Artigo de método
Aqui, mostramos como analisar roteamento dendrítica de neurônios da medula Drosophila em colunas e camadas. O fluxo de trabalho inclui uma técnica de imagem dual-vista a melhorar a qualidade de imagem e ferramentas computacionais para a detecção, registrar mandris dendríticas para a matriz coluna de referência e para analisar as estruturas dendríticas no espaço 3D.
Em muitas regiões do sistema nervoso central, tais como os lóbulos óptica da mosca e do córtex vertebrado, circuitos sinápticos são organizados em camadas e colunas para facilitar a conexão cerebral durante o desenvolvimento e processamento da informação nos animais desenvolvidos. neurônios pós-sinápticos dendritos elaborados nos padrões específicos do tipo em camadas específicas para sinapse com terminais pré-sinápticos apropriados. O neurópilo mosca medula é composta de 10 camadas e cerca de 750 colunas; cada coluna é enervado pelo dendritos de mais de 38 tipos de neurônios da medula, que combinam com os terminais axonal de cerca de 7 tipos de aferentes de uma forma específica do tipo. Este relatório detalha os procedimentos para a imagem e analisar dendrites dos neurónios da medula. O fluxo de trabalho inclui três seções: (i) a secção de imagem dual-view combina duas pilhas de imagens confocal coletadas em orientações ortogonais em um de alta resolução de imagem 3D de dendrites; (Ii) a dendrite rastreamento e secção de registo traça dendríticamandris em 3D e registra traços dendríticas para a matriz coluna de referência; (Iii) a secção de análise dendrítica analisa padrões dendríticas em relação às colunas e camadas, incluindo terminação e de projecção planar direcção específica da camada de mandris dendríticas, e obtém estimativas de ramificação e de terminação frequências dendríticas. Os protocolos utilizam plugins personalizados construídos na MIPAV open-source (Medical Imaging processamento, análise e visualização) da plataforma e personalizadas caixas de ferramentas na linguagem laboratório matriz. Juntos, estes protocolos de fornecer um fluxo de trabalho completo para analisar o encaminhamento dendríticas de medula neurónios de Drosophila em camadas e colunas, para identificar os tipos de células, e para determinar defeitos de mutantes.
Durante o desenvolvimento, os neurônios dendritos elaborados em complexos mas estereotipados padrões ramificados para formar sinapses com os seus parceiros pré-sinápticos. padrões de ramificação dendríticas correlacionar com a identidade e as funções neuronais. Os locais de mandris dendríticas determinar o tipo de entradas pré-sinápticos que recebem, enquanto o dendríticas ramificação tamanhos de complexidade e de campo governar o número de entrada. Assim, as propriedades morfológicas dendríticas constituem factores determinantes para a conectividade sináptica e computação neuronal. Em muitas regiões do cérebro complexas, tais como os lóbulos óptica da mosca e a retina dos vertebrados, circuitos sinápticos são organizadas em colunas e camadas para facilitar o processamento de informação 1, 2. Em tal organização coluna e camada, os neurónios pré-sinápticos de distintos axónios projecto modalidade para terminar numa camada específica (os chamados direccionamento específico de camada) e para formar uma matriz bi-dimensional ordenada (de modo-Called mapa topográfico), enquanto os neurônios pós-sinápticos estender dendritos de tamanhos adequados em camadas específicas para receber entradas pré-sinápticas dos tipos e números corretos. Enquanto axonal direcionamento para as camadas e colunas tem sido bem estudada 3, 4, muito menos se sabe sobre como dendritos são encaminhadas para camadas específicas e expandir adequadamente dimensionada campos receptivos para formar conexões sinápticas com os parceiros pré-sinápticos corretos 5. A dificuldade de imagem e quantificar dendrítica direcionamento para as camadas e colunas tem dificultado o estudo do desenvolvimento dendrítica em estruturas cerebrais colunar e laminados.
