Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo optimizado para a produção de batatas fritas de microfluidos e a configuração de experiências de microfluidos para medir o tempo de vida e fenótipos celulares de células de levedura individuais.

Resumo

A levedura Saccharomyces cerevisiae é um importante organismo modelo na pesquisa do envelhecimento. Estudos genéticos revelaram muitos genes com efeitos conservados na expectativa de vida entre as espécies. No entanto, as causas moleculares do envelhecimento e da morte permanecem indefinidas. Para obter uma compreensão sistemática dos mecanismos moleculares subjacentes ao envelhecimento da levedura, precisamos de métodos de alto rendimento para medir a vida útil e quantificar vários fenótipos celulares e moleculares em células individuais. Anteriormente, desenvolvemos dispositivos microfluídicos para rastrear células-mãe de levedura em brotamento ao longo de sua vida útil, enquanto eliminamos as células-filhas recém-nascidas. Este artigo apresenta um método para preparar chips microfluídicos e para estabelecer experimentos microfluídicos. Vários canais podem ser usados para rastrear simultaneamente células sob diferentes condições ou de diferentes cepas de levedura. Uma configuração típica pode rastrear centenas de células por canal e permitir imagens microscópicas de alta resolução durante toda a vida útil das células. Nosso método também permite a caracterização detalhada da vida útil, marcadores moleculares, morfologia celular e dinâmica do ciclo celular de células individuais. Além disso, nosso dispositivo microfluídico é capaz de capturar uma quantidade significativa de células-mãe frescas que podem ser identificadas pela análise de imagem a jusante, tornando possível medir a vida útil com maior precisão.

Introdução

Brotamento levedura é um poderoso organismo modelo na pesquisa de envelhecimento. No entanto, num ensaio de tempo de vida convencional em leveduras depende de microdissecação, que não só é de trabalho intensivo, mas também baixa taxa de transferência ^{1, 2.} Além disso, a abordagem tradicional microdissecação não fornece uma vista detalhada de várias características celulares e moleculares nas células-mãe individuais à medida que envelhecem. O desenvolvimento de dispositivos de microfluidos tem possibilitado um procedimento automatizado para medir o tempo de vida de levedura, bem como para seguir marcadores moleculares e vários fenótipos celulares ao longo do tempo de vida das células-mãe de ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Após as células de levedura são carregados para um dispositivo de microfluidos, que pode ser rastreado sob um microscópio usando tempos voltas automáticase de imagem. Com a ajuda de ferramentas de processamento de imagem latente, vários fenótipos celulares e moleculares podem ser extraídos ^{3, 6, 8,} incluindo o tempo de vida, tamanho, repórter fluorescente, a morfologia celular, a dinâmica do ciclo celular, etc, muitos dos quais são difíceis ou impossíveis de obter usando o método tradicional microdissecação. Dispositivos microfluídicos ganharam destaque na pesquisa do envelhecimento levedura desde o seu desenvolvimento bem sucedido de alguns anos atrás ^{3, 4, 6, 7.} Vários grupos posteriormente publicado em variações dos projetos anteriores ^5, e muitos laboratórios levedura empregaram dispositivos microfluídicos para o seu estudo.

Em uma cultura de células em crescimento exponencial, o número de células mãe com idades que estão disponíveis para a observação é miniscule. Portanto, o princípio de design geral do dispositivo microfluídico para medições de tempo de vida é para reter células-mãe e remover células filhas. Um desses desenhos faz uso do fato de que o fermento sofre divisão celular assimétrica. As estruturas em células-mãe a armadilha dispositivo vontade maiores e permitem que as células filhas mais pequenas a serem lavados. O chip de microfluidos descrito neste artigo utiliza uma almofada macia polidimetilsiloxano (PDMS) (colunas verticais Pensile) para células-mãe armadilha (Figura 1). Dispositivos de desenho semelhante têm sido relatados anteriormente ^{3, 4, 6, 7.} Este protocolo utiliza um processo mais simples para fabricar dispositivos microfluidicos e um método de célula de carga simples que é optimizado para as experiências de imagiologia de intervalo de tempo. Um dos parâmetros chave no dispositivo de microfluidos é a largura das pastilhas de PDMS usados ​​para células mãe armadilha. nossa dispositivo usa almofadas mais amplas que podem manter mais células-mãe em cada bloco, incluindo uma fração significativa de células-mãe frescas que podem ser rastreados ao longo da sua vida útil. Para além das medições vida útil, este protocolo é útil para experiências de imagiologia única célula de intervalo de tempo quando as células necessitam de ser rastreados por muitas gerações ou quando uma observação ao longo de todo o tempo de vida é necessário.

