Aqui, relatamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado que produz peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza, capazes de formação de oligômeros. A beta-amiloide é um peptídeo hidrofóbico altamente propenso a agregação implicado na doença de Alzheimer. A natureza amiloidogênica do peptídeo torna sua purificação um desafio.
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Artigo de método
A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Olig�ero
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Resumo
Resumo
Peptídeos amiloidogênicos, como o beta amilóide (Aβ) implicado na doença de Alzheimer, podem apresentar um desafio significativo ao tentar obter material de alta pureza. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado para produzir peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza. Descobrimos que a combinação de fase estacionária hidrofóbica de poli(estireno/divinilbenzeno) disponível comercialmente, fase reversa de laboratório de polímeros - estirenodivinilbenzeno (PLRP-S) sob condições de pH alto, permite a obtenção de Aβ42 de alta pureza (>95%) em uma única corrida cromatográfica. A purificação é altamente reprodutível e pode ser alterada para condições semipreparativas e analíticas, dependendo da quantidade de material que se deseja purificar. O protocolo também pode ser aplicado ao peptídeo Aβ40 com idêntico sucesso e sem a necessidade de alterar o método.
Introdução
A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que os efeitos de mais de 35 milhões de pessoas em todo o mundo. 1 Implicado fortemente no início e desenvolvimento da doença, é altamente propensos a agregação, peptídeo hidrofóbico beta-amilóide (Ap). Ap 2 varia de 36 a 43 aminoácidos de comprimento, no entanto, pensa-se que o 42-amino ácido variante, beta amilóide 42 (Aβ42), é a forma mais tóxica da proteína. 3 Isto é devido em grande parte à capacidade de Aβ42 para formar prontamente difus�eis, espécies oligoméricas que se acredita ser entidades particularmente neurotóxicos. 4 A fim de promover nossa compreensão do peptídeo Aâ, é essencial para obter rotineiramente material de alta pureza. A presença de vestígios de impurezas foi mostrado para alterar drasticamente as propriedades de agregação propensão do péptido. 5
Traditionally, a cromatografia líquida (HPLC) de separação dos péptidos hidrofóbicos, tais como Ap alto desempenho tem sido feito através da utilização de uma combinação de C 4 ou C 8 fases estacionárias à base de sílica e uma fase móvel de ácido. 6 No entanto, tais condições podem apresentar um desafio para a purificação do péptido. O ponto isoeléctrico baixo do péptido Ap (pi de aproximadamente 5,5) 7 significa que, sob condições ácidas, a agregação peptídica é aumentada e, como resultado grandes picos de HPLC, não resolvidas que são muitas vezes difíceis de isolar são produzidas (Figura 2A). Além disso, esses picos largos contêm frequentemente impurezas que podem ter impacto no perfil de agregação do peptídeo, e geralmente requerem ciclos subsequentes de purificação, que podem ter impacto dramaticamente a quantidade de péptido produzida.
O poli (estireno / divinilbenzeno) de fase estacionária, PLRP-S, representa um meio alternativo de PurifYing péptidos hidrofóbicos. A fase estacionária foi utilizado na purificação de um número de diferentes proteínas e ácidos ribonucleicos mensageiro (mRNA). 8, 9 A fase estacionária PLRP-S requer nenhum ligando de alquilo adicional para a separação de fase reversa, e o mais importante é quimicamente estável a um pH elevado, que leva a desagregação do péptido. 7 Relata-se um protocolo de purificação HPLC adaptado que produz alta pureza amyloid beta 42 (Aβ42) e beta 40 peptídeos amilóides (Aβ40).
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Protocolo
1. Purificação por HPLC Preparativa do Peptídeo Aβ40 ou Aβ42
- Prepare os seguintes tampões para a purificação por CLAE.
- Prepare o tampão A (20 mM NH4OH) adicionando 1,3 mL de NH4OH (solução a 28%) a 1.000 mL de água ultrapura.
- Prepare o tampão B (80% de acetonitrila com 20 mM NH4OH) adicionando 1,3 mL de NH4OH (solução a 28%) a uma solução contendo 800 mL de acetonitrila grau CLAE e 200 mL de água ultrapura.
