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Artigo de método

Um ensaio Compatível de alta capacidade para avaliar droga Eficácia contra macrófagos passadas

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DOI:

10.3791/55453

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24 de março de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

Novos modelos e ensaios que melhorariam o processo inicial de desenvolvimento de medicamentos para a próxima geração de medicamentos antituberculose são altamente desejáveis. Aqui, descrevemos um ensaio rápido, barato e compatível com BSL-2 para avaliar a eficácia do medicamento contra Mycobacterium tuberculosis que pode ser facilmente adaptado para triagem de alto rendimento.

Resumo

O processo inicial de desenvolvimento de medicamentos antituberculose é dificultado pela tradução ineficiente de compostos com atividade in vitro para eficácia no ambiente clínico. Isso provavelmente se deve à falta de consideração pelas barreiras de penetração celular fisiologicamente relevantes que existem no hospedeiro infectado. Recentemente, estabelecemos um modelo alternativo de infecção que gera grandes estruturas agregadas de macrófagos contendo M. tuberculosis (Mtb) densamente compactado em seu núcleo, o que foi adequado para testes de suscetibilidade a drogas. Este modelo de infecção é barato, rápido e, o mais importante, compatível com BSL-2. Aqui, descrevemos os procedimentos experimentais para gerar estruturas agregadas de Mtb/macrófagos que produziriam Mtb de passagem de macrófagos para testes de suscetibilidade a drogas. Em particular, demonstramos como esse sistema de infecção pode ser adaptado diretamente ao formato de placa de 96 poços, mostrando capacidade de rendimento para a triagem de bibliotecas de compostos contra Mtb. No geral, este ensaio é uma adição valiosa à caixa de ferramentas de descoberta de medicamentos Mtb atualmente disponível devido à sua simplicidade, custo-benefício e escalabilidade.

Introdução

A tuberculose (TB) continua a ser uma séria ameaça à saúde global, apesar da disponibilidade de regimes de quimioterapia anti-tuberculose há mais de 40 anos 1. Isto é devido em parte à exigência de períodos de tratamento longo de mais de seis meses usando várias combinações de medicamentos, o que leva a paciente a não conformidade 2. O surgimento de tuberculose resistente a medicamentos nos últimos anos tem agravado os problemas em um campo onde o desenvolvimento bem sucedido de drogas clinicamente aprovados é praticamente inexistente 3. Na verdade, apesar do desenvolvimento exaustiva de drogas anti-TB, apenas uma única droga foi aprovada pela FDA para uso clínico nos últimos 40 anos 4. Assim, as novas gerações de medicamentos anti-tuberculose são urgentemente necessárias para resolver este problema.

Um problema fundamental na descoberta TB é a falta de sucesso da transferência a partir de compostos com actividade in vitro para a eficácia no ambiente clínico= "xref"> 5, 6, 7. Inicialmente, as abordagens baseadas alvo foram utilizadas para pesquisar drogas anti-Mtb 5, que não se traduziu em células bacterianas inteiras. Mesmo quando são utilizadas células de M. tuberculosis, que é frequentemente realizada usando caldo cultivado culturas, que não prevêem com precisão a eficácia do fármaco in vivo, 8, 9. Estes problemas têm sido reconhecidas e ensaios de rastreio de drogas contra macrófagos contendo M. tuberculosis ou M. tuberculosis latente foram estabelecidas com êxito 8, 10, 11, 12. No entanto, mesmo esses ensaios mais avançados, não dão conta suficiente para as barreiras de penetração que as drogas encontram nas lesões pulmonares não vascularizados, e na focos de necrose no local da infecção. De fato, Até mesmo para a primeira linha TB rifampicina droga, a dose sub-óptima tem sido questionada devido à inadequada no tecido vivo e líquido cefalorraquidiano (LCR) penetração 13, 14, 15, bem como diminuição da eficácia contra intracelular Mtb 8, 9. Como tal, os novos modelos e ensaios que tenham em conta esses parâmetros durante o processo de desenvolvimento de liderança no início, sem dúvida, melhorar a TB esforços de descoberta de drogas.

Para atender a essa necessidade, que recentemente estabeleceu um 2 BSL-modelo de infecção barato, rápido e compatível alternativa para Mtb droga testes de eficácia 16. Este modelo de infecção produzida densamente Mtb dentro de grandes estruturas agregadas de macrófagos, que recapitulou as barreiras de penetração celular fisiologicamente relevantes e gerou macrófagos passadas Mtb com um estado fisiológico alterado assemelhando-se latente Mtb. Mtb derivado deste modelo de infecção foi combinado com o ensaio de microplaca com resazurina (REMA) para avaliar a eficácia da droga, o que produziu resultados consistentes com outros modelos de infecção intracelular e bem correlacionado com a capacidade reportada das drogas comuns TB para atingir concentrações elevadas de CSF em relação às concentrações séricas 16.