Drosophila neurônios da medula é um modelo ideal para o estudo de roteamento dendrítica e montagem de circuito em colunas e camadas. O neurópilo mosca medula é organizado como uma estrutura 3D de 10 camadas e aproximadamente 750 colunas. Cada coluna é inervado por um conjunto de fibras aferentes, incluindo photoreceptors R7 / R8 e neurônios da lâmina L1 - L5, cujos terminais axonal formar mapas topográficos de uma forma específica de camada 6. Cerca de 38 tipos de neurônios da medula estão presentes em cada coluna de medula e dendrites elaboradas em camadas específicas e com tamanhos de campo adequados para receber as entradas a partir destes aferentes 7. Os circuitos sinápticos na medula foram reconstruídos no nível do microscópio electrónico; Assim, as parcerias sinápticas estão bem estabelecidos 7, 8. Além disso, as ferramentas genéticas para a marcação de vários tipos de neurónios de medula são disponíveis 9, 10, 11. Ao examinar três tipos de transmedulla (TM) neurônios (Tm2, Tm9 e TM20), já anteriormente identificados dois atributos específicos de células do tipo-dendríticas: (i) neurônios Tm projetam dendrites quer na direcção anterior ou posterior (proj planardirecção exão), dependendo dos tipos de células e (ii) dendrites dos neurónios de medula terminam em camadas específicas da medula de uma forma específica de célula do tipo-(terminação específica de camada) 12. Planar direção de projeção e terminação específica camadas são suficientes para diferenciar estes três tipos de neurônios Tm, enquanto que mutações que perturbam respostas TM para camada e coluna pistas prejudica aspectos distintos desses atributos.
Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho completo para examinar o padrão dendrítica de neurônios da medula Drosophila em colunas e camadas (Figura 1). Em primeiro lugar, vamos mostrar um método de imagem dual-view, que usa software personalizado para combinar dois imagem confocal pilhas para gerar imagens isotrópicas de alta qualidade. Este método necessita apenas de microscopia confocal convencional para gerar imagens de alta qualidade que permitem o rastreio de confiança de ramos dendríticos, sem recorrer à microscopia de super-resolução, tals STED (Emissão Estimulada de Esgotamento) ou iluminação estrutural. Em segundo lugar, apresentamos um método para rastrear mandris dendríticas e para registrar os traços neurite resultantes para uma matriz coluna de referência. Em terceiro lugar, podemos mostrar os métodos computacionais para a extracção de informação sobre a direcção de projecção planar e terminação específica de camada de dendritos, bem como para derivar estimativas para a ramificação e de terminação frequências dendríticas. Juntos, estes métodos permitem a caracterização dos padrões dendríticas em 3D, a classificação de tipos de células com base em morfologias dendríticas, e a identificação de possíveis defeitos em mutantes.
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Nota: O protocolo contém três seções: dual-view de imagem (seções 1 - 3), o rastreamento dendrítica e registo (seções 4 - 6), e análise dendrítica (secções 7 - 9) (Figura 1). Os códigos e arquivos de exemplo são fornecidos na Tabela de materiais / equipamentos.
1. Dual-imagem Acquisition
NOTA: Este passo destina-se a aquisição de duas pilhas de imagens do neurónio de interesse em duas orientações ortogonal (horizontal e frontal).
Deconvolution 2. Imagem
NOTA: A etapa de deconvolução usa software imagem deconvolução para restaurar as imagens adquiridas que são degradados por confusãoe ruído. Embora este passo é opcional, que melhora significativamente a qualidade da imagem. Recomenda-se usar pilhas de imagens deconvolved para registro e combinação de imagem na seção 3.
3.-view combinação dupla Imagem
Nota: Esta etapa combina imagem Duas pilhas para gerar imagens de alta resolução em 3D usando o software MIPAV.
Atribuição 4. Neurite rastreamento e Ponto de referência
NOTA: Este passo é traçar neurites (4.1) e para atribuir pontos de referência para o registo (4.2) usando o software de visualização de imagem.
5. de corpo rígido e Registro TPS Nonlinear
NOTA: Este passo é registrar os traços neurite (em formato iv) para a matriz coluna de referência e gerar um arquivo SWC registrada usando o programa MIPAV. Esta seção requer os seguintes arquivos: a pilha de recombinado (.IDS) do passo 3.3, o arquivo de ponto de referência (.csv) do passo 4.2 e o arquivo de rastreamento filamento neurite (.iv) a partir do passo 4.1.
6. Padronização de configuração direito do ventral
NOTA: Este passo é converter os traços neurite (em formato SWC) para configuração de RV padrão (direita-ventral) usando o script personalizado "RV_standardization.m." Aqui, o roteiro foi escrito na linguagem de laboratório matriz. onomes dos arquivos SWC de entrada deve estar no seguinte formato: "NeuronName _ _ Número .swc Configuração" (por exemplo, Tm20_3_LV.swc).