Protocolo

1. Silicon Wafer fabricação de moldes

NOTA: O photomask é projetado com software AutoCAD e fabricado por uma empresa comercial. Este projeto contém três camadas de padrões diferentes ( Documento Suplementar 1 ). As alturas das primeira, segunda, e terceira camadas são cerca de 4 mm, 10? M e 50? M, respectivamente. O molde da bolacha de silício foi criado a partir da fotomáscara utilizando litografia macia ^{9, 10.}

1. Asse uma bolacha de silício a 200 ° C durante 10 minutos para evaporar o vapor de água. revestimento rotação fotorresistente negativo SU-8 sobre a bolacha de silício.
   NOTA: revestimento rotação SU-8 3005 a 5000 rpm durante 30 segundos para gerar a primeira camada, SU-8, 2010 a 3000 rpm durante 30 segundos para gerar a segunda camada, e SU-8 3025 a 2000 rpm durante 30 segundos para gerar o terceira camada.
2. Soft-cozer a bolacha revestido antes de tele transferência padrão. Alinhar e expor a hóstia no modo "contato direto" usando um alinhador de máscara.
   NOTA: Soft-coza a bolacha durante 2 min a 95 ° C para a primeira camada, 3 min a 95 ° C para a segunda camada, e 15 min a 95 ° C para a terceira camada. Utilizar a dose de exposição a 100 mJ / cm ² para a primeira camada, de 130 mJ / cm ² para a segunda camada, e de 200 mJ / cm ² para a terceira camada.
3. Após a exposição, pós-assar o wafer e desenvolvê-lo usando SU-8 desenvolvedor. Seca-se a pastilha utilizando uma pistola de N ₂ e difícil de cozedura da bolacha a 200 ° C durante 30 min.
   NOTA: O molde de bolacha de silício é fixo para cerca de 15 cm de diâmetro de plástico de Petri usando fita Scotch, com o lado do padrão virado para cima. Normalmente, colocamos várias estruturas de chips idênticos no mesmo molde, que permite que vários chips microfluídicos a ser fabricado, ao mesmo tempo. Cada molde pode ser reutilizado muitas vezes para fabricar chips de microfluidos.

