Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo passo a passo para a geração e quantificação de diversos subtipos cardíacos reprogramados usando uma entrega mediada por retrovírus de Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Abstract

A reprogramação direta de um tipo de célula em outro emergiu recentemente como um poderoso paradigma para medicina regenerativa, modelagem de doenças e especificação de linhagem. Em particular, a conversão de fibroblastos em miócitos induzidos semelhantes a cardiomiócitos (iCLMs) por Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5 (GHMT) representa uma via importante para a geração de miócitos cardíacos de novo in vitro e in vivo. Evidências recentes sugerem que o GHMT gera uma diversidade maior de subtipos cardíacos do que se pensava anteriormente, ressaltando assim a necessidade de uma abordagem sistemática para a realização de estudos adicionais. Antes que a reprogramação direta possa ser usada como estratégia terapêutica, no entanto, os fundamentos mecanicistas da conversão de linhagem devem ser compreendidos em detalhes para gerar subtipos cardíacos específicos. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para gerar iCLMs por reprogramação mediada por GHMT de fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs).

Descrevemos métodos para isolamento de MEF, produção retroviral e infecção por MEF para realizar uma reprogramação eficiente. Para determinar a identidade do subtipo de células reprogramadas, detalhamos uma abordagem passo a passo para realizar imunocitoquímica em iCLMs usando um conjunto definido de anticorpos compatíveis. Métodos para microscopia confocal, identificação e quantificação de iCLMs e subtipos individuais de átrio (IAM), ventricular (iVM) e marcapasso (iPM) também são apresentados. Finalmente, discutimos resultados representativos de experimentos de reprogramação direta prototípica e destacamos aspectos técnicos importantes de nosso protocolo para garantir uma conversão de linhagem eficiente. Em conjunto, nosso protocolo otimizado deve fornecer uma abordagem gradual para os investigadores conduzirem experimentos significativos de reprogramação cardíaca que exijam a identificação de subtipos individuais de CM.

Introduction

O coração é o primeiro órgão funcional para desenvolver no embrião ^{1, 2.} Em conjunto com o sistema circulatório, que fornece o oxigénio, nutrientes, e um mecanismo de eliminação de resíduos durante o desenvolvimento. Três semanas após a fertilização, o coração humano bate pela primeira vez e a sua regulação correcta é mantida por cardiomiócitos (CMS). A perda irreversível destas células especializadas é, por conseguinte, o problema fundamental subjacente a insuficiência cardíaca progressiva. Embora alguns organismos, tais como o peixe-zebra e Xenopus têm o potencial para a regeneração cardíaca, o coração de m....

Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo práticas animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da UT Southwestern Medical Center.

1. Isolamento de Hcn4-GFP E12.5 rato embrionário de fibroblastos (MEFs)

1. Configurar acasalamentos cronometrados entre homozigotos machos Hcn4-GFP e CD-1 fêmeas.
2. Sacrificar fêmea grávida em E12.5 por eutanásia dióxido de carbono e subsequente deslocamento cervical.
   1. Remover cornos uterinos com uma pinça de dissecação como descrito anteriormente ^{22, 23,} e colocá-los em uma placa de Petri sobre g....

Results

Tomando vantagem do rato repórter específica do PM, que desenvolveu uma estratégia para identificar imunocoloração multiplex diversas miócitos endógenos, como representado na Figura 1. Após os passos de reprogramação mostrados na Figura 2, a indução de MC específicos do subtipo pode ser detectada tão cedo como o dia 4 ^21, se bem que a uma velocidade baixa. Ao dia 14, o experimento pode ser interrompido e avaliadas para a organizaç.......