7. Calcular dendríticas ramificação e que encerra Frequencies
NOTA: Este passo utiliza de corpo rígido registrado arquivos SWC para calcular os estimadores de Kaplan-Meier para a probabilidade de que um segmento dendríticas vai chegar a um determinado comprimento sem terminar. Este script usa duas funções Dendritic_Tree_Toolbox: extractDendriticSegmentLengthDistribution e estimateDendriticSegmentLengthProbability.
8. traçar a distribuição de Rescisão específico-Layer da dendríticas mandris
NOTA: Este passo representa graficamente a distribuição de terminais dendríticas em diferentes camadas da medula como um gráfico de barras. Isto pode ser aplicado a um neurónio, um grupo de neurónios, ou grupos de neurónios. O script usa a função extractDistributionAlongAxis de Dendritic_Tree_Toolbox.
9. Plot projeção Direcção Planar dos dendritos
NOTA: Este passo traça os rumos projeção plana de dendrites como um lote polar. O script usa a função extractAngularDistribution de Dendritic_Tree_Toolbox.
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Usando o procedimento de imagem dupla vista aqui apresentado, uma mosca contendo neurónios do cérebro TM20 escassamente marcado foi fotografada em duas direcções ortogonais. Antes da imagem, o cérebro foi corado com anticorpos primários e secundários apropriados para visualizar GFP e fotorreceptoras axônios membrana-tethered. Para imagiologia, o cérebro foi montado pela primeira vez na orientação horizontal (Figura 2A, B). Um neurónio TM20 marcado com GFP e os axónios fo...
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Aqui, vamos mostrar como imagem e analisar mandris dendríticas dos neurônios da medula Drosophila. A primeira seção, dual-view de imagem, descreve a deconvolução e combinação de duas pilhas de imagens em uma pilha de imagens de alta resolução. A segunda seção, o rastreamento dendrite e registro, descreve a detecção e registo das dendrites dos neurónios da medula para a matriz coluna de referência. A terceira seção, a análise dendrítica, descreve o uso de scripts personalizados para analisar os padrões dendrític...
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Os autores não têm nada a revelar.
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, o Instituto Eunice Kennedy Shriver Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (HD008913 subvenção para C.-HL) e do Centro de Tecnologia da Informação (PGM, NP, ESM e MM).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | versão 16.05 | para deconvolução de imagem (https://svi.nl). software comercial |
| MIPAV | versão 7.3.0 | para recombinação e registro de imagem (http://mipav.cit.nih.gov/); | |
| plug-in MIPAV freeware: PlugInDrosophila Plugin | MIPAV freeware | ||
| : PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class | freeware | ||
| Imaris | Bitplane | para rastrear neurites e atribuir pontos de referência para registro de imagens (http://www.bitplane.com); software comercial | |
| Vaa3D | para visualização de arquivos swc ( https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | para análise morfométrica de dendritos (http://www.mathworks.com); software comercial |
| Caixa de ferramentas Matlab: TREES1.14 | v1.14 | para análise de parâmetros morfométricos dendríticos (http://www.treestoolbox.org/download.html); caixa de ferramentas Matlab freeware | |
| : Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | Para o cálculo dos parâmetros morfométricos (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comments |
| Sample files | |||
| SWC definição | de arquivo http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| Os códigos e arquivos de amostra para combinação e registro | de imagens https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Exemplo de ponto de referência | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2 | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Sistema de computador | |||
| MS Windows Windows 7 x64 ou Macintosh OS X 10.7 ou posterior | Processador quad-core de 3GHz 64 bits, 16G RAM (mínimo) | ||
| Opcional: Quadro4000 (ou acima) placa gráfica | Nvidia | para visualização estereográfica de dendritos. | |
| Opcional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Opcional: Tela LCD de 120 Hz para NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Reagentes para imagem | |||
| 24B10 anticorpo | Os Estudos de Desenvolvimento Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Anticorpo | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Montagem Média | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Montagem Argila | Fisher | S04179 | |
| 70% glicerol em 1x PBS | |||
| Capa de vidros, alto desempenho, D = 0.17 milímetro | Zeiss | 474030-9000-000 |
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