A purificação Protocolo Tailored HPLC que os rendimentos de alta pureza beta-amilóide 42 e beta-amilóide 40 Peptides, capaz de Formação Olig�ero

Resumo

Aqui, relatamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado que produz peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza, capazes de formação de oligômeros. A beta-amiloide é um peptídeo hidrofóbico altamente propenso a agregação implicado na doença de Alzheimer. A natureza amiloidogênica do peptídeo torna sua purificação um desafio.

Resumo

Peptídeos amiloidogênicos, como o beta amilóide (Aβ) implicado na doença de Alzheimer, podem apresentar um desafio significativo ao tentar obter material de alta pureza. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação por HPLC personalizado para produzir peptídeos beta-amilóide 42 (Aβ42) e beta-amilóide 40 (Aβ40) de alta pureza. Descobrimos que a combinação de fase estacionária hidrofóbica de poli(estireno/divinilbenzeno) disponível comercialmente, fase reversa de laboratório de polímeros - estirenodivinilbenzeno (PLRP-S) sob condições de pH alto, permite a obtenção de Aβ42 de alta pureza (>95%) em uma única corrida cromatográfica. A purificação é altamente reprodutível e pode ser alterada para condições semipreparativas e analíticas, dependendo da quantidade de material que se deseja purificar. O protocolo também pode ser aplicado ao peptídeo Aβ40 com idêntico sucesso e sem a necessidade de alterar o método.

Introdução

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que os efeitos de mais de 35 milhões de pessoas em todo o mundo. ¹ Implicado fortemente no início e desenvolvimento da doença, é altamente propensos a agregação, peptídeo hidrofóbico beta-amilóide (Ap). Ap ² varia de 36 a 43 aminoácidos de comprimento, no entanto, pensa-se que o 42-amino ácido variante, beta amilóide 42 (Aβ42), é a forma mais tóxica da proteína. ³ Isto é devido em grande parte à capacidade de Aβ42 para formar prontamente difus�eis, espécies oligoméricas que se acredita ser entidades particularmente neurotóxicos. ⁴ A fim de promover nossa compreensão do peptídeo Aâ, é essencial para obter rotineiramente material de alta pureza. A presença de vestígios de impurezas foi mostrado para alterar drasticamente as propriedades de agregação propensão do péptido. ⁵

Traditionally, a cromatografia líquida (HPLC) de separação dos péptidos hidrofóbicos, tais como Ap alto desempenho tem sido feito através da utilização de uma combinação de C ₄ ou C ₈ fases estacionárias à base de sílica e uma fase móvel de ácido. ⁶ No entanto, tais condições podem apresentar um desafio para a purificação do péptido. O ponto isoeléctrico baixo do péptido Ap (pi de aproximadamente 5,5) ⁷ significa que, sob condições ácidas, a agregação peptídica é aumentada e, como resultado grandes picos de HPLC, não resolvidas que são muitas vezes difíceis de isolar são produzidas (Figura 2A). Além disso, esses picos largos contêm frequentemente impurezas que podem ter impacto no perfil de agregação do peptídeo, e geralmente requerem ciclos subsequentes de purificação, que podem ter impacto dramaticamente a quantidade de péptido produzida.

O poli (estireno / divinilbenzeno) de fase estacionária, PLRP-S, representa um meio alternativo de PurifYing péptidos hidrofóbicos. A fase estacionária foi utilizado na purificação de um número de diferentes proteínas e ácidos ribonucleicos mensageiro (mRNA). ^{8, 9} A fase estacionária PLRP-S requer nenhum ligando de alquilo adicional para a separação de fase reversa, e o mais importante é quimicamente estável a um pH elevado, que leva a desagregação do péptido. ⁷ Relata-se um protocolo de purificação HPLC adaptado que produz alta pureza amyloid beta 42 (Aβ42) e beta 40 peptídeos amilóides (Aβ40).