Aqui nós descrevemos em detalhe a geração de Mtb / estruturas de agregação de macrófagos para produzir e macrófagos passadas Mtb apropriado para o teste de sensibilidade às drogas usando REMA. Em particular, mostra-se como este sistema de infecção poderia ser adaptado a um formato de 96 poços para compatibilidade com throughput screening de candidatos de drogas anti-TB.

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Protocolo

NOTA: Como M. tuberculosis mc 2 6206 é uma estirpe avirulenta 17, 18, todo o trabalho neste protocolo pode ser realizada em uma instalação de segurança biológica 2 Nível (BSL-2).

1. As condições de cultura para Green Fluorescent Protein Expressando M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb GFP)

NOTA: O M. tuberculosis H37Rv derivado auxotróf ica estirpe MC 6206 2 (Δ PANCD, Δ leuCD) transformada com o plasmídeo que expressa GFP pMN437 é utilizado ao longo deste protocolo 16. É possível substituir a tensão Mtb-GFP com não expressando GFP do tipo selvagem tensão para permitir mais fácil acessibilidade da estirpe para os investigadores. No entanto, a expressão da GFP é desejável para permitir a confirmação visual da fagocitose e formação de agregados de M. tuberculosis / macrófagos. para lonarmazenagem a longo prazo g, Mtb -GFP foram congeladas a -80 ° C em meio completo (7H9 descritos no passo 1.1) suplementado com 20% de glicerol.

  1. Prepare completa meios de Mtb -GFP (7H9-C), completando 7H9 meio com 10% de Middlebrook OADC, 0,02% de tiloxapol, 24 ug / mL de ácido D-pantoténico, 50 ug / ml de L-leucina e 50 ug / ml de higromicina B.
  2. Descongelar um frasco de Mtb -GFP e adicionar a 10 ml de 7H9-C num frasco de PETG fundo rectangular 30 mL.
  3. Incubar a 37 ° C num agitador rotativo (50 rpm). Tome as medições de densidade óptica (DO 600) todos os dias até DO600 atinge 1.0 (aproximadamente 5-8 dias).
  4. Diluir e da cultura passagem como necessário para manter um OD 600 entre 0,2-1,0.
  5. Para a infecção, utilizar uma cultura estabelecida de Mtb -GFP dentro da fase de crescimento logarítmico (DO600 de 0,6-1). Para evitar culturas aglomerada, sonicar o frasco de cultura de M. tuberculosis num banho de água (130 W; 3 x 5 s pulsos) ONCe ou duas vezes por semana

2. Condições de cultura para As células THP-1

  1. Prepare completa meios de células THP-1 (meio RPMI-C), completando meio RPMI 1640 com 10% de soro inactivado por calor fetal de bovino, 2 mM de L-glutamina, e 10 mM de HEPES.
  2. Incubar as células em um frasco T-75 a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2.
  3. Contagem de células utilizando um hemocitómetro ou por citometria de fluxo em dias alternados e manter as células THP-1 a uma densidade entre 0,1-0600000 por mL.

