Artigo de método

Utilizando biossensores baseados em Enzyme medir Tonic e Phasic glutamato na doença de Alzheimer rato Models

DOI:

10.3791/55418

⸱

3 de maio de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos a configuração, navegação software e análise de dados para um método espacial e temporalmente precisa de medir a tônica e fásica mudanças glutamato extracelulares in vivo utilizando matrizes de microeletrodos ligado a enzima (MEA).

Resumo

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interrupção neurotransmissor é muitas vezes um componente-chave de doenças do sistema nervoso central (CNS), desempenhando um papel na patologia subjacente a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, depressão e ansiedade. Tradicionalmente, microdiálise foi o mais comum (louvado) técnica para examinar as alterações de neurotransmissores que ocorrem nestes distúrbios. Mas porque microdiálise tem a capacidade de medir as alterações lentas 1-20 minutos através de grandes áreas de tecido, ele tem a desvantagem de invasividade, potencialmente destruir as ligações intrínsecas dentro do cérebro e uma capacidade de amostragem lenta. Uma técnica relativamente nova, a matriz de microeléctrodos (MEA), tem numerosas vantagens para a medição de alterações de neurotransmissores específicos dentro de regiões cerebrais discretas à medida que ocorrem, para fazer uma abordagem espacialmente e temporalmente preciso. Além disso, utilizando AAM é minimamente invasivo, permitindo a medição de alterações de neurotransmissores in vivo. Em nosso laboratório, nós have sido especificamente interessados ​​em mudanças no neurotransmissor, glutamato, relacionada com a patologia da doença de Alzheimer. Como tal, o método descrito aqui foi usado para avaliar as perturbações do hipocampo potenciais em glutamato em um modelo de rato transgénico da doença de Alzheimer. Resumidamente, o método utilizado envolve o revestimento de um microeléctrodo de multi-local com uma enzima muito selectiva para o neurotransmissor de interesse e utilizando locais de auto-referenciar para subtrair o ruído de fundo e os interferentes. Depois de plaqueamento e de calibração, o MEA pode ser construído com uma micropipeta e reduzido para a região do cérebro de interesse utilizando um dispositivo estereotáxico. Aqui, o método descrito envolve a anestesiar RTG (TauP301L) 4510 e ratinhos utilizando um dispositivo estereotáxico para alvejar com precisão sub-regiões (DG, CA1, e CA3) do hipocampo.

Introdução

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Medindo alterações de neurotransmissores no cérebro é uma ferramenta essencial para neurocientistas o estudo de doenças do sistema nervoso central (SNC) que são muitas vezes caracterizados por desregulao de neurotransmissores. Embora microdiálise em combinação com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC / CE) tem sido o método mais amplamente utilizado para medir alterações nos níveis de neurotransmissores extracelulares 1, 2, 3, 4, a resolução espacial e temporal de sondas de microdiálise pode não ser ideal para neurotransmissores , tais como o glutamato, que são estreitamente regulada no espaço extracelular 5, 6. Devido aos recentes avanços na genética e na imagem, existem métodos adicionais que podem ser utilizadas para mapear glutamato in vivo. Usando repórteres glutamato fluorescentes geneticamente codificados (iGluSnFR) umd de dois fotões imagiologia, os investigadores são capazes de visualizar a libertação de glutamato por neurónios e astrócitos, tanto in vitro e in vivo, 7, 8, 9. Notavelmente, este permite a gravação de um maior campo de visão e não perturbar as ligações intrínsecas do cérebro. Enquanto estas novas técnicas ópticas permitem a visualização da cinética de glutamato e medição de respostas evocadas sensoriais e actividade neuronal, eles não têm a capacidade para quantificar a quantidade de glutamato no espaço extracelular em regiões cerebrais discretas.