Protocolo

1. Purificação preparativa por HPLC do peptídeo Aβ40 ou Aβ42

1. Preparar os seguintes tampões para a purificação por HPLC.
   1. Prepare o tampão A (20 mM NH₄OH) adicionando 1,3 mL de NH₄OH (solução a 28%) a 1.000 mL de água ultrapura.
   2. Prepare o tampão B (acetonitrila a 80% com 20 mM NH₄OH) adicionando 1,3 mL de NH₄OH (solução a 28%) a uma solução de 800 mL de acetonitrila de grau HPLC e 200 mL de água ultrapura.
   3. Prepare o tampão de dissolução da amostra (0,1% NH₄OH) adicionando 100 μL de NH₄OH (solução a 28%) a 100 mL de água ultrapura.
2. Configure o instrumento de HPLC conforme mostrado na Figura 1.
   1. Encaixe os frascos de solvente que contêm tampão A e tampão B nas entradas da bomba de HPLC usando tubos de polímero. Conecte a tubulação de polímero à bomba de HPLC com uma conexão de peça única. Certifique-se de que a tubulação de polímero de cada tampão esteja encaixada na válvula de entrada correta do instrumento. Instale a bomba de HPLC com um desgaseificador.
   2. Acople a bomba de HPLC com a entrada da coluna preparativa de 300 Å 8 μm 25 mm х 300 mm (Figura 1B, coluna da extrema esquerda, consulte a Lista de Materiais) usando tubos de polímero.
      1. Conecte o tubo de polímero à coluna preparativa com um encaixe de aperto de uma peça. Certifique-se de que a coluna de polímero esteja orientada da maneira correta.
         NOTA: A fase estacionária da coluna preparativa é composta por partículas de poli(estireno-divinilbenzeno). A orientação correta da coluna de polímero é marcada no invólucro externo com uma única seta direcional.
   3. Conecte a saída da coluna ao detector de comprimento de onda duplo usando tubos de polímero e ajuste o detector de comprimento de onda para 214 nm e 280 nm.
      1. Altere o comprimento de onda alterando os parâmetros do comprimento de onda de detecção na opção de método do instrumento de configuração do software HPLC integrado.
   4. Conecte o tubo de polímero à entrada do detector de comprimento de onda com um encaixe de aperto de dedo de uma peça. Conecte a tubulação de polímero à válvula de saída do detector de comprimento de onda. Conecte o tubo de polímero à válvula de saída do detector de HPLC com um encaixe de aperto de dedo de uma peça. Esta será a tubulação de coleta de amostras.
      NOTA: A falta de um cromóforo forte no peptídeo Aβ determina que 214 nm seja usado como o comprimento de onda ultravioleta (UV) primário para o pico de coleta.

Figura 1: Configuração experimental do instrumento de HPLC usado para purificação dos peptídeos beta amilóides. A) A bomba de HPLC quaternária equipada com um desgaseificador e um detector de comprimento de onda variável regulado para 214 nm e 280 nm; (B) Colunas de HPLC usadas para purificação dos peptídeos beta amilóides, da esquerda para a direita, coluna preparativa de 25 x 300 mm², coluna semipreparativa de 7,5 x 300 mm² e coluna analítica de 4,6 x 250 mm²; (C) Injetor manual com circuito de injeção de aço inoxidável de 20 μL usado para HPLC analítica; (D) Injetor manual com circuito de injeção de aço inoxidável de 10 mL usado para purificação preparativa e semipreparativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Programe o software HPLC para executar o método de purificação conforme mostrado na Tabela 1. Insira o método de purificação alterando o parâmetro do cronograma do solvente (na opção de método do instrumento de configuração incorporada ao software HPLC). Ligue a bomba de HPLC clicando no botão "on" no software de HPLC.
   NOTA: A bomba começará a fornecer a taxa de partida do buffer A e do buffer B através da coluna preparativa e do instrumento de HPLC.
   1. Deixe o sistema por 30 min para equilibrar totalmente.