- Prepare o tampão de dissolução da amostra (0,1% de NH4OH) adicionando 100 µL de NH4OH (solução a 28%) a 100 mL de água ultrapura.
- Configure o instrumento de CLAE conforme mostrado na Figura 1.
- Conecte os frascos de solvente contendo o tampão A e o tampão B às entradas da bomba de CLAE utilizando tubos de polímero. Fixe os tubos de polímero à bomba de CLAE com uma conexão de peça única. Certifique-se de que os tubos de polímero de cada tampão estejam conectados à válvula de entrada correta do instrumento. Instale um desgaseificador na bomba de CLAE.
- Conecte a bomba de CLAE à entrada da coluna preparativa de 300 Å, 8 µm, 25 mm х 300 mm (Figura 1B, coluna mais à esquerda, veja a Lista de Materiais) utilizando tubos de polímero.
- Fixe o tubo de polímero à coluna preparativa com uma conexão de peça única apertada com os dedos. Certifique-se de que o tubo de polímero esteja orientado corretamente.
NOTA: A fase estacionária da coluna preparativa é composta por partículas de poli(estireno-divinilbenzeno). A orientação correta do tubo de polímero é indicada na carcaça externa com uma única seta direcional.
- Fixe o tubo de polímero à coluna preparativa com uma conexão de peça única apertada com os dedos. Certifique-se de que o tubo de polímero esteja orientado corretamente.
- Conecte a saída da coluna ao detector de duplo comprimento de onda utilizando tubos de polímero e configure o detector para 214 nm e 280 nm.
- Altere o comprimento de onda ajustando os parâmetros de comprimento de onda de detecção na opção de método de configuração do instrumento no software interno da CLAE.
- Conecte o tubo de polímero à entrada do detector de comprimento de onda com uma conexão de peça única apertada com os dedos. Conecte um tubo de polímero à válvula de saída do detector de comprimento de onda. Conecte o tubo de polímero à válvula de saída do detector de CLAE com uma conexão de peça única apertada com os dedos. Este será o tubo de coleta da amostra.
NOTA: A ausência de um cromóforo forte no peptídeo Aβ determina que 214 nm seja utilizado como comprimento de onda ultravioleta (UV) principal para a coleta dos picos.
Figura 1: Configuração experimental do instrumento de CLAE utilizado para a purificação dos peptídeos beta-amiloides. (A) A bomba quaternária de CLAE equipada com desgaseificador e detector de comprimento de onda variável ajustado em 214 nm e 280 nm; (B) Colunas de CLAE utilizadas para a purificação dos peptídeos beta-amiloides, da esquerda para a direita, coluna preparativa de 25 x 300 mm2, coluna semipreparativa de 7,5 x 300 mm2 e coluna analítica de 4,6 x 250 mm2; (C) Injetor manual com alça de injeção de aço inoxidável de 20 µL utilizada para CLAE analítica; (D) Injetor manual com alça de injeção de aço inoxidável de 10 mL utilizada para purificação preparativa e semipreparativa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
- Configure o software da CLAE para executar o método de purificação conforme mostrado na Tabela 1. Insira o método de purificação alterando o parâmetro de cronograma do solvente (na opção de configuração do método do instrumento incorporada ao software da CLAE). Ligue a bomba da CLAE clicando no botão "on" no software da CLAE.
NOTA: A bomba começará a fornecer a proporção inicial dos tampões A e B através da coluna preparativa e do instrumento de CLAE.- Deixe o sistema por 30 min para completar a equilibração.
| Tempo / min | % do Tampão Aa | % do Tampão Bb | Taxa de Fluxod / mL min-1 |
| 0 | 80 | 20 | 6 |
| 45 | 75,5 | 24,5 | 6 |
| 45,01 | 80 | 20 | 6 |
| 52,01 | 80 | 20 | 6 |
| 52,02 | 73 | 27 | 6 |
| 85 | 73 | 27 | 6 |
| 92 | 5 | 95c | 6 |
Tabela 1: Cronograma para a purificação dos peptídeos Aβ42 e Aβ40 utilizando a coluna polimérica de 25 × 300 mm. aTampão A - H2O com 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O com 20 mM NH4OH; cExecutado por 15 min para lavar a coluna antes da próxima injeção da amostra; dPara operar uma vazão de 6 mL/min no equipamento de CLAE, o limite de pressão precisa ser reduzido para 200 bar.
