É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/55456

⸱

22 de março de 2017

 , 
1Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Resumo

A reprogramação direta de um tipo de célula em outro emergiu recentemente como um poderoso paradigma para medicina regenerativa, modelagem de doenças e especificação de linhagem. Em particular, a conversão de fibroblastos em miócitos induzidos semelhantes a cardiomiócitos (iCLMs) por Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5 (GHMT) representa uma via importante para a geração de miócitos cardíacos de novo in vitro e in vivo. Evidências recentes sugerem que o GHMT gera uma diversidade maior de subtipos cardíacos do que se pensava anteriormente, ressaltando assim a necessidade de uma abordagem sistemática para a realização de estudos adicionais. Antes que a reprogramação direta possa ser usada como estratégia terapêutica, no entanto, os fundamentos mecanicistas da conversão de linhagem devem ser compreendidos em detalhes para gerar subtipos cardíacos específicos. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para gerar iCLMs por reprogramação mediada por GHMT de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs).

Descrevemos métodos para isolamento de MEF, produção retroviral e infecção por MEF para realizar uma reprogramação eficiente. Para determinar a identidade do subtipo de células reprogramadas, detalhamos uma abordagem passo a passo para realizar imunocitoquímica em iCLMs usando um conjunto definido de anticorpos compatíveis. Métodos para microscopia confocal, identificação e quantificação de iCLMs e subtipos individuais de átrio (IAM), ventricular (iVM) e marcapasso (iPM) também são apresentados. Finalmente, discutimos resultados representativos de experimentos de reprogramação direta prototípica e destacamos aspectos técnicos importantes de nosso protocolo para garantir uma conversão de linhagem eficiente. Em conjunto, nosso protocolo otimizado deve fornecer uma abordagem gradual para os investigadores conduzirem experimentos significativos de reprogramação cardíaca que exijam a identificação de subtipos individuais de CM.

Introdução

O coração é o primeiro órgão funcional para desenvolver no embrião 1, 2. Em conjunto com o sistema circulatório, que fornece o oxigénio, nutrientes, e um mecanismo de eliminação de resíduos durante o desenvolvimento. Três semanas após a fertilização, o coração humano bate pela primeira vez e a sua regulação correcta é mantida por cardiomiócitos (CMS). A perda irreversível destas células especializadas é, por conseguinte, o problema fundamental subjacente a insuficiência cardíaca progressiva. Embora alguns organismos, tais como o peixe-zebra e Xenopus têm o potencial para a regeneração cardíaca, o coração de mamíferos adultos é mais limitada de 3, 5, 6. Assim, tendo em conta a função crítica do coração, não é surpreendente que a doença cardíaca é a causa principal de morte no mundo, sendo responsável por 600.000 mortes nos Estados Unidos sozinho 7. oguinte, terapias baseadas em células para reparar ou substituir o miocárdio lesado de forma eficiente são de grande interesse clínico.

O estudo seminal de Yamanaka e seus colegas 8 mostraram que a expressão forçada de quatro fatores de transcrição é suficiente para converter células de fibroblastos completamente diferenciadas para as células-tronco pluripotentes. No entanto, a capacidade tumorigénica de todas as estratégias de células estaminais pluripotentes tem sido uma preocupação crítica na sua utilização para fins terapêuticos. Isso motivou o campo científico para procurar métodos alternativos para transdiferenciam células, evitando um estágio pluripotente. Recentemente, vários grupos demonstraram a viabilidade desta estratégia, exibindo conversão directa de fibroblastos de rato para células de cardiomiócitos-like induzidas (iCLMs) com a expressão ectópica de fatores de transcrição GATA4, MEF2C, Tbx5, e mais tarde, HAND2 (GMT e GHMT , respectivamente) 9, 10. Furthermore, a mesma estratégia pode ser realizada in vivo e nos tecidos de origem humana-9, 11, 12. Estudos recentes puseram em evidência factores adicionais ou as vias de sinalização que pode ser modulada de modo a melhorar ainda mais a eficiência cardíaca reprogramação 13, 14, 15. Tomados em conjunto, estes estudos demonstram o potencial de transdiferenciação dirigido para terapias regenerativas. No entanto, a baixa eficiência de CM reprogramação, os mecanismos moleculares desconhecidos, reprodutibilidade inconsistente devido a diferenças metodológicas 16, e a heterogeneidade dos iCLMs permanecem sem solução.