Um método alternativo é a matriz de microeléctrodos ligado a enzima (MEA), que pode medir selectivamente níveis de neurotransmissores extracelulares, tais como o glutamato, através da utilização de um esquema de gravao por auto-referenciados. A técnica MEA tem sido usado para estudar alterações na glutamato extracelular seguintes cerebral traumáticalesão 10, 11, 12, envelhecimento 13, 14, estresse 15, 16, epilepsia 17, 18, doença de Alzheimer 19, 20, e a injecção de um mímico viral 21 e representa um aperfeiçoamento em relação às limitações espaciais e temporais inerentes microdiálise. Considerando microdiálise restringe a capacidade de medir perto da sinapse 22, 23, AAM têm uma alta resolução espacial que permite a medidas selectivas de transbordamento glutamato extracelular perto sinapses 24, 25. Em segundo lugar, a resolução temporal baixa de microdiálise (1-20 min) limita a capacidade para investigar odinâmica rápida de liberação de glutamato e desembaraço que ocorrem no milésimo de segundo para a segunda faixa de 26. Como as diferenças na libertação ou alívio de glutamato pode não ser evidente em medidas de tónico, descansando os níveis de glutamato, pode ser essencial que a libertação de glutamato e depuração ser directamente medido. AAM permitir tais medidas, devido à sua alta resolução temporal (2 Hz) e baixos limites de detecção (<1 um). Em terceiro lugar, AAM permitir a análise de alterações em sub neurotransmissores dentro de uma região particular do cérebro, tais como o hipocampo de rato ou de ratinho. Por exemplo, usando MEAs que pode ter como alvo, separadamente, o giro dentado (DG), cornu Ammonis 3 (CA3) e cornu Ammonis 1 (CA1), do hipocampo, as quais estão ligadas através de um circuito trisynaptic 27, para examinar as diferenças sub em glutamato extracelular. Por causa do tamanho das sondas de microdiálise (1 - 4 mm) de comprimento e o dano causado pela implantação 28 </ sup>, 29, as diferenças sub-regionais são difíceis de abordar. Além disso, os sistemas ópticos de só permitir a estimulação através de estímulos externos, tais como uma estimulação suiça ou cintilação luz, que não permite a estimulação sub-7. Um benefício final de AAM em relação a outros métodos, é a capacidade para estudar estas sub-regiões in vivo, sem perturbar as ligações extrínsecos e intrínsecos.

Aqui, descrevemos a forma como um sistema de gravação (por exemplo, FAST16mkIII) em combinação com AAM, que consiste de um microeléctrodo de vários locais de cerâmica à base, pode ser diferencialmente revestido sobre os locais de gravação para permitir a agentes interferentes a ser detectado e removido o sinal de analito. Nós também demonstrar estas matrizes podem ser utilizadas para estudos baseados em amperometria de glutamato in vivo regulação dentro da DG, CA3, e sub-regiões do hipocampo CA1 de RTG anestesiado (TauP301L) 4510 ratinhos, um m utilizadamodelo ouse da doença de Alzheimer. Além disso, nós fornecemos confirmação da sensibilidade do sistema de MEA com a dinâmica rápidas de libertação de glutamato e depuração por tratamento dos ratinhos com o riluzol, uma droga demonstrado in vitro para diminuir a libertação de glutamato e aumentar a captação de glutamato 30, 31, 32, 33, e demonstrando essas respectivas alterações in vivo no modelo do rato TauP301L.

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Protocolo

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1. Revestimento da rede de microeletrodos com enzimas ou camada de matriz