- Purificação da amostra do peptídeo Aβ
Observação: O peptídeo bruto foi obtido por meio de síntese automatizada de peptídeos em fase sólida.10- Dissolva 3 mg do peptídeo Aβ bruto em 4 mL do tampão de dissolução da amostra. Sonique a amostra por 30-60 s à temperatura ambiente e com frequência de 40 kHz para auxiliar na dissolução.
- Introduza toda a amostra na coluna de CLAE usando uma seringa plástica de 5 mL acoplada a uma agulha de aço inoxidável de 16 polegadas. Execute o método de purificação conforme descrito na subetapa 1.3.
OBSERVAÇÃO: O sistema permite a injeção da amostra por meio de um injetor manual equipado com um loop de injeção de 10 mL feito de aço inoxidável (Figura 1D). O peptídeo Aβ desejado será eluído entre 72 e 74 min como um pico nítido e bem resolvido (Figura 2C). - Recolha a amostra em um tubo cônico de centrífuga de 50 mL. Confirme a identidade do pico de Aβ por espectrometria de massas com injeção direta do eluente coletado.11 Armazene o eluente por até 12 h a -20 °C.
OBSERVAÇÃO: Não é recomendado armazenar a solução por períodos superiores a 12 h devido ao risco de oxidação do peptídeo. - Isole o peptídeo purificado congelando rapidamente a(s) alíquota(s) coletada(s) do peptídeo Aβ em nitrogênio líquido e liofilize. Realize a liofilização secando a amostra por congelamento a uma temperatura de -60 °C e pressão de 20 mTorr por um período de 24 h.
- Execute o protocolo analítico de CLAE conforme descrito abaixo para determinar a pureza do peptídeo Aβ. Armazene os peptídeos na forma liofilizada a -20 °C por até 6 meses.
2. Análise por HPLC Analítica da Proteína Aβ Purificada
- Prepare os tampões de CLAE conforme descrito na subseção 1.1 do protocolo acima.
- Monte a CLAE analítica conforme o passo 1.2.1 e conforme ilustrado na Figura 1, com a coluna analítica de 4,6 × 250 mm (Figura 1B, coluna mais à direita) e o injetor manual com alça de injeção de aço inoxidável de 20 µL (Figura 1C) acoplado ao instrumento.
- Configure o software da CLAE para executar o método analítico conforme mostrado na Tabela 2, seguindo instruções semelhantes às do passo 1.3.
| Tempo / min | % do Tampão Aa | % do Tampão Bb | Taxa de Fluxo / mL min-1 |
| 0 | 95 | 5 | 1 |
| 30 | 50 | 50 | 1 |
Tabela 2: Cronograma para a análise de pureza por CLAE do peptídeo Aβ. aTampão A - H2O com 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O com 20 mM NH4OH.
- Análise de pureza do peptídeo Aβ
- Prepare uma solução de 1 mg/mL do peptídeo purificado pela dissolução do peptídeo na solução tampão amostral.
NOTA: A receita do tampão pode ser encontrada na subseção 1.1. A concentração proteica é determinada pela medição da absorção da proteína a 280 nm (A280nm).12 O coeficiente de extinção molar (ε) utilizado para determinar a concentração é ε = 1.490 dm3 mol-1 cm-1.13 - Injete 20 µL da solução de 1 mg/mL (222 µM) na coluna de CLAE e execute o método analítico configurado na etapa 2.3.
NOTA: A solução remanescente não utilizada para análise pode ser congelada rapidamente em nitrogênio líquido e liofilizada para recuperar o peptídeo Aβ. Os detalhes da liofilização podem ser encontrados na subseção 1.4.4. O peptídeo Aβ será eluído da coluna analítica entre 16 e 18 min (Figura 2D). Utilize o software de análise de integração embutido que acompanha o instrumento de CLAE para determinar a pureza do peptídeo Aβ. A pureza é determinada pela integração de cada pico individual no espectro e pelo cálculo da porcentagem da área do pico do peptídeo. Normalmente, deve-se obter uma pureza de >95%.