A fim de avaliar diretamente iCLM heterogeneidade, foi elaborado um ensaio de uma única célula discreta e robusta para a identificação de desenvolvimento sarcomere e Specificatio linhagem cardíacaN-duas características necessárias de cardiomiócitos funcionais. Há pelo menos três tipos principais de CM no coração tal como definido pela sua localização e propriedades elétricas únicas: atrial (AM), ventricular (VM) e pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. Numa combinação orquestrada, eles permitem que a bombagem de sangue adequado. Durante a lesão cardíaca, um ou todos os subtipos pode ser afectada, e o tipo de terapia com células teriam de ser dirigida numa base de caso-a-caso. Atualmente, a maioria das estratégias de focar a geração global de cardiomiócitos, enquanto pouco trabalho está sendo feito para estudar os mecanismos moleculares que regulam a especificação subtipo.

Detalhes do estudo seguinte como quantificar adequadamente sarcômeros bem organizadas e identificar um conjunto diversificado de subtipos de cardiomiócitos. Usando um pacemaker (PM) do mouse repórter -específica, somos capazes de aplicar um iabordagem mmunocytochemical distinguir miócitos atriais induzidas-like (IAM), miócitos ventriculares induzidas-like (MIV), e induzidas miócitos PM-like (IPMS) 21. Com base em nossas observações, apenas as células que exibem organização sarcomere são capazes de batimento espontâneo. Esta plataforma reprogramação exclusivo permite avaliar o papel de determinados parâmetros na organização do sarcômero, especificação subtipo, e a eficiência da reprogramação CM na resolução de uma única célula.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais envolvendo práticas animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da UT Southwestern Medical Center.

1. Isolamento de Hcn4-GFP E12.5 rato embrionário de fibroblastos (MEFs)

  1. Configurar acasalamentos cronometrados entre homozigotos machos Hcn4-GFP e CD-1 fêmeas.
  2. Sacrificar fêmea grávida em E12.5 por eutanásia dióxido de carbono e subsequente deslocamento cervical.
    1. Remover cornos uterinos com uma pinça de dissecação como descrito anteriormente 22, 23, e colocá-los em uma placa de Petri sobre gelo com uma solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) sem Ca2 + ou Mg2 +.
  3. Execute todas as etapas posteriores na capa de cultura de tecido, utilizando uma técnica estéril.
    1. Retire os embriões do útero e saco amniótico com uma tesoura e dissecando fórceps. Mantenha a placenta anexado para melhor manuseio. pregnant CD-1 fêmeas geralmente dão à luz entre 10 e 14 filhotes.
    2. Usando dissecando uma pinça, levar os embriões isolados e rapidamente lavá-los duas vezes em 70% (v / v) EtOH.
      NOTA: As lavagens deve ser rápido para minimizar a morte celular.
    3. Retire a cabeça, membros, cauda e órgãos internos, incluindo o coração dos embriões isolados.
    4. Colocar o tecido restante em um prato de 10 cm com 1 mL de PBS 1x e tritura finamente com uma lâmina de barbear esterilizada para aproximadamente 1 mm 3 de tamanho.
    5. Transferir tecido moído para um tubo cónico de 50 ml com PBS.
    6. Girar a 300 xg por 3 min. Aspirar cuidadosamente o excesso de PBS.
    7. Adicionar 1 ml de estéril 0,25% de tripsina-EDTA por embrião. Incubar as células em um banho de água a 37 ° C durante 15 min. Misture delicadamente o tubo a cada 4 min. Sobre-digestão do tecido irá diminuir significativamente o rendimento.
    8. mistura de células Vortex à velocidade máxima (3.200 rpm) durante 4 s.
    9. Adicione 2 ml de meio de fibroblastos por embrião e misture. filtro ttravés de um filtro celular de 100 um, utilizando uma pipeta para auxiliar as células através do filtro. Consultar a Tabela 1 para a formulação de todos os meios subsequentes.
    10. Giram a 300 g durante 4 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante.
    11. Adicionar 10 ml de meio de fibroblastos fresca por 3 embriões e triturar 6-10 vezes.
    12. Placa as células em 1 15 cm prato de cultura de tecidos para cada 3 embriões preparados. Durante a noite em cultura a 37 ° C, 5% de CO2.
    13. Após a incubação durante a noite, substituir a mídia com frescos 30 mL de mídia por placa. Colocar as células de volta na incubadora durante a noite.
      NOTA: Verifique se há Hcn4-GFP + contaminação de células sob um microscópio fluorescente. A cultura deve ser GFP - e só se tornam GFP + sobre a reprogramação.
    14. No dia seguinte, as células de colheita com 3 ml de fresco pré-aquecido 0,25% de tripsina-EDTA. Contagem e congelar células. Tipicamente, congelar as células a 3 x 10 6 culas por ml. O Yie esperadoLD deve ser de 3 x 10 6 células por embrião.