  1. Preparando a solução de matriz proteica
    1. Pesar 10 mg de albumina de soro bovino (BSA) e transferir para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Adicionar 985 mL de água Dl para o tubo de microcentrífuga contendo BSA. Misture a solução por agitação manual do (re-pipetagem usando 1000 mL pipeta ~ 3 vezes, até que a BSA é dissolvido).
      NOTA: Não use vórtice para misturar a solução pois isso pode introduzir ar na solução. Além disso, defina a pipeta para um volume de <1000? L (por exemplo, 700 mL) para evitar a introdução de bolhas de ar. A solução pode ser colocada numa microcentrífuga, se necessário.
    3. Uma vez que a solução de BSA é dissolvido, adicionam-se 5 mL de solução de glutaraldeído a 25%. Misture a solução invertendo o tubo fechado de 3 - 5 vezes. A solução resultante é BSA a 1% com 0,125% de glutaraldeído.
    4. Separe a solu matriz proteicação durante 5 minutos. A solução aparecerá amarelo claro na cor.
  2. Preparar a solução de enzima desejada (por exemplo, glutamato-oxidase)
    1. Preparar a solução de oxidase de glutamato pela adição de água desionizada filtrada para o liofilizado, enzima purificada (por exemplo, 50 mL de água DI adicionado a 25 unidades de oxidase de glutamato, para se obter 0,5 U / microlitro).
      NOTA: solução estoque alíquota (por exemplo, 1 mL) e armazenar as alíquotas em recipientes de tamanho apropriado (por exemplo, tubos de 500 mL de microcentrífuga) a -20 ° C. As alíquotas podem ser armazenadas por até 6 meses sob estas condições.
    2. Adicionar 4 mL da solução de BSA / glutaraldeído para o tubo de microcentrífuga contendo aliquotas glutamato-oxidase. Misture a solução por agitação manual do (re-pipetagem com uma pipeta de 10 uL. A pipeta deve ser definido como o volume <5 mL). A solução resultante é de 1% de BSA, 0,125% de glutaraldeído e 0,1 U / mL de glutamato-oxidase.Usar a solução para revestir imediatamente.
      Nota: solução de revestimento de oxidase de glutamato só pode ser usada dentro de 15 min. Embora vários MEAs podem ser revestidos com uma solução preparada, é recomendado que não exceda a janela de tempo utilizável para a oxidase de glutamato. O número de eléctrodos que pode ser revestido no prazo de 15 min variar. De um modo geral, de 4 a 6 eléctrodos podem ser revestidos de cada vez.
  3. Revestimento da MEA
    1. Tipicamente, o revestimento de um par de local de gravação (s) em um MEA com a enzima pretendida (oxidase de glutamato) e um par diferente de sítio (s) de gravação (local 'sentinela' (s)) é revestido com a proteína de matriz inactivo.
    2. Use de ponta romba Hamilton microseringas (por exemplo, 10 ul) a AAM revestimento com oxidase de L-glutamato ou solução matriz de proteína inactiva (BSA + glutaraldeído). Os procedimentos utilizados para revestimentos de proteína de matriz de enzimas ou inactivos são os mesmos.
    3. Limpe as seringas antes e após o uso (3 lavagens comUa DI, 3 lavagens com metanol, 5 lavagens com água Dl).
      NOTA: Dedicado seringas são usados ​​para a aplicação de revestimentos de enzima (oxidase de glutamato) ou a proteína de matriz. Não utilize a mesma seringa para uma solução diferente. Recomenda-se a realização de revestimentos de proteína de matriz antes de revestimentos de enzimas.
    4. Desenha-se oxidase de glutamato ou matriz de proteína utilizando uma seringa de 10 pL de Hamilton. Suavemente pressionar o êmbolo para dispensar uma pequena gota de solução na ponta de seringa (visualizado usando um microscópio de dissecção).
    5. Utilizando o microscópio de dissecação para atingir os locais de gravação MEA, aplicam-se a solução para os locais de gravação adequadas contactando brevemente os locais de gravação com a solução gota / grânulo, o que representa uma camada. Três camadas são suficientes tanto para a proteína de matriz e o revestimento enzima. camadas espessas podem reduzir a sensibilidade do MEA.
    6. Elevar a gotícula de solução para cima e para fora dos locais de gravações (isto é, o Syringe ponta não deve raspar toda a superfície da MEA).
    7. Definir um temporizador para 1 min. Este é o requisito mínimo de tempo entre aplicações de revestimento para o sítio (s) de gravação. Permitir MEAs revestidas com enzima de curar a 4 ° C durante 5-7 dias.
    8. Grave o número de demãos aplicadas, quanto tempo levou para aplicar os revestimentos, o número eletrodo, e um nome e data em um caderno de laboratório.