3. Infecção protocolo para gerar estruturas Mtb / macrófagos agregadas

  1. THP-1 preparação de células (por placa de 96 poços)
    1. Centrífuga 7 X 10 6 células THP-1 a 250 xg durante 5 min. Ressuspender em 7 mL de meio RPMI-C.
  2. Preparação Mtb -GFP
    1. Centrifugar 2,8 x 10 8 Mtb -GFP a 3200 xg durante 5 minutos numa centrifuga-L baldecantar uma conversão de OD 600 1.0 = 3 x 10 8 bactérias / mL.
    2. Lavar uma vez com RPMI-C e centrifuga-se tal como no passo 3.2.1.
    3. Ressuspender em 7 mL de meio RPMI-C e agitar com vortex durante 10 s.
  3. Infecção
    Nota: Consulte a Figura 1 para modelo.
    1. Prepara-se uma placa de 96 cavidades por adição de 200 uL de água estéril em filas A e H e as colunas 1 e 12 para um aro de água para evitar a evaporação do meio de cultura.
    2. Adicionar 200 uL de RPMI-C para a coluna 2 (B2 para G2) para o controlo de fundo (em branco).
    3. Para infectar, adicione suspensão Mtb -GFP (passo 3.2) para suspensão de células THP-1 (passo 3.1) e misture bem por pipetagem. A densidade de células THP-1 final é de 5 x 10 5 por ml e a multiplicidade correspondente de infecção é de 40.
    4. Verter a suspensão de células THP-1 / Mtb -GFP em um reservatório de 25 ml.
    5. Adicionar 200 mL de THP-1 / suspensão Mtb -GFP a todos os 96 poços restantes (B3 através G11) usinga pipeta multi-canal.
      NOTA: Se múltiplos que trabalha com placas de 96 poços, ressuspender regularmente a restante suspensão de células THP-1 / Mtb no reservatório para assegurar uma mistura uniforme é adicionado a cada poço.
    6. Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 7-10 dias.
    7. Mudar meios a cada 2 dias, removendo-se lentamente 100 ul meios gasto a partir do topo de cada poço e suavemente adicionando 100 ul de RPMI pré-aquecido-C utilizando uma pipeta multi-canal. Não ressuspender poços e perturbar os agregados de Mtb / macrófagos no fundo dos poços.
    8. Examine visualmente os poços por microscopia de fluorescência (objetiva 4-10x) diariamente, tomando nota do tamanho do Mtb agregados / macrófagos. Por dia 10/07, Mtb agregados / macrófagos deve ser suficientemente grande (consulte a Figura 2 para referência) para prosseguir para testes de eficácia da droga (Seção 4).
    9. Se desejado, capturar imagens dos 96 poços utilizando um sistema de imagem de células automatizado equipadocom o campo luminoso e filtro GFP define para documentar a formação de agregados Mtb / macrófagos.
      NOTA: Se os usuários não têm acesso a um sistema de imagem automatizado, imagens de poços representativos podem ser tomadas utilizando qualquer microscópio apropriado com capacidades de GFP e de campo brilhante.

4. Crescimento Ensaio de Inibição de Avaliação de Drogas eficácia contra Mtb Derivado do Mtb / macrófagos Agregados

  1. Preparação de drogas (em triplicado condições para duas drogas)
    NOTA: Ver Figura 1A para o modelo.
    1. Numa placa de 96 poços separada, adicionar 125 uL de meios de 7H9-C para B2 através de G10.
    2. Preparar dois fármacos com o dobro da maior concentração final desejada em 1 ml de 7H9-C para dar conta da diluição no passo 4.2.4.
    3. Adicionar 250 uL de cada fármaco aos poços B11-C11-D11 e E11-F11-G11, respectivamente, para tratamentos em triplicado.
    4. Usando uma pipeta multi-canal, em série dilute os fármacos de teste de duas vezes por movendo 125 mL de B11-G11-G10 em B10. Misturar por pipetagem de 5 vezes em cada passo.
    5. Continuar a mover-se 125 uL da coluna a coluna (direita para a esquerda) do outro lado da placa, e depois de parar a coluna 4.
    6. Depois de se misturar coluna 4, descartar 125 mL num recipiente de desperdícios. As colunas 2 e 3 não deve conter quaisquer drogas para permitir o uso como um fundo (em branco) e controlo de crescimento positivo.
      NOTA: Como alternativa, siga modelo na Figura 1B para bibliotecas de teste de drogas. Cada placa de 96 poços pode acomodar 58 drogas numa concentração única. Preparar esta placa de drogas utilizando o dobro da concentração final desejada, uma vez que será diluída pela metade na etapa 4.2.4.
  2. O tratamento medicamentoso:
    1. Recuperar a placa de 96 poços contendo o Mtb infectados macrófagos (agregados de Mtb / macrófagos).
    2. Cuidadosamente decantar todos os poços relevantes (B2 através G11) com uma pipeta de multi-canal.Executar esta de um modo em dois passos: primeiro remover 150 mL sem inclinação da placa, e em seguida, retirar o suporte restantes (~ 50 ul) através da inclinação da placa e inserindo a ponta da pipeta para o bordo inferior do poço. Como Mtb / macrófagos agregados são aderentes ao fundo do poço, nenhum material deve ser perdida.
    3. Suavemente adicionar 100 de meio 7H9-C a todos os poços relevantes (B2 através G11) da placa contendo os agregados / macrófagos de M. tuberculosis.
    4. Usando uma pipeta de multi-canal, transferir 100 ul do fármaco que contém placa de 96 poços (passo 4.1) aos poços correspondentes da placa de infecção.
    5. Lugar em saco selado e incubar durante 3 dias a 37 ° C.