2. Retrovirus Produção e Reprogramação

Atenção: O protocolo seguinte exige a produção e manipulação de retrovírus infecciosos. Execute as seguintes etapas em um armário de Biossegurança Nível 2, sob BSL-2 orientações e técnica estéril. Use 10% de alvejante de dispor de todos os materiais expostos ao retrovírus.

  1. Produção de retrovírus e preparação MEFs
    NOTA: O protocolo seguinte é para a produção retroviral em placas de 6 poços e MEF infecção em placas de 24 poços. Para outros formatos, consulte a Tabela 2. MEFs são banhados no dia -1, então o tempo terá de ser coordenado de forma adequada para cada experimento (Consulte a seção 2.3 e Figura 2).
    1. Manter as células como as recomendações do fabricante Plat-E (PE). Resumidamente, as células de cultura de PE em DMEM suplementado com 10% de FBS, 1 ug / mL puromyCIN, 10 ug / ml de blasticidina, penicilina e estreptomicina. células de passagem 1: 4 a cada dois dias quando a cultura atinge 70-90% de confluência.
    2. Dia -2: No dia antes da transfecção, as células semente Plat-E a 1 x 10 6 células / poço numa placa de 6 poços em meio de transfecção. As células devem ser de 70-80% confluentes no momento da transfecção.
  2. A transfecção utilizando um agente de transfecção comercial.
    NOTA: Os reagentes comerciais devem estar à temperatura ambiente (TA) antes da transfecção. Para a transfecção de ADN, adicionar cada ADN plasmídico retroviral individualmente (G, H, H, e T), para formar um cocktail GHMT 9.
    1. Dia -1: Em um tubo de poliestireno de 15 mL cónico, misturar 60 mL de meio de soro reduzido com 6 mL de reagente de transfecção por reacção de um formato de placa de 6 poços. Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente.
      Observação: Uma vez que o reagente de transfecção utilizado aqui se liga aos plásticos, umadd directamente para o meio de soro reduzido para evitar qualquer diminuição da eficiência de transfecção.
    2. Adicionar um total de 2 mg de GHMT cocktail por reação e bata suavemente para misturar. não vortex. Incubar a reacção durante 15 min à TA.
    3. Adicionar a mistura do passo 2.2.3 às células PE de forma sensata gota.
    4. Incubar as células Plat-E transfectadas durante a noite num banho a 37 ° C, 5% de CO2. Anote o tempo de transfecção.
  3. Semeadura de rato Hcn4-GFP fibroblastos embrionárias.
    1. 1 h antes do plaqueamento MEFs, preparar uma placa de 24 poços para imunocitoquímica.
      1. Adicionar uma lamela fibronectina 12 mm por bem.
      2. Poços revestimento com 300 uL de solução de colagénio bovino (por exemplo, surecoat) e incuba-se num banho a 37 ° C incubadora durante 1 h.