2. Microfluidicfabricação de chips

1. Coloque um barco com peso limpo em uma balança e tarar a balança. Pour 50 g de base de PDMS no barco pesar.
2. Adicionar 5 g de PDMS agente de cura para o barco de pesagem (w / w proporção de 1:10 para a base de PDMS).
   NOTA: Este volume é baseada em um diâmetro de 15 cm-placa de Petri com o molde. Ajustar a quantidade de reagente de se utilizar uma placa de Petri com um tamanho diferente.
3. Agita-se a base de PDMS e o agente de cura com uma pipeta descartável. Iniciar a partir da borda do barco de pesagem e mova lentamente para dentro. Agita-se vigorosamente durante vários minutos até formar pequenas bolhas por toda a mistura; mistura completa é essencial para PDMS polimerização.
4. Verter a mistura lentamente para a placa de Petri; a mistura deve cobrir completamente o molde de bolacha de silício.
5. Colocar a placa de Petri no vácuo durante 10 minutos para remover todas as bolhas de ar a partir da mistura de PDMS. Se as bolhas permanecem sobre a superfície da mistura, utilizar uma pipeta para fundi-los fora.
6. Incubar o silíciomolde bolacha com PDMS em uma estufa a 75 ° C durante cerca de 2 h.
7. Com cuidado, descascar a camada de PDMS polimerizados para fora do molde bolacha de silício, evitando qualquer dano para a construção do molde da bolacha. Alternativamente, cortar o PDMS directamente a partir do molde da bolacha de silício com uma margem mínima de 5 mm em torno do padrão utilizando uma lâmina de barbear industrial de ponta simples; suavemente descascar a camada de PDMS fora do molde bolacha.
8. Coloque a camada de PDMS no banco com o padrão lado virado para cima. Cuidadosamente cortar o chip indivíduo com uma lâmina de barbear industrial de ponta única, mantendo uma margem adequada a partir da borda de cada um único chip para evitar danos de construção.
9. Com o padrão lado virado para cima, utilizar uma caneta punção (ID de 0,75 mm) para fazer furos na vertical através das entrada e saída de círculos em cada lado dos canais.
   NOTA: Estes furos criar o caminho para o fluxo de meio. Portanto, é crucial para percorrer os círculos e socos todo o caminho através da camada de PDMS. Tenha certeza deremover as colunas de PDMS do furo.
10. Verificar todos os buracos perfurados através da inserção da agulha da caneta de novo perfurador para dentro do buraco. Certifique-se de que a agulha pode sair do outro lado, indicando que não há nenhum bloqueio. Aplique a fita para a superfície do padrão, em seguida, descasque delicadamente a fita para limpar as partículas de poeira. Repetir esta etapa, pelo menos, três vezes. Deixar um pedaço limpo de fita adesiva sobre os PDMS para manter a esterilização.
11. Repita este procedimento no lado oposto do PDMS e deixar o último pedaço de fita no bem.
12. Preparar um x 30 mm de vidro de cobertura 24 mm com uma espessura de 0.13-0.17 mm. Spray de etanol a 70% sobre o vidro e seco com removedor de poeira para esterilizar a superfície; Além disso, o vidro pode ser lavada com água esterilizada e secou-se com removedor de poeira.
13. Transferir o vidro de cobertura e PDMS a uma placa de plástico. Retire a fita adesiva do PDMS e coloque lado o padrão voltado para cima. Evite qualquer contato com a superfície do padrão durante a transferência.
14. Colocar a placa de plástico na máquina de plasma. Aplicar o tratamento com plasma de oxigio para o PDMS e a tampa de vidro para tornar as superfícies hidrofílicas com os seguintes parâmetros operacionais: a exposição, 75 s; estabilização do gás, 20 cc / min; pressão, 200; e poder, 100 W.
15. Cuidadosamente colocar o PDMS para o vidro de cobertura, que liga ambas as superfícies hidrofílicas (as superfícies que enfrentam-se durante o tratamento por plasma). Certifique-se de que não existem bolhas de ar entre o PDMS e a tampa de vidro.
16. Incubar o chip PDMS em uma estufa a 75 ° C durante pelo menos 2 h.
    NOTA: microfluidos deficiente pode provocar fugas de líquido sobre o microscópio durante a experiência. Portanto, é importante para verificar a ligação entre o PDMS e a tampa de vidro, levantando ligeiramente o PDMS a partir das bordas com uma pinça. Suavemente levantar o PDMS não devem separar-lo a partir da tampa de vidro, indicando uma ligação bem sucedida.

