In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

Stefanie Dudczig; Peter D. Currie; Lucia Poggi; Patricia R. Jusuf

doi:10.3791/55490

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Artigo de método

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

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DOI:

10.3791/55490

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22 de março de 2017

Stefanie Dudczig¹^,² , Peter D. Currie² , Lucia Poggi³ , Patricia R. Jusuf¹^,²

¹School of Biosciences, The University of Melbourne, ²Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, ³The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

Neste artigo

Resumo

acompanhamento ao vivo de células progenitoras da retina WT individuais em fundos genéticos distintos permite a avaliação da contribuição das células de sinalização não autónomo durante a neurogênese. Aqui, uma combinação de silenciamento de genes, através de transplante de geração quimera embrião e na imagiologia de lapso de tempo in vivo confocal foi utilizada para este propósito.

Resumo

Os pontos fortes genéticos e técnicos fizeram o vertebrado zebrafish um organismo chave modelo no qual as consequências das manipulações genéticas podem ser rastreadas in vivo durante todo o período de desenvolvimento acelerado. Vários processos podem ser pesquisados, incluindo a proliferação celular, a expressão do gene, a migração celular e morfogénese. Importante, a geração de quimeras através de transplantes pode ser facilmente realizada, permitindo mosaico rotulagem e a identificação de células individuais sob a influência do meio ambiente do hospedeiro. Por exemplo, pela combinação de manipulações funcionais de genes do embrião hospedeiro (por exemplo, através de microinjecção morfolino) e imagens ao vivo, os efeitos da não-autônomos extrínseca, sinais celulares (fornecido pelo ambiente geneticamente modificado) em células do dador transplantado individuais podem ser avaliadas. Aqui demonstramos como essa abordagem é usada para comparar o início da expressão do transgene fluorescente como um proxy para o calendário de determin destino celularção em diferentes ambientes genéticos do hospedeiro.

Neste artigo, nós fornecemos o protocolo para microinjecting embriões de peixe-zebra para marcar células do doador e para causar silenciamento de genes em embriões de acolhimento, uma descrição da técnica de transplante usado para gerar embriões quiméricos, eo protocolo para a preparação e funcionando in vivo confocal de lapso de tempo imagens de vários embriões. Em particular, a realização de imagem multiposition é crucial quando se comparam cronometragem de eventos, tais como o início da expressão do gene. Isto requer a coleta de dados do controle múltiplo e embriões experimentais processados simultaneamente. Tal abordagem pode ser facilmente estendido para estudos de influências extrínsecos em qualquer órgão ou tecido de escolha acessível para imagens ao vivo, desde que o transplante pode ser alvejado facilmente de acordo com os mapas fate embrionárias estabelecidas.

Introdução

A capacidade de visualizar os processos de desenvolvimento importantes em um vertebrado in vivo tem contribuído para tornar o peixe-zebra um modelo fundamental para o estudo de condições normais e de doenças (revisto em ^{^1,} ^2). Em particular, a retina neural é uma parte acessível do sistema nervoso central. A retina presta-se facilmente realizar estudos de neurogênese, devido à sua, ainda estrutura relativamente simples altamente organizado, e seus tipos de neurônios altamente conservadas entre espécies de vertebrados ^3. A dinâmica de comportamentos celulares tais como a ....