Tempo / min % de buffer A^a % do tampão B^b Taxa de fluxo^d / mL ^min-1 0 80 20 6 45 75,5 24,5 6 45.01 80 20 6 52.01 80 20 6 52.02 73 27 6 85 73 27 6 92 5 95^c 6

Tabela 1: Calendário para a purificação dos peptídeos Aβ42 e Aβ40 usando a coluna de polímero de 25 × 300 mm. ^umTampão A - H₂O com 20 mM NH₄OH; ^b80% MeCN / 20% H₂O com 20 mM NH₄OH; ^cFuncionou por 15 min para lavar a coluna antes da próxima injeção de amostra; ^dPara executar uma vazão de 6 mL/min na instrumentação de HPLC, o limite de pressão precisa ser reduzido para 200 bar.

4. Purificação da amostra do peptídeo Aβ
   Nota: O peptídeo bruto foi obtido por meio da síntese automatizada de peptídeos em fase sólida. ¹⁰
   1. Dissolva 3 mg de peptídeo Aβ bruto em 4 ml do tampão de dissolução da amostra. Sonicar a amostra durante 30-60 s à temperatura ambiente e a uma frequência de 40 kHz para ajudar na dissolução.
   2. Injetar toda a amostra na coluna de HPLC utilizando uma seringa de plástico de 5 ml equipada com uma agulha de aço inoxidável de calibre 16. Execute o método de purificação conforme descrito na subetapa 1.3.
      NOTA: O sistema permite que a injeção de amostra seja feita através do uso de um injetor manual equipado com um laço de injeção de aço inoxidável de 10 mL (Figura 1D). O peptídeo Aβ desejado eluirá entre 72 e 74 min como um pico resolvido nítido ( Figura 2C ).
   3. Colete a amostra em um tubo de centrífuga cônico de 50 mL. Confirmar a identidade do pico Aβ através de espectrometria de massa por injeção direta do eluente recolhido. ¹¹ Armazenar o eluente por até 12 h a -20 °C.
      NOTA: O armazenamento da solução por períodos superiores a 12 h não é recomendado devido ao potencial de oxidação do peptídeo.
   4. Isolar o peptídeo purificado congelando rapidamente alíquota ou alíquotas coletadas do peptídeo Aβ em nitrogênio líquido e liofilizar. Realizar a liofilização liofilizando a amostra a uma temperatura de -60 °C e a uma pressão de 20 mTorr por um período de 24 h.
   5. Execute o protocolo analítico de HPLC conforme descrito abaixo para determinar a pureza do peptídeo Aβ. Armazene os peptídeos em sua forma liofilizada a -20 °C por um período de até 6 meses.

2. Análise analítica por HPLC da proteína Aβ purificada

1. Preparar os tampões de HPLC conforme descrito na subsecção 1.1 do protocolo acima.
2. Configure a HPLC analítica de acordo com a etapa 1.2.1 e conforme ilustrado na Figura 1 com a coluna analítica de 4.6 × 250 mm (Figura 1B, coluna da extrema direita) e o injetor manual com loop de injeção de aço inoxidável de 20 μL (Figura 1C) instalado no instrumento.
3. Programe o software HPLC para executar o método analítico conforme mostrado na Tabela 2, seguindo instruções semelhantes às da etapa 1.3.

Tempo / min % de buffer A^a % do tampão B^b Taxa de fluxo / mL ^min-1 0 95 5 1 30 50 50 1

Quadro 2: Calendário para a análise da pureza do peptídeo Aβ por HPLC. ^umTampão A - H₂O com 20 mM NH₄OH; ^b80% MeCN / 20% H₂O com 20 mM NH₄OH.

4. Análise da pureza do peptídeo Aβ
   1. Preparar uma solução de 1 mg/ml do peptídeo purificado através da dissolução do peptídeo na solução tampão da amostra.
      NOTA: A receita do buffer pode ser encontrada na subseção 1.1. A concentração de proteínas é determinada medindo a absorção de proteínas a 280 nm (A_{280 nm}). ¹² O coeficiente de extinção molar (ε) usado para determinar a concentração é ε = 1.490 dm^{3 mol-1 cm-1}. ¹³
   2. Injetar 20 μL da solução de 1 mg/ml (222 μM) na coluna de HPLC e executar o método analítico que foi configurado no passo 2.3.
      NOTA: A solução restante não usada para análise pode ser congelada rapidamente em nitrogênio líquido e liofilizada para recuperar o peptídeo Aβ. Os detalhes da liofilização podem ser encontrados na subseção 1.4.4. O peptídeo Aβ eluirá da coluna analítica entre 16 e 18 min (Figura 2D). Use o software de análise de integração integrado que acompanha o instrumento HPLC para determinar a pureza do peptídeo Aβ. A pureza é determinada integrando cada um dos picos individuais no espectro e calculando a área percentual de pico do peptídeo. Normalmente, uma purificação de >95% deve ser verificada.

