Visualização Quantitativa de Infiltrado de Leucócitos em um Modelo Murino de Miocardite Fulminante por Microscopia de Folha de Luz

Summary

Aqui, descrevemos uma abordagem de microscopia de folha clara para visualizar o infiltrado de leucócitos CD45 ⁺ cardíacos em um modelo murino de miocardite fulminante asséptica, que é induzida pelo tratamento de toxina diftônica intratraqueal de ratos CD11c.DTR.

Abstract

A microscopia de fluorescência de folha clara (LSFM), em combinação com protocolos de limpeza química, tornou-se o padrão-ouro para analisar estruturas marcadas de forma fluorescente em grandes espécimes biológicos e está em baixa resolução celular. Enquanto isso, o refinamento constante dos protocolos subjacentes e a maior disponibilidade de sistemas comerciais especializados permitem investigar a microestrutura de órgãos de ratos inteiros e até mesmo permitir a caracterização do comportamento celular em várias abordagens de imagens de células vivas. Aqui, descrevemos um protocolo para a visualização espacial de montagem total e a quantificação da população de leucócitos CD45 ^{+ em} corações inflamados de ratos. O método emprega uma cepa de rato transgênica (CD11c.DTR) que recentemente mostrou ser um modelo robusto e induzível para o estudo do desenvolvimento de miocardite fulminante fatal, caracterizada por arritmias cardíacas letais. Este protocolo inclui a indução de miocardite, intravíteColoração de células mediada por anticorpos, preparação de órgãos e LSFM com posterior processamento de imagem assistida por computador. Embora apresentado como um método altamente adaptado para nossa questão científica particular, o protocolo representa o modelo de um sistema facilmente ajustável que também pode alvejar estruturas fluorescentes completamente diferentes em outros órgãos e mesmo em outras espécies.

Introduction

Durante a evolução do microscópio de luz, surgiram muitas formas especializadas, todas desenvolvidas para minimizar as limitações no processo de visualização de determinados espécimes. Um desses métodos é a microscopia de fluorescência de folha clara (LSFM). Desenvolvido em 1903 pela Siedentopf e Zsigmondy ¹ e encontrando suas primeiras aplicações biológicas fundamentais no início da década de 1990 ² , o LSFM tornou-se a ferramenta microscópica mais poderosa até à data para a visualização de grandes espécimes, como órgãos de ratos intactos, com uma resolução de sinal de fluorescência Até o nível celular. Devido a esses ....

Protocol

Todas as experiências com animais foram conduzidas de acordo com as orientações da UE e foram aprovadas pelas autoridades locais relevantes em Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Alemanha). Os animais foram utilizados e alojados sob condições específicas de patógeno livre (SPF).

1. Indução de miocardite por toxina de difteria (DTX)

1. Prepare a solução de DTX para a indução de miocardite, diluindo a solução de reserva de DTX com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para uma solução de trabalho de 1 μg / mL.
2. Aplicar 100 μL desta solução....

Results

A abordagem LSFM apresentada analisa a distribuição de leucócitos e a quantidade de corações murinos após a indução de miocardite grave. A Figura 1A explica o protocolo de pré-tratamento para os ratos CD11c.DTR transgênicos para indução de miocardite. Este passo representa o gatilho necessário para o recrutamento de leucócitos para o miocardio. Após uma aplicação DTX bem sucedida, os animais desenvolvem sintomas de doença grave, como fraqueza geral, anorexia e perda de p.......

Discussion

Na ciência da vida moderna, a visualização microscópica dos processos biológicos desempenha um papel cada vez mais importante. Neste contexto, muitos desenvolvimentos foram alcançados nos últimos dois séculos que ajudam a responder questões não abordáveis ​​até este ponto,. Primeiro, tem havido uma tendência clara de aumentar fundamentalmente a capacidade de resolução de microscópios de luz. Com microscopia de iluminação estruturada (SIM) ^{21 , 22} , microscopia e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
toxina diftérica	Sigma Aldrich	D0564
solução salina tamponada com fosfato	Biochrom	L182-10
cetamina [50 mg/mL]	Inresa	PZN 4089014
xilazina [2%]	Seringa Ceva
	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
cateter venoso interno	Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
respirador para pequenos animais	Harvard Apparatus	73-0044
MiniVent anticorpo anti-CD45 (AF647)	BioLegend	103124
ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) sal dissódico di-hidratado	Carl Roth	8043.2
cateter (21 G)	BD Biosciences	REF 387455	BD valu-set
paraformaldeído	Sigma Aldrich	P6148
tubo PE (5 mL)	Carl Roth	EKY9.1	Rotilabo
etanol	Carl Roth	9065.4
éter dibenzílico	Sigma-Aldrich	108014
tubo rotador	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
agarose (baixa gelificação)	Sigma Aldrich	Molde A4018
(15 x 15 x 5 mm)	Tissue Tek	4566	Cryomold
sistema de microscópio de folha de luz	LaVision Biotec		Ultramicroscope
corpo do microscópio	Olympus		MVX10
objetivo	Olympus		0.5  NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5  mm
câmera sCMOS 5.5MP	Andor Technology
488 nm OPSL (50mW) laser	Laser de
de 647 nm (50mW)	Software coerente
de processamento e análise de imagem 3D	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
cepa de camundongo transgênico	Steffen Jung et al.		CD11c.DTR
wt cepa de camundongo	Envigo		Balb / c Ola Hsd J
Módulo de Laser	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Lente Objetiva