2. galvanização com m-fenilenodiamina para uma selectividade melhorada

  1. Preparação de dicloridrato de m-fenilenodiamina solução (MPD)
    NOTA: Placa a camada de exclusão, mPD, para evitar a oxidação da dopamina e outros, moléculas interferentes grandes (por exemplo, ácido ascórbico), melhorando assim a selectividade do sensor em glutamato / H 2 O 2 em relação a outras moléculas potencialmente interferentes.
    1. Medir 50 mL de 0,05 M de tampão fosfato salino (PBS) em um balão volumétrico e transferir 50 mL de 0,05H PBS para uma maior (150 mL) num Erlenmeyer.
    2. Usando a tubagem ligada a um tanque de azoto (por exemplo, utilizando o tubo ligado um ejector de pressão), anexar uma ponta de pipeta (ex ponta P200) para a extremidade aberta do tubo. Colocar o tubo com a ponta da pipeta em anexo em solução de PBS e cobrir a solução ligeiramente com parafilm. Ligue azoto e suavemente bolha solução durante 20 min.
    3. Pesar 0,045 g de mPD.
      Cuidado: mPD é uma substância potencialmente cancerígena. Pesagem de mPD deve ser realizada utilizando uma escala contido dentro de um extractor de fumo. Usar luvas e máscara ao utilizar mPD. Garantir o capô é funcional e que a folha seja puxado para o nível de trabalho apropriado. Imediatamente superfícies limpas que possam ter sido contaminadas com mPD para evitar a coloração permanente.
    4. Depois de borbulhar, transferir todo o mPD para a solução de PBS desgaseificado. Cobrir a abertura do frasco com parafilm e suavemente solução agitar para dissolver mPD em solução. Evite aggressive a mistura ou utilização de um vórtice pois isso pode introduzir gases para dentro da solução.
    5. Transferir a solução para um copo de 50 mL. A barra de agitação não é necessária.
  2. Galvanoplastia o eléctrodo
    1. Obter um eléctrodo de referência. Utilizar eléctrodos de referência dedicados a mPD plaqueamento única. Utilizar um eléctrodo de referência para os procedimentos de calibração.
    2. Posicionar o braço de plástico do suporte do eléctrodo de referência durante a proveta. Verificar por bolhas de ar no eléctrodo de referência de vidro (pode não ser capaz de ver). Agite suavemente a extremidade distal do eléctrodo de referência para remover quaisquer bolhas de ar na ponta.
    3. Colocar o eléctrodo de referência, através da abertura no braço de plástico e inferior no tubo de ensaio contendo PBS. Certifique-se de que o eléctrodo de referência não entra em contacto com o fundo da proveta.
    4. Ligue o eléctrodo de referência para o andar de entrada (por exemplo, 2, pA / mV) e ligar (por exemplo conector DIP) MEA a ser placa mPDd para o andar de entrada.
    5. Diminuir a MEA na solução proveta de tal modo que apenas a ponta MEA é submerso na solução. Não submergir as pontas MEA no estado líquido para além da 'bolha' negro (o negro de isolamento localizado acima da ponta MEA). Isso pode danificar o MEA.
    6. Executar uma calibração 'teste' para verificar a funcionalidade dos canais de eléctrodos e ligação para o andar de entrada.
      NOTA: Embora as configurações de hardware deve refletir o equipamento a ser utilizado, os detalhes relacionados com analito / tipo interferente ea concentração não precisa ser digitado para a calibração 'test'. O modo de recodificação deve ser 'amperometria' e o 'V-aplicada' deve ser -0,7 V. Verificar gravação típico para todos os canais.
    7. Cancele seleccionando 'Cancelar' quando a conectividade de todos os locais de registro é verificada. Não é necessário para salvar os dados de calibração.
    8. Selecione o ícone "Galvanoplastia" no ambiente de trabalho. A Galvanoplastia ParaMenu de ol aparecerá. Verifique as configurações corretas são inseridas:
      PP amplitude de: 0,25
      Offset: -0.5
      Frequência: 0,05
      Duração (min): 20
    9. Selecione o botão 'pause' para começar chapeamento. O campo de tempo decorrido deve começar a contagem regressiva.
    10. Após a conclusão (todo o tempo decorrido), selecione 'outro MEA' no menu apareceu para começar mPD chapeamento um MEA adicional. Substitua o MEA banhado com um MEA a ser mPD banhado e repita o procedimento de galvanoplastia utilizando a ferramenta de galvanoplastia.
      NOTA: Recomenda-se usar a solução mPD preparado não mais de 2 vezes ou dentro de um período de 1 h. Prepare uma solução fresca para preparar mais de 2 AAM.
    11. Selecione 'software saída' para concluir galvanoplastia. Lavar pontas de eléctrodos de MPD-chapeado com água DI (para evitar um resíduo de sal) e armazenar (24 h) antes de o calibrar.
    12. Remover o eléctrodo de referência a partir da solução e enxagua-se com água desionizada antes da colocação em os s adequadascumulação solução (por exemplo, 3 M de NaCl). Assegurar a ponta do eléctrodo de referência é submerso em solução. Lentamente inferior eléctrodo de referência de vidro para dentro da solução para evitar danificar o vidro.
    13. Descarte a solução mPD em um recipiente de resíduos perigosos adequadamente marcada.