Figura 2: Traços representativos de Aβ42 por HPLC. (A) Purificação tradicional de sílica C₄, condições: Tampão A: H₂O com ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%, tampão B: MeCN (acetonitrila) com TFA a 0,1%, gradiente: tampão B de 20 a 27% durante 40 min seguido de tampão B isocrático de 27%; (B) Purificação preparativa usando a coluna de polímero 25 x 300 mm², condições: Tampão A: H₂O com 20 mM NH₄OH, tampão B: 80% MeCN / 20% H₂O com 20 mM NH₄OH, gradiente: 20 a 27% tampão B durante 70 min seguido de tampão B isocrático de 27%; (C) Purificação preparativa otimizada usando a coluna de polímero²⁵ x 300 mm 2, as condições são descritas na Tabela 1 localizada na subseção 1.3 do texto de descrição do protocolo; (D) HPLC analítica usando a coluna de polímero de 4,6 x 250 mm², condições: Tampão A: H₂O com 20 mM NH₄OH, tampão B: 80% MeCN / 20% H₂O com 20 mM NH₄OH, gradiente-5 a 50% tampão B durante 30 min. Para as partes A, B e C, o pico correspondente a Aβ42 é marcado por um asterisco. A coleta do pico Aβ42 marcado na parte C revela uma pureza de >95%, conforme mostrado na parte D. A espectrometria de massa foi usada para determinar a identidade do pico Aβ42. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

A purificação do peptídeo Aβ42 usando uma combinação da fase estacionária PLRP-S e uma fase móvel de alto pH resulta na formação de um pico nítido e resolvido para o peptídeo Aβ em um tempo de retenção entre 72 e 74 min (Figura 2C). A confirmação da identidade do pico é feita por meio de espectrometria de massa por injeção direta do eluente coletado. O eluente pode ser armazenado a -20 °C em solução por até 12 h. Períodos mais longos de armazenamento podem resultar na oxi...

Discussão

A purificação por HPLC do peptídeo Aβ é altamente dependente da escolha da fase estacionária empregada na purificação e da fase móvel escolhida para eluir o peptídeo. O baixo ponto isoelétrico do peptídeo e a alta propensão à agregação tornam desafiadoras as condições cromatográficas tradicionais para a separação de proteínas hidrofóbicas (fase estacionária C4 ou C8 acoplada a um eluente móvel ácido), com o peptídeo Aβ eluindo como um pico amplo e não resolvido prolongado (Figura 2A).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bomba quaternária Agilent 1260 Infinity II	Agilent	G7111B	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Detector de comprimento de onda variável duplo	Agilent	G7114A	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Injetor Manual Agilent 1260 Infinity II equipado com loop de amostra de aço inoxidável de 10 mL	Agilent	0101-1232	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Injetor Manual Agilent 1260 Infinity II equipado com 20 µ L laço de amostra de aço inoxidável	Agilent	G1328C	Suporte de montagem de http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
anel	Agilent	1400-3166
Agilent PLRP-S 300   5  µ m 4,6 x 250 mm (Analítico)	Agilent	PL1512-5501	http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ 42 ou Aβ 40 peptídeos			Sintetizado internamente usando um sintetizador de peptídeos automatizado CEM liberty.
Hidróxido de Amônio (NH4OH, solução a 28%)	Fisher Scientific	A669-500
Acetonitrila	Fisher Scientific	A998-4
centrífuga cônico Falcon de 50 mL	Scientific	Fisher Scientific 14-954-49A
	Sigma-Aldrich	Z227250
Normject 5  seringa estéril do CC	Fisher Scientific	1481729
16 calibre SS agulha	Rheodyne	3725-086