Analytical	94318-250ML-F
BCA kit de ensaio de proteína Pierce	Thermo Fisher Scientific	23227
Ureia	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Ditiotreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacetamida (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-cisteína	Sigma Aldrich, Química	168149-25G
L-1-tosilamido-2 feniletil cloro-cetona (TPCK) - tratada com tripsina de pâncreas bovino	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
Solução de formaldeído (CH2O); 36,5 - 38% em H2O	Sigma Aldrich, Ciências da Vida	F8775-25ML
Solução de formaldeído (13CD2O); 20% em peso em D2O, 98 átomos % D, 99 átomos % 13C	Sigma Aldrich, Química	596388-1G
Cianoborohidreto de sódio; grau de reagente, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Cianobororodeuterito de sódio; 96% de átomos D, 98% CP	Sigma Aldrich, Química	190020-1G
Troca de Alimentos Fortes (SCX) kit de preparação de amostras	de pontas de spin Protea BioSciences	SP-155-24kit
Tampão de bicarbonato de trietil amônio (TEAB)	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Kit de Marcação Isobárica (TMT 6 plex) - 6 reações (1 x 0,8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Cloridrato de hidroxilamina	Sigma Aldrich, Química	255580-100G
Misturador de vórtice padrão	Fisher Scientific	2215365	qualquer misturador pode ser usado
Oasis HLB 1 cc (10 mg) cartuchos de extração	Waters	186000383	Estes são cartuchos C18
Coletor de vácuo Visiprep SPE, DL (revestimento descartável), modelo de 24 portas	Sigma Aldrich	57265	Um modelo de 12 portas também é suficiente
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	qualquer marca de speed vac é suficiente
Câmara de banho de água	Thermo Scientific	2825/2826	Qualquer marca de câmara de banho de água com temperaturas controladas é suficiente.
Homogeneizador Mecânico (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D com amostrador automático Nano LC AS-2	Sciex-Este		modelo não está mais disponível. Qualquer nano LC com um amostrador automático é suficiente.
Espectrômetro de massa LTQ Orbitrap Velos	Thermo	Scientific-Este	modelo não está mais disponível. Outros instrumentos de alta resolução (por exemplo Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion ou Orbitrap Fusion Lumos) podem ser usados.
Software de proteína (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Balança analítica	Mettler Toledo	AL54
Placa de agitação	VWR	12365-382	Qualquer marca de placas de agitação é suficiente
Medidor de pH (compatível com Tris)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Qualquer marca de medidor de pH é suficiente Buffer de
pH 10	Fisher Scientific	06-664-261	Qualquer marca de buffer de pH 10 é suficiente
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Qualquer marca de tampão de pH 7 é suficiente
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Qualquer marca de tubos eppendorf de 1.5 mL são suficientes
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	Qualquer marca de tubos eppendorf de 0.6 mL são suficientes
0.65 µ m Unidades de filtro centrífugo MC DV MD	Millipore	UFC30DV00
2 mL, 72 unidades	Thermo Scientific	69720
C18 material de embalagem (5  µ m, 100 &)	Bruker	PM5/61100/000	Este item não está mais disponível na Bruker. Material de embalagem alternativo com especificações listadas será suficiente
C18 material de embalagem (5  µ m, 200 &)	Bruker	PM5/61200/000	Este item não está mais disponível na Bruker. Material de embalagem alternativo com especificações listadas será suficiente