3. Calibre o MEA para Detecção de glutamato e Selectividade (Figura 1) 21

  1. Preparar as soluções necessárias para a calibração.
    NOTA: Consulte a Tabela 1.
  2. Executar a calibragem sob agitação constante (bateria magnético operado agitador), a 37 ° C. Ligue a almofada de aquecimento ou banho de água circulante e obter uma pequena barra de agitação. Mexa devagar, mas rápido o suficiente para que quando uma adição é feita (abaixo), o novo patamar é alcançado rapidamente.
  3. Ligue o andar de entrada (2 pA / mV) ao sistema de controlo de registo e inserir a ponta MEA em 40 mL de PBS 0,05 M agitada (usar um copo de 50 mL).
  4. Ligue o referência eléctrodo. Flick a fim de assegurar que não existem bolhas de ar.
  5. Abra o programa de gravação e clique em "Calibração". Verifique se as configurações estão corretas (verificar que os sites de sentinela são selecionados como isso pode mudar com diferentes eletrodos), escolher o número MEA e pressione "Start".
  6. Permitir que 5 - 10 minutos para equilibração; começar uma vez que a linha de base ter estabilizado (<0.004 nA min mudança /).
  7. Seleccionar "linha de base" e adicionar 500 mL de 20 ácido ascórbico mM (interferente; final [250 ^ M]) e seleccionar "Interferente" (AA é pensado como interferente ampla-cérebro) uma vez que a corrente atingiu um novo patamar, firme, se qualquer. Permitir 0,5-1 min entre as adições. Se o MEA está devidamente galvanizados, quase nenhuma mudança deve ser observada.
  8. Adicionar 40 uL de 20 mM de L-glutamato (final de [20? M]) e uma vez que a corrente atingiu um novo, plateau estável, uma marca r adição "Analito". Repetir três vezes para um total de 3 Glutamate adições.
  9. Adicionar 40 mL DA. Não selecione "Analito"; seleccionar "Substância de Teste" - DA só pode ser um interferente nas zonas que contêm AD.
  10. Adicionar 40 ul de peróxido. Não selecione "Analito"; selecione "substância de ensaio".
  11. Clique no botão "Stop" uma vez que a calibração está concluída.
  12. Para determinar a funcionalidade do MEA, clique na guia cálculo e gravar os seguintes parâmetros em um caderno de anotações.
    1. Para a concepção MEA (3.000? M 2) utilizado nestes calibrações, usar um MEA com um declive de 0,004 ≥ nA / uM mas inclinações mais baixas podem ser usadas para certas experiências. Se houver menos do que uma diferença de 10% na inclinação entre locais de enzimas revestidos e não revestidos, em seguida, usar estes AAM para libertação evocada única ou limpo / descartar o MEA.
    2. Usar um limite de detecção (LOD) ≤ 1,5 uM. Se o LOD seja maior do que 1,5 uM, em seguida, utilizar estas para MEAs releas evocadose e absorção somente. Não use esses eletrodos para gravar níveis tónicos.
    3. Usar uma selectividade para o analito pretendido (ou seja, o glutamato) sobre o interferente de> 20 unidades arbitrárias. Se selectividade é inferior a 20, em seguida, limpo / descartar o MEA.
    4. Usar uma linearidade (R2) da curva de calibração de ≥ 0,90. Se a linearidade é menos do que 0,90, em seguida, limpo ou descartar MEA.
  13. Salve o arquivo com o # da MEA, a data e as iniciais da pessoa calibragem.

4. Monte a micropipeta

NOTA: As micropipetas (capilar de vidro) deve ter uma ponta com um diâmetro interno de 10 - 15 um.

  1. Coloque a micropipeta centralmente entre todos os locais de gravação quatro platina e montar 50-100? M acima do MEA usando cera pegajoso e argila de modelagem.
  2. Para carregar a micropipeta, usar uma seringa de 1 ml, cheio com solução de KCl ou glutamato, um 0,22 um seringa estil filter, e um de 97 mm de comprimento, de calibre 28 pipeta de enchimento, repreencher da micropipeta. Ou seja, inserir a agulha no topo da micropipeta e preencher na parte inferior da micropipeta (o fim para o MEA), certificando-se que não há bolhas.
  3. Anexar a micropipeta para o sistema de ejecção de pressão a 2 - 20 psi durante cerca de 1 s.