- Prepare uma solução de 1 mg/mL do peptídeo purificado pela dissolução do peptídeo na solução tampão amostral.
Figura 2: Traçados representativos de CLAE de Aβ42. (A) Purificação tradicional em sílica C4, condições: Tampão A: H2O com 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), tampão B: MeCN (acrilonitrila) com 0,1% de TFA, gradiente: 20 a 27% do tampão B em 40 min, seguido por 27% isocrático do tampão B; (B) Purificação preparativa utilizando coluna polimérica de 25 x 300 mm2, condições: Tampão A: H2O com 20 mM de NH4OH, tampão B: 80% MeCN / 20% H2O com 20 mM de NH4OH, gradiente: 20 a 27% do tampão B em 70 min, seguido por 27% isocrático do tampão B; (C) Purificação preparativa otimizada utilizando coluna polimérica de 25 x 300 mm2, condições descritas na Tabela 1 localizada na subseção 1.3 do texto descritivo do protocolo; (D) CLAE analítica utilizando coluna polimérica de 4,6 x 250 mm2, condições: Tampão A: H2O com 20 mM de NH4OH, tampão B: 80% MeCN / 20% H2O com 20 mM de NH4OH, gradiente: 5 a 50% do tampão B em 30 min. Nas partes A, B e C, o pico correspondente ao Aβ42 é marcado por um asterisco. A coleta do pico de Aβ42 marcado na parte C revela uma pureza de >95%, conforme mostrado na parte D. A espectrometria de massas foi utilizada para determinar a identidade do pico de Aβ42. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
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Resultados
A purificação do peptídeo Aβ42 utilizando uma combinação da fase estacionária PLRP-S e uma fase móvel de pH elevado resulta na formação de um pico nítido e bem resolvido para o peptídeo Aβ em um tempo de retenção entre 72 e 74 minFigura 2C). A confirmação da identidade do pico é realizada por espectrometria de massas com injeção direta do eluente coletado. O eluente pode ser armazenado a -20 °C em solução por até 12 h. Períodos mais longos de armazenamento podem resultar ...
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Discussão
A purificação por HPLC do peptídeo Aβ é altamente dependente da escolha da fase estacionária empregada na purificação e da fase móvel escolhida para eluir o peptídeo. O baixo ponto isoelétrico do peptídeo e a alta propensão à agregação tornam desafiadoras as condições cromatográficas tradicionais para a separação de proteínas hidrofóbicas (fase estacionária C4 ou C8 acoplada a um eluente móvel ácido), com o peptídeo Aβ eluindo como um pico amplo e não resolvido prolongado (Figura 2A).
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer à Agilent por sua assistência técnica. Kate Markham e Rafael Palomino são creditados por sua ajuda inicial na síntese e purificação do peptídeo Aβ e o Dr. Hsiau-Wei Lee é agradecido por sua ajuda na preparação da Figura 1 do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bomba quaternária Agilent 1260 Infinity II | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Detector de comprimento de onda variável duplo | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Injetor Manual Agilent 1260 Infinity II equipado com loop de amostra de aço inoxidável de 10 mL | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Injetor Manual Agilent 1260 Infinity II equipado com 20 µ L laço de amostra de aço inoxidável | Agilent | G1328C | Suporte de montagem de http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| anel | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 5 µ m 4,6 x 250 mm (Analítico) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ 42 ou Aβ 40 peptídeos | Sintetizado internamente usando um sintetizador de peptídeos automatizado CEM liberty. | ||
| Hidróxido de Amônio (NH4OH, solução a 28%) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrila | Fisher Scientific | A998-4 | |
| centrífuga cônico Falcon de 50 mL | Scientific | Fisher Scientific 14-954-49A | |
| Sigma-Aldrich | Z227250 | ||
| Normject 5 seringa estéril do CC | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 calibre SS agulha | Rheodyne | 3725-086 |
Referências
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Reimpressões e permissões
