Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo optimizado para a produção de batatas fritas de microfluidos e a configuração de experiências de microfluidos para medir o tempo de vida e fenótipos celulares de células de levedura individuais.

Resumo

A levedura Saccharomyces cerevisiae é um importante organismo modelo na pesquisa do envelhecimento. Estudos genéticos revelaram muitos genes com efeitos conservados na expectativa de vida entre as espécies. No entanto, as causas moleculares do envelhecimento e da morte permanecem indefinidas. Para obter uma compreensão sistemática dos mecanismos moleculares subjacentes ao envelhecimento da levedura, precisamos de métodos de alto rendimento para medir a vida útil e quantificar vários fenótipos celulares e moleculares em células individuais. Anteriormente, desenvolvemos dispositivos microfluídicos para rastrear células-mãe de levedura em brotamento ao longo de sua vida útil, enquanto eliminamos as células-filhas recém-nascidas. Este artigo apresenta um método para preparar chips microfluídicos e para estabelecer experimentos microfluídicos. Vários canais podem ser usados para rastrear simultaneamente células sob diferentes condições ou de diferentes cepas de levedura. Uma configuração típica pode rastrear centenas de células por canal e permitir imagens microscópicas de alta resolução durante toda a vida útil das células. Nosso método também permite a caracterização detalhada da vida útil, marcadores moleculares, morfologia celular e dinâmica do ciclo celular de células individuais. Além disso, nosso dispositivo microfluídico é capaz de capturar uma quantidade significativa de células-mãe frescas que podem ser identificadas pela análise de imagem a jusante, tornando possível medir a vida útil com maior precisão.

Introdução

Brotamento levedura é um poderoso organismo modelo na pesquisa de envelhecimento. No entanto, num ensaio de tempo de vida convencional em leveduras depende de microdissecação, que não só é de trabalho intensivo, mas também baixa taxa de transferência ^{1, 2.} Além disso, a abordagem tradicional microdissecação não fornece uma vista detalhada de várias características celulares e moleculares nas células-mãe individuais à medida que envelhecem. O desenvolvimento de dispositivos de microfluidos tem possibilitado um procedimento automatizado para medir o tempo de vida de levedura, bem como para seguir marcadores mol....

Protocolo

1. Silicon Wafer fabricação de moldes

NOTA: O photomask é projetado com software AutoCAD e fabricado por uma empresa comercial. Este projeto contém três camadas de padrões diferentes ( Documento Suplementar 1 ). As alturas das primeira, segunda, e terceira camadas são cerca de 4 mm, 10? M e 50? M, respectivamente. O molde da bolacha de silício foi criado a partir da fotomáscara utilizando litografia macia ^{9, 10.}

1. Asse uma bolacha de silício a 200 ° C durante 10 minutos para evaporar o vapor de ....

Resultados

Após as experiências, os tempos de vida das células e muitas fenótipos celulares e moleculares podem ser extraídos a partir das imagens de lapso de tempo gravado. Uma vez que há um certo número de características diferentes que podem ser extraídos a partir de cada uma das células, o primeiro passo da análise é de anotar as células e eventos, incluindo as posições e os limites das células e do calendário de vários acontecimentos que estão a ser rastreado, tal como os eventos de brotamento.......

Discussão

O dispositivo PDMS precisa ser feitos na hora. De outro modo, as bolhas de ar causadas pela inserção de tubos para o dispositivo irá ser difícil de remover. Etapa 3.4 é importante para melhorar a eficiência de carregamento de células por concentração das células. Para aumentar o rendimento da experiência, de 4 a 6 módulos no mesmo chip PDMS ligado a bombas que operam independentemente são normalmente utilizados para efectuar 4 a 6 experiências diferentes (diferentes estirpes ou composições de meio) simultaneamente.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3 '' < 111> wafer de silício	Addison Engineering
SU-8 2000 e 3000 Series	MicroChem
Sylgard® 184 Kit de Elastômero de Silicone	ellsworth	2065622	Inclui base de elastômero de silicone Sylgard® e agente de cura
Placas de Petri	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® vidro de cobertura	Thermo Fisher Scientific	102440
3M Fita Adesiva	ULINE	S-10223
VWR® Lâminas de Barbear	VWR	55411-050
Etanol Puro, Koptec	VWR	64-17-5
Whoosh-Duster™	VWR	16650-027
Seringa BD de 5 mL (Luer-Lock™ Dica)	Becton, Dickinson and Company	309646
Tubulação de Parede Padrão PTFE (100 pés, Tamanho AWG: 22, ID Nominal: 0.028)	Variedade	SWTT-22
	Dessecador de Laboratório NEKIT-1		Component Supply Company
	HACH	2238300
Fisher	Scientific	13246516GAQ
Microscópio Nikon TE2000 com objetiva de 40X e 60X	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 com objetiva de 40X e 60X	Zeiss
Bomba de seringa	Longerpump	TS-1B