5. Placa da Miniatura do eletrodo de referência para In Vivo Uso

  1. Preparar a solução de revestimento (50 g de NaCl / 90 mL de 1 M de HCl em um banho de 100 mL de proveta (plating)) e cortar o eléctrodo do banho (~ 10 cm de comprimento de platina (Pt) do fio (~ 0,02" de diâmetro)).
  2. Cortar uma 10 - 15 cm de comprimento da peça de Teflon revestido fio de prata (0,008" nu) e utilizar uma lâmina de barbear para raspar ~ 1 cm de revestimento de Teflon de cada extremidade da ponta do arame de prata.
  3. Soldar um pino de ouro sobre uma extremidade e colocar uma extremidade do fio de prata exposto no banho de chapeamento.
  4. Usando um adaptador DC (utilizar apenas um adaptador de corrente que tem uma saída de ~ 9 -. 15 VDC max),prender o fio de "vermelho" (+) para o fio de prata preparada (eléctrodo de referência), do lado do pino de ouro. Prender o "preto" (-) de fio de Pt banho de cátodo.
  5. Ligar o adaptador de DC. Olhe para o processo de revestimento correto - bolhas deve aparecer no eletrodo de banho; eletrodo de referência transforma uma prata / cor cinza.
    CUIDADO: Não ligue os fios [preto (-) vs Red (+)] - chapeamento banho será arruinado se isso ocorrer e solução fresca chapeamento terá de ser feita. A má solução vai se transformar na cor amarela: não use!
    NOTA: A reacção de chapeamento leva 2-5 min geral: Ag 0 + Cl - → AgCl + e -
  6. Testar o eléctrodo de referência.
    1. Definir um multímetro para o 100 - configuração de 200 mV DC.
    2. Coloque um ponto de referência (isto é, um eléctrodo previamente testado conhecido para trabalhar) eléctrodo de referência em NaCl 3 M e teste contra o eléctrodo de referência recém-preparada.
      NOTA: Se nósing um novo eléctrodo de referência, embeba-lo no seio de NaCl 3 M, antes de uso (12 h recomendado).
    3. Coloque o chumbo "vermelho" (+) no pino de ouro do eléctrodo de referência para ser testado. Coloque o "preto" - liderança no eletrodo de referência (). Uma gama aceitável de leitura é de ± 10 mV. 0 mV é ideal entre os eléctrodos de referência 2.

Cirurgia 6. animal Geral de MEA Recordings

  1. Preparação para a cirurgia
    1. Coloque Equipamentos para a cirurgia em desinfetante na noite anterior.
    2. Retirar as ferramentas do desinfetante e enxaguar bem e colocar as ferramentas em uma almofada cirurgia estéril. Obter uma almofada de aquecimento.
    3. Calibrar dois eléctrodos e fixar a micropipeta como descrito nos procedimentos 3 e 4.
    4. Faça o eletrodo de referência conforme descrito na Seção 5.
    5. Adicione 200 uM de glutamato e KCl 70 mM. Consulte a Tabela 1.
    6. Obter o animal e registar o peso em folhas de cirurgia.
    7. Prepare a anestesia e ligar a almofada de aquecimento.
  2. Realizar a cirurgia MEA
    1. Utilizando isoflurano (fluxo 4% em oxigénio), anestesiar o animal numa câmara de indução até que a taxa respiratória diminuiu significativamente e o animal não responder ao dedo do pé ou de aperto da cauda. taxa respiratória da ficha e da temperatura corporal a cada 15 min.
    2. Colocar o animal no dispositivo estereotáxico utilizando as barras de ouvido para estabilizar a cabeça. Certifique-se de que o animal está seguro e a cabeça não se move. Reduzir o fluxo de isoflurano a 1,5-3% em oxigénio. Certifique-se de que a almofada de aquecimento está devidamente posicionado sob o animal e ajustado para 37 ° C para fornecer calor suplementar. A falha em fornecer calor suplementar pode resultar em hipotermia profunda e morte prematura do animal.
    3. Aplicar pomada utilizando um aplicador de algodão estéril e gravar a frequência respiratória etemperatura corporal. Usando um aparador alimentado por bateria, raspar a parte superior da cabeça. Use as pequenas tesouras cirúrgicas para remover a pele perto das orelhas.
    4. Neste ponto, colocar as luvas cirúrgicas estéreis. Aplicar o iodo e, em seguida, álcool (por três vezes) para o couro cabeludo.
    5. Usando um bisturi, fazer uma incisão linha reta no meio do couro cabeludo e espalhar a pele com pinças bull dog. Dê uma dica de algodão estéril para absorver todo o sangue. Usar peróxido de hidrogénio para facilitar o aparecimento de bregma e lambda.
    6. Verificar que a cabeça está devidamente posicionado através da medição da D / V e M / L de coordenadas bregma e lambda. Coordenar as alterações devem ser zero se a cabeça está em uma superfície plana. Ajustar as barras de cabeça e da orelha, conforme necessário para assegurar uma superfície plana.
    7. Encontrar bregma, e zero as coordenadas. Usando as coordenadas desejadas, mover para a esquerda e para a direita e faça uma marca com um marcador permanente. Usando um cauterizador / marcador, fazer uma grande praça em torno da marca, com espaço suficiente para alcançar oregião desejada.
    8. Usando uma ferramenta rotativa estéril, perfurar em torno da marca quadrada. Deixe-se envolver todo o sangue usando um aplicador de algodão estéril. Completamente desinfectar a broca antes de cada utilização.
    9. Anexar o MEA para o andar de entrada e aterrar a pipeta com a primeira solução desejada. Certifique-se de deixar uma lacuna na pipeta sem solução para que a solução ser expulso pode ser examinado. Conectar o tubo para a micropipeta de vidro.
    10. Ligar o tanque de azoto e o ejector de pressão (psi = 5, tempo = 0,6 s). Test (pressione o botão vermelho manual) para garantir a pipeta não está entupido antes de começar.
    11. Calibrar a micropipeta. Comece no 0 no retículo e coloque um pedaço de fita azul no headstage para indicar o ponto de início. Ligue o leitor digital e redefini-la para zero. Ir para baixo de 1 mm (DV) e contagem do número de tiques da solução mudou-se o retículo. 10 carrapatos deve ser igual a 1 mm (1 mm = 250 nL), para que um tique = 25 nL.
    12. Colocar o eléctrodo de referência numalocalização remota a partir da MEA de tal modo que ainda está em contacto com o líquido com o cérebro para completar o circuito.
    13. Encontrar bregma com o MEA ligado e zero o leitor digital. Mover o MEA para as coordenadas desejadas. Lentamente, abaixe o MEA até que a ponta toca o cérebro. Zero DV coordenar e lentamente o MEA no cérebro.
    14. No programa de gravação, clique no eletrodo calibrado desejado e clique em "Executar Experiment". O sistema irá iniciar a gravação de níveis tónicos para o analito de interesse, enquanto o animal é anestesiado.
    15. Aumentar a um eixo que vai ajudar na observação da linha de base e permitir que o eléctrodo de linha de base para 20 - 45 min.
    16. Depois a linha de base é estável, definir o ejector de pressão para .6 s e 5 psi e pressionar a tecla vermelha sobre o ejector de pressão para ejectar. Gravar o tempo e pressão, assim como de volume / carrapatos movido sobre a folha de injecção (Figura 2). Faça quaisquer notas que são necessárias (ie,picos maiores, efeitos de diluição, pipeta entupido, barulhento linha de base / o-escopo).
    17. Para injecções de glutamato, esperar 3-5 min entre as injecções. Para injecções de KCl esperar 1 - 2 min entre as injecções. Injectar usando a mesma pressão e tempo de pelo menos 3 vezes. Alterar a hora e repita. Tente não alterar a pressão a menos que o micropipeta está entupido.
    18. Se a micropipeta está entupido, aumentar a pressão até 30 psi.
    19. Gravar a partir das regiões cerebrais desejados, repetindo-se em ambos os lados do cérebro utilizando soluções diferentes. Gravar uma linha de base em cada nova região, durante 20 min.
    20. Tomar o MEA com micropipeta em anexo, enxaguar com água DI e embeber em PBS durante a noite até que todo o sangue é ido.
    21. Eutanásia o animal e guardar o cérebro num tubo pré-rotulados e armazenados no congelador de -80 ° C ou manter um lado para a fixação. Para sacrificar o animal, sobredosagem com isoflurano (inalação). Execute decapitação usando uma tesoura cirúrgica e dissecar as regiões desejadas.