      3. solução de revestimento aspirado imediatamente antes do plaqueamento MEF.
    2. Descongelar uma ampola congelada de Hcn4-GFP MEFs e lavar com x1 fibrobl pré-aquecidomeios AST a 500 xg durante 5 min.
    3. Determinar a viabilidade celular utilizando a exclusão de azul de tripano ou corantes semelhantes. Calcular o número de células viáveis ​​por ml de cultura, utilizando a seguinte fórmula:
      % de células viáveis ​​= [1,00 - (número de células azuis / número total de células)] x 100
      1. Calcular o número total de células viáveis ​​utilizando a seguinte fórmula:
        As células viáveis ​​=% de células viáveis ​​x factor de diluição x 10.000 x volume total de suspensão de células
    4. Seed 3 x 10 4 culas por po para uma placa de 24 poços com colagénio bovino lamela solução de fibronectina previamente preparada.
  4. Transdução e reprogramação de MEFs
    NOTA: De acordo com as notas do fabricante, devidamente mantido células Plat-E produzir um título médio de 1 x 10 7 unidades de infecção / mL. Embora a título não é directamente medido para cada experiência, um controlo de GFP é sempre incluído como um substituto para a eficiência de infecção.Expressão GFP e alta intensidade (GFP +> 95%) está correlacionado com geração tipicamente mediada por GHMT bem sucedida de iCLMs.
    1. Dia 0: 24 h pós-transfecção, filtrar a forma retroviral PE através de um tamanho de poro uM-filtro de acetato de celulose sem agente tensioactivo 0,45 e transferir para um tubo cónico de 15 mL. Adicionar polibreno a uma concentração final de 8 ug / mL. Cuidadosamente repor as células com 2 ml de meio de transfecção fresco.
      NOTA: As células facilmente separar da placa se a mídia é alterado muito rapidamente.
    2. Aspirar o meio dos MEFs cultivadas e adicionar o meio retroviral recentemente colhido; deve proporcionar 1,7 mL de meio por poço de uma placa de 6 poços. Adicionar ~ 800 uL por poço de uma placa de 24 poços. Retorno placa MEF para a incubadora e incubar durante a noite.
    3. Dia 1: Repita os passos 2.4.1 e 2.4.2. Descarte células após a colecção de vírus da 2ª. Voltar MEFs infectados para a incubadora e deixá-los descansar durante a noite.
    4. Dia 2: 48 h pós-indução, aspirar a célula condicionado mídia e lavagem x1 com 1x PBS. Adicionar 500 ul meios iCLM pré-aquecido por poço de uma placa de 24 poços.
    5. Substituir mídia iCLM cada 2 - 3 dias. placa processo de 14 dias após a indução viral para imunocitoquímica análise (ICC) de reprogramação cardíaca.

