Aqui, relatamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado que produz peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza, capazes de formação de oligômeros. A beta-amiloide é um peptídeo hidrofóbico altamente propenso a agregação implicado na doença de Alzheimer. A natureza amiloidogênica do peptídeo torna sua purificação um desafio.
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Artigo de método
A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Olig�ero
Neste artigo
Resumo
Resumo
Peptídeos amiloidogênicos, como o beta amilóide (Aβ) implicado na doença de Alzheimer, podem apresentar um desafio significativo ao tentar obter material de alta pureza. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado para produzir peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza. Descobrimos que a combinação de fase estacionária hidrofóbica de poli(estireno/divinilbenzeno) disponível comercialmente, fase reversa de laboratório de polímeros - estirenodivinilbenzeno (PLRP-S) sob condições de pH alto, permite a obtenção de Aβ42 de alta pureza (>95%) em uma única corrida cromatográfica. A purificação é altamente reprodutível e pode ser alterada para condições semipreparativas e analíticas, dependendo da quantidade de material que se deseja purificar. O protocolo também pode ser aplicado ao peptídeo Aβ40 com idêntico sucesso e sem a necessidade de alterar o método.
Introdução
A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que os efeitos de mais de 35 milhões de pessoas em todo o mundo. 1 Implicado fortemente no início e desenvolvimento da doença, é altamente propensos a agregação, peptídeo hidrofóbico beta-amilóide (Ap). Ap 2 varia de 36 a 43 aminoácidos de comprimento, no entanto, pensa-se que o 42-amino ácido variante, beta amilóide 42 (Aβ42), é a forma mais tóxica da proteína. 3 Isto é devido em grande parte à capacidade de Aβ42 para formar prontamente difus�eis, espécies oligoméricas que se acredita ser entidades particularmente neurotóxicos.
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Protocolo
1. Purificação por HPLC Preparativa do Peptídeo Aβ40 ou Aβ42
- Prepare os seguintes tampões para a purificação por CLAE.
- Prepare o tampão A (20 mM NH4OH) adicionando 1,3 mL de NH4OH (solução a 28%) a 1.000 mL de água ultrapura.
- Prepare o tampão B (80% de acetonitrila com 20 mM NH4OH) adicionando 1,3 mL de NH4OH (solução a 28%) a uma solução contendo 800 mL de acetonitrila grau CLAE e 200 mL de água ultrapura.
- Prepare o tampão de dissolução da amostra (0,1% de NH4OH) adicionando 100 µL de NH4OH (solução a 28%) a 100 mL de água ultrapura. ....
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Resultados
A purificação do peptídeo Aβ42 utilizando uma combinação da fase estacionária PLRP-S e uma fase móvel de pH elevado resulta na formação de um pico nítido e bem resolvido para o peptídeo Aβ em um tempo de retenção entre 72 e 74 minFigura 2C). A confirmação da identidade do pico é realizada por espectrometria de massas com injeção direta do eluente coletado. O eluente pode ser armazenado a -20 °C em solução por até 12 h. Períodos mais longos de armazenamento podem resultar .......
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Discussão
A purificação por HPLC do peptídeo Aβ é altamente dependente da escolha da fase estacionária empregada na purificação e da fase móvel escolhida para eluir o peptídeo. O baixo ponto isoelétrico do peptídeo e a alta propensão à agregação tornam desafiadoras as condições cromatográficas tradicionais para a separação de proteínas hidrofóbicas (fase estacionária C4 ou C8 acoplada a um eluente móvel ácido), com o peptídeo Aβ eluindo como um pico amplo e não resolvido prolongado (Figura 2A).
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à Agilent por sua assistência técnica. Kate Markham e Rafael Palomino são creditados por sua ajuda inicial na síntese e purificação do peptídeo Aβ e o Dr. Hsiau-Wei Lee é agradecido por sua ajuda na preparação da Figura 1 do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bomba quaternária Agilent 1260 Infinity II | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Detector de comprimento de onda variável duplo | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Injetor Manual Agilent 1260 Infinity II equipado com loop de amostra de aço inoxidável de 10 mL | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Injetor Manual Agilent 1260 Infinity II equipado com 20 µ L laço de amostra de aço inoxidável | Agilent | G1328C | Suporte de montagem de http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| anel | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 5 µ m 4,6 x 250 mm (Analítico) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ 42 ou Aβ 40 peptídeos | Sintetizado internamente usando um sintetizador de peptídeos automatizado CEM liberty. | ||
| Hidróxido de Amônio (NH4OH, solução a 28%) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrila | Fisher Scientific | A998-4 | |
| centrífuga cônico Falcon de 50 mL | Scientific | Fisher Scientific 14-954-49A | |
| Sigma-Aldrich | Z227250 | ||
| Normject 5 seringa estéril do CC | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 calibre SS agulha | Rheodyne | 3725-086 |
Referências
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer's disease....
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Reimpressões e permissões
