Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

Summary

Este trabalho apresenta um fluxo de trabalho de microscopia de alto conteúdo para a quantificação simultânea dos níveis intracelulares de ROS, bem como o potencial e morfologia da membrana mitocondrial, denominados conjuntamente como morfofunção mitocondrial, em células vivas aderentes, 6) -clorometil-2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM-H ₂ DCFDA) e éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).

Abstract

As espécies reativas de oxigênio (ROS) regulam os processos celulares essenciais, incluindo a expressão gênica, migração, diferenciação e proliferação. No entanto, níveis excessivos de ROS induzem um estado de estresse oxidativo, que é acompanhado por danos oxidativos irreversíveis ao DNA, lipídios e proteínas. Assim, a quantificação de ROS fornece um proxy direto para condição de saúde celular. Uma vez que as mitocôndrias estão entre as principais fontes e alvos celulares de ROS, a análise conjunta da função mitocondrial e da produção de ROS nas mesmas células é crucial para melhor compreensão da interconexão em condições fisiopatológicas. Portanto, desenvolveu-se uma estratégia baseada em microscopia de alto conteúdo para quantificação simultânea dos níveis intracelulares de ROS, potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ _m ) e morfologia mitocondrial. É baseado em microscopia de fluorescência de campo largo automatizada e análise de imagem de células aderentes vivas, cultivadas em placas de múltiplos poços, e staineD com as moléculas fluorescentes CM-H ₂ DCFDA (ROS) e TMRM (ΔΨm e morfologia mitocondrial) permeáveis ​​às células. Em contraste com a fluorimetria ou citometria de fluxo, esta estratégia permite a quantificação dos parâmetros subcelulares ao nível da célula individual com elevada resolução espaço-temporal, tanto antes como depois da estimulação experimental. É importante notar que a natureza baseada em imagens do método permite extrair parâmetros morfológicos além das intensidades de sinal. O conjunto de recursos combinados é usado para análise de dados multivariada exploratória e estatística para detectar diferenças entre subpopulações, tipos de células e / ou tratamentos. Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do ensaio, juntamente com um exemplo de experiência que comprova o seu potencial para discriminação inequívoca entre estados celulares após perturbação química.

Introduction

A concentração de ROS intracelular é meticulosamente regulada através de uma interacção dinâmica entre a produção de ROS e sistemas de desactivação ROS. O desequilíbrio entre os dois provoca um estado de estresse oxidativo. Entre as principais fontes de ROS estão as mitocôndrias ¹ . Dado o seu papel na respiração celular, são responsáveis ​​pela maior parte das moléculas intracelulares de superóxido (O ₂ ^{• -} ) ² . Isto resulta principalmente da fuga de electrões para O ₂ no complexo 1 da cadeia de transporte de electrões em condições de forte potencial negativo interno de membrana ....

Protocol

O protocolo abaixo é descrito como realizado para células NHDF e com utilização das placas multipoço especificadas no ficheiro de materiais. Consulte a Figura 1 para obter uma visão geral do fluxo de trabalho.

1. Preparação de Reagentes

1. Preparar o meio completo suplementando o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% v / v de soro bovino fetal (FBS) e 100 IU / mL de penicilina e 100 IU / mL de estreptomicina (PS). Para 500 mL de meio completo, adicionar 50 mL de FBS e 5 mL de PS a 445 mL de DMEM.
2. Preparar o tampão de imagem HBSS-HEPES (HH), suplementando a solução de sal equili....

Results

O ensaio foi comparado utilizando várias experiências de controlo, cujos resultados estão descritos em Sieprath et al. ¹ . Em resumo, a resposta de fluorescência de CM-H ₂ DCFDA e TMRM a induzido extraneamente alterações no ROS intracelular e Δψ _m, respectivamente, foi quantificada para determinar o intervalo dinâmico. Para o DCFDA CM-H ₂ , o NHDF mostrou um aumento linear no sinal de fluorescência quando tratado com conce.......

Discussion

Este artigo descreve um método de microscopia de alto conteúdo para a quantificação simultânea de níveis intracelulares de ROS e morfofunção mitocondrial em NHDF. O seu desempenho foi demonstrado com um estudo de caso sobre NHDF tratado com SQV. Os resultados suportam evidências anteriores da literatura em que se observaram níveis elevados de ROS ou disfunção mitocondrial após tratamento com inibidores de protease de HIV tipo 1, embora em experiências separadas ^{19 , 2.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentes
Tetrametilrodamina, Éster metílico, Perclorato (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (Indicador Geral de Estresse Oxidativo)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimetilsulfóxido Sigma	)Aldrich	D8418
Placa MicroWell com Fundo de Vidro de 96 Poços MatriPlate 630 µ L-Preto 0,17 mm com Tampa de Vidro Baixo	Brooks life science systems	MGB096-1-2-LG-L
HBSS sem Fenol Vermelho 500 mL	Lonza	BE10-527F
DMEM glicose alta com L-glutamina	Lonza	BE12-604F
Fosfato Bufered Saline (PBS) sem Ca e Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Solução de tripsina-versena (EDTA)	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragmento de burro Anti-coelho IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Anticorpo usado para adquirir imagem de campo plano
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Coelho IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Anticorpo usado para adquirir imagem de campo plano
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento
Nikon Ti eclipse microscópio de campo amplo	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		baseado em hardware sistema de foco automático
CFI Plan Apo Lambda 20X objetiva	Nikon
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 com módulo JOBS	Nikon		Este software é usado para orientar o microscópio e programar/executar o prototocol de aquisição automática de imagem
ImageJ (FIJI) Versão 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Versão 1.0.44	Rstudio
R versão 3.3.2