3. A imunocoloração de MEFs reprogramado

  1. 14 dias pós-indução, aspirar cuidadosamente a mídia.
  2. Lavar cada poço com 300 mL de gelo-frio 1x PBS. Aspirar o excesso de solução.
  3. Fixar as células com 250 uL de solução de paraformaldeído a 4% (PFA) por poço de uma placa de 24 poços. Incubar 15 min a RT.
    NOTA: Fixa células podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C durante 1 - 2 semanas antes da coloração.
  4. permeabilizar células por Wells lavar 3x com 300 uL de 0,1% Triton X-100 de PBS (PBST). Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Aspirar o excesso de solução após a última lavagem.
  5. Bloco para 10min à temperatura ambiente com tampão de bloqueio universal 1x a 300 uL / ​​poço.
  6. Prepare tampão de coloração (ICC): Adicione 1: 1 de PBS 1x e 1x Universal tampão de bloqueio. Dilui-se os anticorpos primários em tampão de coloração ICC e incubar anticorpos durante a noite a 4 ° C. Consulte a seção de material para diluições recomendadas.
    1. Manchar um par de lâminas com α-actinina rato, αGFP frango e coelho NPPA para IPM e identificação IAM.
    2. Manchar um par de lâminas com rato α-actinina, αGFP frango, e Myl2 coelho para IPM e IVM identificação.
  7. No dia seguinte, lave poços x3 com 300 mL de 0,1% PBST. Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Aspirar o excesso de solução após a última lavagem.
  8. Preparar as diluições de anticorpo secundário em tampão de coloração ICC. Consulte a seção de material para diluições recomendadas. Incubar anticorpos secundários 1 h à temperatura ambiente, protegida da luz.
    1. Manchar todos os slides com o antibodie secundária seguintes: Rato Alexa-555, frango Alexa-488, e coelho Alexa-647.
  9. Lave poços x3 com 300 mL de 0,1% PBST. Incubar 5 min à temperatura ambiente entre lavagens. Proteger da luz.
  10. Adicionar 2,4 mL de meio de montagem contendo 1,5 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para uma lâmina de microscópio de vidro. Remova cuidadosamente a lamela do poço da placa de 24 poços, remover o excesso de solução e transferir para a lâmina de vidro com meios de montagem. Pressione suavemente a lamela para remover o excesso de volume e ar.
  11. lâminas de vedação com unha polonês preferencial ou selante plástico. Loja montadas lâminas a 4 ° C protegidos da luz.

4. Identificação do cardíacos subtipos Usando Microscopia Confocal

NOTA: Para imagens, um microscópio confocal equipado com pelo menos 2 detectores fluorescentes capazes de detecção espectral a 405, 488, 555, e 639 nm comprimento de onda é necessário, a fim de identificar IPMS, IAM, e iVMS. imagcélulas e usando um plano-Apochromat 20X / 0,75 objetiva ou melhor. Usando o software de análise de imagem do fabricante, a digitalização de imagens de zoom pode conseguir imagens de qualidade de imersão 40X de óleo.

  1. biblioteca de imagens: tome imagens de 8 bits com DAPI, Alexa-488, Alexa-555 e Alexa-647 canais (cap.). Pixel tempo de permanência de 6 s, 1024 tamanho do quadro, passo linha no 2, e média de 2 é suficiente para imagens de alta resolução.
  2. Para cada slide, começar a partir de uma extremidade e começar a digitalizar cima e para baixo no canal fluorescente vermelha (cap.) Para sarcômero + células α-actinina + (Consulte a Figura 3 e Figura 5A para exemplos). estrias sarcômero são mais fáceis de identificar visualmente no comprimento de onda 555 nm.
    1. Uma vez que um sarcômero + células α-actinina + foi identificado, mudar para o ch verde. e manter a nota se for positivo (IPM). Mudar para o computador para avaliar a vermelho-distante 647 ch. (IAM ou MIV).
      NOTA: As células que sãoα-actinina + / + sarcômero / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - são designados como IPMS. Expressão da GFP será visto ao longo da célula (Figura 4A).
    2. lâminas mancha com α-actinina (mouse-Alexa555), Hcn4-GFP (frango-Alexa488), NPPA (coelho-Alexa647) e DAPI. Células que são α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / + NPPA são IAM. NPPA coloração aparece perinuclear e pontuada (Figura 4B).
    3. lâminas mancha com α-actinina (mouse-Alexa555), Hcn4-GFP (frango-Alexa488), Myl2 (coelho-Alexa647). Células positivas para α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / + Myl2 são iVMS. Myl2 coloração irá apresentar uma forma estriado ao longo do filamento sarcômero. Devido a variações na qualidade da coloração e o plano z, estrias podem nem sempre ser facilmente visível (Figura 4C).

5. quantificação

NOTA: De modo a avaliar o número real de MEFs potencialmente reprogramadas, 2 poços de uma placa de 24 cavidades são semeadas em paralelo aos poços experimentais e são colhidas um dia após o plaqueamento. O número total de células plaqueadas é então determinada através da média das duas cavidades. Isto torna-se total de células reais banhados (atotal).