7. AAM Limpeza revestidos depois de Uso

  1. Fazer AMA não limpa se não utilizado. Se houver cotão ou de pó sobre a superfície, limpa com metanol e deixar secar durante 24 horas antes do revestimento.
  2. Ligar o banho de água (80 ° C) e embeber a ponta da MEA, durante 30 min. Cuidadosamente limpar a ponta do eléctrodo com um aplicador com ponta de algodão para remover quaisquer detritos que pode ser deixada na ponta do eléctrodo. Não fique com a "porção de isolamento" preto do MEA molhado.
  3. Usando três sonicadores diferentes, embeber a ponta da MEA em (1) Citrisolv, um comercial de solvente e agente de compensação (2) isopropílico, e (3) água desionizada, durante 5 min. Cuidadosamente limpar a ponta do eléctrodo com aplicador com ponta de algodão para remover quaisquer detritos que pode ser deixada na ponta do eléctrodo.
  4. Examine as sugestões em um microscópio de dissecação para garantir as camadas foram removidas com sucesso.

8. Análise

  1. Para analisar os dados,primeiro exportar a experiência desejada clicando duas vezes o experimento acabado e selecionando "exportar dados" a partir do menu drop-down arquivo.
  2. Salvar esses dados para o local do arquivo desejado e abrir o programa de análise. Clique em "abrir" no programa de análise e escolha o arquivo recentemente salvo.
  3. Dê o programa de alguns momentos para fazer o upload do arquivo e, em seguida, verificar experimento sob a guia marcadores de eventos. Sob saída, verificar as caixas para os parâmetros desejados. Por exemplo, linha de base, a amplitude, a área de pico (área sob a curva), t origem, e T-80.
  4. Clique em Atualizar e, em seguida, analisar para exportar os dados para uma planilha (isso pode levar alguns minutos). O programa dará um prompt para salvar o arquivo para o local desejado. Uma vez salvo, o arquivo pode ser editado em uma planilha.