5. A quantificação da droga Eficácia Utilizando o Ensaio de Microtitulação Resazurina

  1. Prepare resazurina solução mãe a uma concentração final de 0,8 mg / ml em H 2 O. Filtra-se através de 0,22 um de tamanho dos poros da membrana de PVDF para a esterilização.
  2. Preparar solução de trabalho de resazurina por mistura de solução de resazurina, H2O e Tween-80 (solução a 20% em H2O) em uma proporção de 2: 1: 1. As concentrações finais são de 0,4 mg / mL de resazurina e 5% de Tween-80.
  3. Utilizando um leitor de placa, a instalação de um programa para ler a fluorescência a 530 nm de excitação e 590 nm de emissão a cada 30 min durante 24 h a 37 ° C. leitor de placas pré-quente a 37 ° C.
  4. Adiciona-se 20 uL de solução de trabalho de resazurina a todos os poços relevantes (B2 a G11) da placa de drogas tratada (passo 4.11) usando uma pipeta de multi-canal.
  5. Coloque placa no leitor de placa e iniciar o programa criado no passo 5.3.
    NOTA: Para facilitar o processamento de grandes volumes de placas de ensaio, que é suficiente para desenvolver o ensaio em uma incubadora a 37 ° C e realizar único fluorescência lê a cada 24 h. Isto também se aplica a usuários que não têm acesso a um leitor de placas com capacidades cinéticas e incubação.

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Resultados

Para confirmar a robustez de adaptar este modelo de infecção de 96 poços formato de placa, que aqui examinada a susceptibilidade fármaco de M. tuberculosis, derivado da 96-bem adaptado modelo de infecção à rifampicina (RIF) e moxifloxacina (moxi) de acordo com o modelo dado na figura 1A. Nós demonstramos que a geração do M. tuberculosis / macrófagos estruturas agregadas chave para este ensaio podem ser produzidos de forma fiável num formato de placa de ...

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Discussão

Aqui, nós descrevemos em detalhe um modelo de infecção por Mtb alternativa adequada para testes de eficácia da droga. Este modelo leva em conta dois fatores-chave que devem ser dadas mais consideração durante o processo de início de desenvolvimento TB: a presença de barreiras fisiologicamente relevantes para a penetração da droga e as alterações metabólicas de Mtb durante a infecção. Embora tenhamos mostrado previamente os benefícios do nosso modelo de infecção e propôs a possibilidade de expansão da i...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Frank Wolschendorf pelo acesso ao leitor automatizado de placas de imagem Cytation 3. Este trabalho foi financiado em parte pela concessão R01-AI104499 do NIH para OK. Partes do trabalho foram realizadas nas instalações do UAB CFAR e pelo UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, que são financiados pelo NIH/NIAID P30 AI027767 e pelo NIH 5P30 AR048311.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
7H9BD Difco271310Siga as recomendações do fabricante
Middlebrook OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT8761Prepare a solução estoque a 20% em H2O; filtre esterilizar
sal hemicálcico de ácido D-pantotênicoSigmaP5710Prepare a solução estoque de 24 mg/mL em H2O; esterilizar por filtro
L-leucinaMP Biomedicals194694Preparar solução estoque de 50 mg/mL em H2O; esterilizar por filtro
Higromicina BEMD Millipore400051Preparar solução estoque de 200 mg/mL em H2O
Frasco de mídia PETG quadradoNalgene Thermo Fisher2019-0030
RPMI 1640 mídiaHycloneSH30027.01
Soro FetalBovino Atlanta BiologicalsS12450H
L-glutaminaCorningMT25005CI
HEPESHycloneSH30237.01
Leitor de placas Cytation 3BiotekIntercambiável com qualquer leitor de placas fluorescente e microscópio
Software Gen5BiotekGravação e análise de rezasurin coversão
Rifampicina Fisher ScientificBP2679250Prepare 10 mg / mL de solução estoque em H2< / sub>O
Cloridrato de MoxifloxacinaAcros Organics457960010Prepare 10 mg / mL de solução estoque em H2< / sub>O
Resazurin Sodium SaltSigmaR7017Prepare 800 μ g/mL de solução-mãe em H2O; esterilizar por filtro
Tween-80Fisher ScientificT164500Preparar solução estoque a 20% em H2O; esterilizar por filtro

Referências

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