  1. sarcômero +
    1. Inspecionar visualmente cada célula em uma lamela para o bom α-actinina + / sarcômero + (painéis da direita Figura 3) e registro (Figura 5B-I).
    2. Tabular o número total de α-actinina + / + sarcômero em cada lamela e dividir pelo número total de células plaqueadas reais (atotal) (Figura 5B-III). Por exemplo, se atotal = 12.500 células, e células 100 foram a-Actinina + / + sarcômero então, 0,8% de as MEFs plaqueadas foram reprogramadas. Uma médiareprogramação experiência renderá 1% de a-actinina + / sarcômero células + (Figura 5C).
  2. subtipo +
    NOTA: Para os passos seguintes, consulte a Figura 5B / C para um fluxo de trabalho iCLM quantificação representativa. Resumidamente, para cada célula sarcómero +, tabular se que é único para qualquer subtipo (Figura 5B-I). Calcular a% de subtipo (Figura 5B-III), dividindo o número de células ao longo do subtipo + sarcómero média + x 100 células (Figura 5B-I). Para calcular a% de eficiência absoluta subtipo (Figura 5B-IV), dividir o número subtipo + célula a partir da Figura 5B-I pelo número total de células semeadas x 100 (Figura 5B-II).
    1. Para cada uma das células α-actinina + / + sarcômero, avaliar se eles são GFP +, + NPPA, ou Myl2 +.
    2. Tabular número total de α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / NPPA +, e α-actinina + / sarcômero + / Hnc4-GFP - / + Myl2 células (Figura 5B-i).
    3. Para calcular a percentagem de cada subtipo, divida o número de células Subtipo + pelo número total de α-actinina + / sarcômero + células em que bem e multiplicar por 100. GHMT gera IPMS, Iams, e iVMS proporções mais ou menos iguais (Figura 5B-III).
    4. Para calcular o número absoluto de células subtipo +, dividir o número total de células subtipo + para a condição experimental por atotal e multiplicar por 100 (Figura 5B-II). Em IPMS médios representam 0,3% da população total de células infectadas, IAM 0,3%, eiVMS 0,25% (Figura 5B-IV).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Tomando vantagem do rato repórter específica do PM, que desenvolveu uma estratégia para identificar imunocoloração multiplex diversas miócitos endógenos, como representado na Figura 1. Após os passos de reprogramação mostrados na Figura 2, a indução de MC específicos do subtipo pode ser detectada tão cedo como o dia 4 21, se bem que a uma velocidade baixa. Ao dia 14, o experimento pode ser interrompido e avaliadas para a organizaç...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

O presente estudo fornece uma estratégia de reprogramação direta para a conversão de MEFs em um conjunto diversificado de subtipos cardíacas via expressão mediada por retrovírus da transcrição cardíaca fatores GATA4, MEF2C, Tbx5 e HAND2 (GHMT). Usando uma abordagem imunocoloração multiplex em combinação com um rato repórter específica do PM, somos capazes de identificar IAM, iVMS e IPMS em resolução de uma única célula. Um tal ensaio permite uma experimental sistema in vitro capaz de isolar as contribuições de ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