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Resultados

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Embora esta tecnologia pode ser usada para medir alterações na glutamatérgica sinalização em muitos tipos de modelos animais, tais como lesão traumática cerebral, envelhecimento, estresse e epilepsia, aqui vamos demonstrar como a tecnologia MEA pode ser usado para examinar alterações glutamatérgicos no modelo de rato transgénico de taupatia humano 19, 20. O RTG (TauP301L) 4510 ratinho expressa a mutao P301L em tau associada a dem...

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Discussão

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A técnica MEA permite a medição da cinética rápida de libertação de neurotransmissores e a absorção in vitro e in vivo. Assim, a tecnologia produz uma vasta variedade de saída de dados, incluindo os níveis de neurotransmissores tónicas, a libertação de neurotransmissores evocados, e depuração neurotransmissor. No entanto, porque o uso de AAM é um procedimento relativamente complexo, existem numerosos factores que podem necessitar de ser optimizado para utilização com sucesso. Por exemplo, durante a cal...

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Divulgações

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GG é o único proprietário de Quanteon, LLC que faz com que o sistema de gravação FAST-16 usado para medições de glutamato neste estudo. JEQ é um consultor pago para Quanteon.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Associação de Alzheimer (MNR; NIRG-12-242187), WVU Faculdade Research Senado Grant (MNR), e WVU PSCOR Grant (RNM).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
FAST-16mkIII-8 canaisQuanteon16mkIII
Microeletrodos matrizesCenMetW4 ou 8-TRK
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA-305910 g (expira após 1 mês)
GlutaraldeídoSigma-AldrichG-6257100 mL (expira após 6 meses)
Glutamato OxidaseUS Biological ou Sigma AldrichG4001-01 ou 10064650 UI (expira após 6 meses)
SeringasHamilton Hamilton#803832 seringas
MetanolBDHUN12304 L
m-Cloridrato de fenilenodiamina (mPD)ACROS Organics133056025025 g
Eletrodos de referência (RE-5B)BASMF-20793 eletrodos
Magnético alimentado por bateria placa de agitaçãoCole-parmerEW-04804-01Pode comprar de diferentes fornecedores
GlutamatoSigma-AldrichG-1626100 g
Ácido ascórbicoTCI50-81-7500 g
Cloridrato de dopaminaAlfa Aesar62-31-75 g
Ácido perclóricoVWRUN2920500 mL
Cloreto de pósssioVWR7447-40-71 kg
de cloreto de sódioVWR7647-40-71 kg
cloreto de cálcioMP153502100 g
de hidróxido de sódioBDH1310732500 g
de pipetas de ejeção de pressão de vidro CenMet
Cera pegajosaKerrlab625Pode ser comprado de diferentes fornecedores
MicrosyringeWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Massa de modelarWalMartPode comprar de diferentes fornecedores
Picospritzer IIIParker
Fio de prataAM systems#786500
Ácido clorídricoBDH76470102.5 L
Fio de platinaAM Systems778000
Pistola de soldaLowes ou Home DepotPode comprar de diferentes fornecedores
MultímetroWalMartPode comprar de diferentes fornecedores
PhysioSuiteKent ScientificPode comprar de diferentes fornecedores
SomnoSuiteKent ScientificPode comprar de diferentes fornecedores
DispositivoestereotáxicoStoeltingPode comprar de diferentes fornecedores
Digital Lab StandardStoeltingPode comprar de diferentes fornecedores
Microscópio Meiji EMZBroca MeijiEMZ-5
DremelMicro
MetricideMetrex102800
BisturiVWRPode comprar de diferentes fornecedores
Tesoura de cirurgiaVWRPode comprar de diferentes fornecedores
Cotonetes estéreisPuritan25806Pode comprar de diferentes fornecedores
Pomada para os olhos PomadaPuralube Vet PomadaObter do veterinário
Cotonetes de iodoVWRS48050Pode comprar de diferentes fornecedores
Cotonetes com álcoolDrogaria localPode comprar de diferentes fornecedores
Campo de cirurgia estérilDynarex4410Pode comprar de diferentes fornecedores
Solução salina estérilTeknovaS5815Pode fazer sua própria solução usando filtros
Peróxido de hidrogênio (3%)FarmáciaPode comprar de diferentes fornecedores
Almofada de aquecimentoWalMartPode comprar de diferentes fornecedor
de local

Referências

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