Discussion

O presente estudo fornece uma estratégia de reprogramação direta para a conversão de MEFs em um conjunto diversificado de subtipos cardíacas via expressão mediada por retrovírus da transcrição cardíaca fatores GATA4, MEF2C, Tbx5 e HAND2 (GHMT). Usando uma abordagem imunocoloração multiplex em combinação com um rato repórter específica do PM, somos capazes de identificar IAM, iVMS e IPMS em resolução de uma única célula. Um tal ensaio permite uma experimental sistema in vitro capaz de isolar as contribuições de .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D5796	Componente do meio iCLM, meio Plat-E, fibroblastos e meios de transfecção
199	Thermo Fisher Scientific	11150059	Componente do meio iCLM
Serrum fetal bovino (FBS)	Sigma	F2442	Componente do meio iCLM, meio Plat-E, fibroblastos e meios de transfecção
Insulina-Transferrina-Selênio G	Thermo Fisher Scientific	41400-045	Componente do meio iCLM Solução de
vitamina MEM	Thermo Fisher Scientific	11120-052	Componente do meio iCLM
Aminoácidos MEM	Thermo Fisher Scientific	1601149	Componente do meio iCLM
Aminoácidos não essenciais	Thermo Fisher Scientific	11140-050	Componente do meio iCLM
Antibiótico-Antimicóticos	Thermo Fisher Componente	de 15240062	do suplemento de mídia iCLM
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504044	Componente de mídia iCLM
Soro de cavalo inativado por calor	Thermo Fisher Scientific	26050-088	Componente de mídia iCLM
NaPyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-70	Componente de mídia iCLM
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	1514022	Componente de mídia Plat-E e mídia de fibroblastos
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A11139-03	Componente da mídia Plat-E
Blasticidin	Gemini Bio-Products	400-128P	Componente do meio Plat-E
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Componente do meio de fibroblastos
Varredura a laser confocal LSM700	Zeiss		Para análise confocal
Reagente de transfecção FuGENE 6	Promega	E2692	Reagente de transfecção
Opti-MEM Soro Reduzido Médio	Thermo Fisher Scientific	31985-070	Reagente de transfecção
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Reagente de indução. Use em uma concentração final de 8 μ Linha
celular retroviral Packagin M / mL Platinium-E (PE), Ecotropic	CellBiolabs	RV-101	Linha celular de embalagem retroviral
Tripsina 0,25% EDTA	Thermo Fisher Scientific		para MEFs e dissociação Plat-E
Anti &alfa;-Actinina de camundongo (Clone EA-53)	Anticorpo Sigma	A7811	para análise confocal. Use a 1:200
Anticorpo anti-GFP IgY	Thermo Fisher Scientific	A10262	para análise confocal. Use a 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA	Anticorpo AP8534A Abgent		para análise confocal. Use a 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG	ProteinTech	10906-1-AP	Anticorpo para análise confocal. Use a 1:200
Solução Vectashield com DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)	Vector Labs	H-1500	Corante para análise confocal
Superfrost Plus Lâminas de microscópio Thermo	Fisher Scientific	12-550-15	25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectina 12 mm lamínulas	NeuVitro Corp	GG-12-1.5	Lamínulas para análise confocal
100 μ filtro de células m	Thermo Fisher Scientific	08-771-19
0.45 μ m Seringas filtros SFCA 25MM	Thermo Fisher Scientific	09-740-106	Para filtração de vírus
6 mL Seringas	Covidien	8881516937	Para filtração de vírus
Cabra anti-Frango IgY (H & L) A488	Abcam	AB150169	Anticorpo secundário para análise confocal. Use a 1:400
Burro anti-coelho A647 IgG(H+L)	Thermo Fisher Scientific	A31573	Anticorpo secundário para análise confocal. Use a 1:400
IgG(H+L) anti-camundongo de cabra A555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Anticorpo secundário para análise confocal. Use a 1:400
Triton X-100	Sigma	93443-100ml	Para permeabilização celular
PBS da Dulbecco sem CaCl2 e MgCl2 (D-PBS)	Sigma	D8537
10x Reagente de Bloqueio Universal	Thermo Fisher Scientific	NC9495720	Diluir para 1x em H2O
16% Solução aquosa de paraformaldeído (PFA)Ciências da	Microscopia Eletroscopia	15710	Use a 4% diluído em placas de dH2O
6 cm Placas de 6 poços	Olympus	25-260
Placas de 6 poços	Genesee Scientific	25-105
Placas de 24 poços	Genesee Scientific	25-107
Placas de cultura de tecidos de 10 cm	Corning	4239
Placas de 15 cm Placas de cultura de tecidos	Thermo Fisher Scientific	5442
Tubos cônicos de 15 mL	Corning	4308
Tubos cônicos de 50 mL	Corning	4249
Solução de azul de tripano a 0,4%	Sigma	T8154	Para viabilidade
Álcool etílico 200 prova	Thermo Fisher Scientific	7005
Bleach	Thermo Fisher Científico	6009