A.F.-P. foi apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship sob o Grant No.2015165336. A N.V.M foi apoiada por doações do NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838) e March of Dimes (# 5-FY14-203). Agradecemos a Young-Jae Nam, Christina Lubczyk e Minoti Bhakta por suas importantes contribuições para o desenvolvimento de protocolos e análise de dados. Também agradecemos a John Shelton pela valiosa contribuição técnica e aos membros do laboratório Munshi pela discussão científica.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMSigmaD5796Componente do meio iCLM, meio Plat-E, fibroblastos e meios de transfecção
199Thermo Fisher Scientific11150059Componente do meio iCLM
Serrum fetal bovino (FBS)SigmaF2442Componente do meio iCLM, meio Plat-E, fibroblastos e meios de transfecção
Insulina-Transferrina-Selênio GThermo Fisher Scientific41400-045Componente do meio iCLM Solução de
vitamina MEMThermo Fisher Scientific11120-052Componente do meio iCLM
Aminoácidos MEMThermo Fisher Scientific1601149Componente do meio iCLM
Aminoácidos não essenciaisThermo Fisher Scientific11140-050Componente do meio iCLM
Antibiótico-AntimicóticosThermo Fisher Componentede 15240062do suplemento de mídia iCLM
B-27Thermo Fisher Scientific17504044Componente de mídia iCLM
Soro de cavalo inativado por calorThermo Fisher Scientific26050-088Componente de mídia iCLM
NaPyruvateThermo Fisher Scientific11360-70Componente de mídia iCLM
Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific1514022Componente de mídia Plat-E e mídia de fibroblastos
Puromycin Thermo Fisher ScientificA11139-03Componente da mídia Plat-E
Blasticidin   Gemini Bio-Products400-128PComponente do meio Plat-E
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Componente do meio de fibroblastos
Varredura a laser confocal LSM700ZeissPara análise confocal
Reagente de transfecção FuGENE 6PromegaE2692Reagente de transfecção 
Opti-MEM Soro Reduzido MédioThermo Fisher Scientific31985-070Reagente de transfecção 
PolybreneMilliporeTR-1003-GReagente de indução. Use em uma concentração final de 8 μ Linha
celular retroviral Packagin M / mL Platinium-E (PE), EcotropicCellBiolabsRV-101Linha celular de embalagem retroviral
Tripsina 0,25% EDTAThermo Fisher Scientificpara MEFs e dissociação Plat-E
Anti &alfa;-Actinina de camundongo (Clone EA-53)Anticorpo SigmaA7811para análise confocal. Use a 1:200
Anticorpo anti-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262para análise confocal. Use a 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA Anticorpo AP8534A Abgentpara análise confocal. Use a 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG ProteinTech10906-1-APAnticorpo para análise confocal. Use a 1:200
Solução Vectashield com DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)Vector LabsH-1500Corante para análise confocal
Superfrost Plus Lâminas de microscópio ThermoFisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectina 12 mm lamínulasNeuVitro CorpGG-12-1.5Lamínulas para análise confocal
100 μ filtro de células mThermo Fisher Scientific08-771-19
0.45 μ m Seringas filtros SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106Para filtração de vírus
6 mL SeringasCovidien8881516937Para filtração de vírus
Cabra anti-Frango IgY (H & L) A488AbcamAB150169Anticorpo secundário para análise confocal. Use a 1:400
Burro anti-coelho A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Anticorpo secundário para análise confocal. Use a 1:400
IgG(H+L) anti-camundongo de cabra A555Thermo Fisher ScientificA21422Anticorpo secundário para análise confocal. Use a 1:400
Triton X-100Sigma93443-100mlPara permeabilização celular 
PBS da Dulbecco sem CaCl2 e MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
10x Reagente de Bloqueio UniversalThermo Fisher ScientificNC9495720Diluir para 1x em H2O
16% Solução aquosa de paraformaldeído (PFA)Ciências daMicroscopia Eletroscopia 15710Use a 4% diluído em placas de dH2O
6 cm Placas de 6 poçosOlympus25-260
Placas de 6 poçosGenesee Scientific25-105
Placas de 24 poçosGenesee Scientific25-107
Placas de cultura de tecidos de 10 cmCorning4239
Placas de 15 cm Placas de cultura de tecidosThermo Fisher Scientific5442
Tubos cônicos de 15 mLCorning4308
Tubos cônicos de 50 mLCorning4249
Solução de azul de tripano a 0,4%SigmaT8154Para viabilidade
Álcool etílico 200 provaThermo Fisher Scientific7005
BleachThermo Fisher Científico6009
Científico Bloco de Potência de

Referências

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231(2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243(2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137(2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807(2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Reprograma o DiretaReprograma o GHMTCardiomi citos InduzidosImunocitoqu micaMicroscopia ConfocalOrganiza o do Sarc meroEspecifica o de SubtipoTransdu o Retroviral
Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.