3. Preparação para o Experimento

1. preparação Tube.
   1. Submergir os tubos de entrada e de saída em solução de etanol a 70% separadamente um dia antes da preparação chip de PDMS.
   2. Encher uma seringa de 5 ml com água esterilizada para lavar os tubos. Lava-se cada tubo através da ligação do tubo da seringa e a lavagem do tubo com água.
   3. Repetir o passo de lavagem, pelo menos, 3 vezes para limpar resíduo etanol.
2. Examine os canais PDMS sob um microscópio óptico com uma objetiva de 10X para garantir que a estrutura é consistente e intacta. Estabilizar o chip PDMS para a plataforma microscópio usando fita adesiva.
   NOTA: Faça múltiplos chips ao mesmo tempo no passo 2 para garantir que não são chips de backup, especialmente se tornando o dispositivo pela primeira vez.
3. Encher uma seringa de 5 mL com água autoclavada. Fixar a seringa para uma bomba de seringa e inserir os tubos de entrada e de saída correspondentes. Definir a velocidade de lavagem de 750 mL / h para enxaguar o chip durante cerca de 10 min. As bolhas de ar nos canais de filialdeve ser lavado durante este período; Se existem bolhas restantes, ajustar manualmente a velocidade para eliminar as bolhas.
4. preparação de amostras de levedura.
   1. Transferir 1 ml de amostra de levedura preparada _(DO600 0,6-0,8) em dois tubos de microcentrifugação de 1,5 mL e centrifuga-se durante 5 min a 3000 x g.
   2. Remover a maior parte do sobrenadante de cada tubo e combinar o restante para formar uma amostra de 0,5 ml.
5. Pause a bomba de seringa e remover os tubos de entrada a partir do chip PDMS.
6. reverter manualmente a bomba de seringa para aspirar uma pequena bolha de ar (1 a 2 cm de comprimento) em cada tubo de entrada. Passar para sugar a amostra de levedura; a bolha de ar irá mostrar o limite de amostra e indicar a quantidade de amostra foi tirada.
   NOTA: Evite sugar a amostra para dentro da seringa.
7. Inserir o tubo de entrada de volta para o chip de PDMS e reiniciar a bomba para carregar as células a uma velocidade de 750 mL / h.
8. Deixar a bomba de seringa em 10 minutos para an e examinar a progressão de células de carga sob o microscópio; uma carga bem sucedida, as células armadilha sob mais do que 60% de suspender pilar.
9. Mudar para a solução de nutrição e ajustar a velocidade de 400 mL / h para o cultivo de culas.
10. posições de observação selecionar para o microscópio.
    NOTA: Para medições de tempo de vida, uma vez que as imagens foram tiradas a cada 15 minutos por um microscópio óptico com uma objectiva 40x. Para a análise repórter fluorescente, imagens foram tiradas a cada 15 min por um microscópio de fluorescência com um objetivo óleo de 60X.

Resultados

Após as experiências, os tempos de vida das células e muitas fenótipos celulares e moleculares podem ser extraídos a partir das imagens de lapso de tempo gravado. Uma vez que há um certo número de características diferentes que podem ser extraídos a partir de cada uma das células, o primeiro passo da análise é de anotar as células e eventos, incluindo as posições e os limites das células e do calendário de vários acontecimentos que estão a ser rastreado, tal como os eventos de brotamento...

Discussão

O dispositivo PDMS precisa ser feitos na hora. De outro modo, as bolhas de ar causadas pela inserção de tubos para o dispositivo irá ser difícil de remover. Etapa 3.4 é importante para melhorar a eficiência de carregamento de células por concentração das células. Para aumentar o rendimento da experiência, de 4 a 6 módulos no mesmo chip PDMS ligado a bombas que operam independentemente são normalmente utilizados para efectuar 4 a 6 experiências diferentes (diferentes estirpes ou composições de meio) simultaneamente.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3 '' < 111> wafer de silício	Addison Engineering
SU-8 2000 e 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Kit de Elastômero de Silicone	ellsworth	2065622	Inclui base de elastômero de silicone Sylgard® e agente de cura
Placas de Petri	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® vidro de cobertura	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Fita Adesiva	ULINE	S-10223
VWR® Lâminas de Barbear	VWR	55411-050
Etanol Puro, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
Seringa BD de 5 mL (Luer-Lock™ Dica)	Becton, Dickinson and Company	309646
Tubulação de Parede Padrão PTFE (100 pés, Tamanho AWG: 22, ID Nominal: 0.028)	Variedade	SWTT-22
	Dessecador de Laboratório NEKIT-1		Component Supply Company
	HACH	2238300
Fisher	Scientific	13246516GAQ
Microscópio Nikon TE2000 com objetiva de 40X e 60X	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 com objetiva de 40X e 60X	Zeiss
Bomba de seringa	Longerpump	TS-1B