Este artigo descreve como a seletividade iônica da channelrodopsina é determinada com registros eletrofisiológicos de patch-clamp de células inteiras usando células HEK293. Aqui, o procedimento experimental para investigar a seletividade de cloreto de uma channelrodopsina seletiva de ânions é demonstrado. No entanto, o procedimento é transferível para outras canalrodopsinas de seletividade distinta.
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Artigo de método
Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ao longo da última década, os channelrhodopsins tornaram-se indispensáveis na pesquisa neurocientífica onde eles são usados como ferramentas para manipular não-invasivamente processos elétricos em células-alvo. Neste contexto, a selectividade iónica de uma canalrhodopsina é de particular importância. Este artigo descreve a investigação da seletividade de cloretos para uma canalrhodopsina de Proteomonas sulcata, condutora de aniões, recentemente identificada, por meio de gravações electrofisiológicas em células HEK293. O procedimento experimental para a medição de fotocorrentes de luz-gated exige uma fonte de luz rápida comutável - idealmente monocromática - acoplada ao microscópio de uma instalação de patch-clamp, de outra forma convencional. Os procedimentos preparativos antes da experiência são descritos envolvendo a preparação de soluções tamponadas, considerações sobre potenciais de junção de líquidos, semeadura e transfecção de células e puxar de pipetas de remendo. A gravação real da relação tensão-correnteS para determinar os potenciais de reversão para diferentes concentrações de cloreto ocorre 24 h a 48 h após a transfecção. Finalmente, os dados eletrofisiológicos são analisados com respeito a considerações teóricas de condução de cloreto.
Introdução
Channelrhodopsins (ChR) são luz-gated canais iônicos que ocorrem na mancha do olho de algas verdes motile, e servem como fotossensores primários para phototaxis e respostas fóbicas [ 1] . Desde sua primeira descrição em 2002 2 , os CHRs abriram o caminho para o campo emergente da optogenética e podem ser aplicados em uma variedade de células excitáveis, por exemplo, dentro dos músculos esqueléticos, do coração ou do cérebro 3 , 4 , 5 . A expressão de ChRs em células alvo resulta na permeabilidade iónica controlável pel....
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Protocolo
Figura 1: Configuração do Patch-clamp. (1) fonte de luz, (2) fibra óptica, (3) obturador programável, (4) digitalizador, (5) obturador, (6) amplificador, (7) sistema de perfusão, (8) computador pessoal, , (10) gaiola faraday, (11) fase de microscópio, (12) entrada de perfusão, (13) saída de perfusão, (14) câmara de gravação, (15) (22) Microscópio invertido, (21) Microscópio lâmpada, (22) Lâmpada de microscópio fonte de alimentação, (23) água-cheio U-tubo, (24) de três vias Válvula, (25) tabela anti-vibração, (26)....
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Resultados
A Figura 2 mostra resultados representativos obtidos a partir de medições seguindo o protocolo descrito. Durante a iluminação com luz verde, Ps ACR1 apresenta uma corrente transitória rápida que decai rapidamente para um nível de corrente estacionária. Depois que a luz é desligada, as fotocorrentes decaem para zero em milissegundos ( Figura 2A ). A troca da concentração de cloreto extracelular provoca um deslocamento do potencial de invers.......
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Discussão
A determinação de potenciais de reversão em condições iónicas e elétricas definidas fornece informações sobre a espécie de íons transportada após a ativação leve de ChRs. Se exclusivamente uma espécie de iões é variada num meio fisiológico complexo e o potencial de reversão obtido se desloque de acordo com o potencial teórico de Nernst, esta espécie de iões é a única transportada.
No entanto, para ChRs, reversão potenciais turnos são geralmente menos pronunciada do que o esperado a partir da.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Maila Reh, Tharsana Tharmalingam e especialmente a Altina Klein pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Alemã (DFG) (SFB1078 B2, FOR1279 SPP1665 a PH) e o Cluster of Excellence Unifying Concepts em Catálise, UniCat, BIG-NSE (JV) e E4 (PH).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células HEK293 | Sigma Aldrich | 85120602 | Células renais embrionárias humanas |
| Retinal Sigma Aldrich | R2500 | totalmente trans retinal | |
| FuGENE HD | Promega | E2312 | Reagente de transfecção |
| DMEM | Biochrome | FG 0445 | Dulbecco's Modified Eagle Medium |
| Agarose | Roth | 3810 | Pontes de ágar |
| CaCl2 | Roth | 5239 | CaCl2 2H2O |
| CsCl | Biomol 2452 | ||
| EGTA | Roth | 3054 | |
| FBS | Biochrome | S0615 | Cultura de células |
| Glicose | Roth | HN06 | D(+)-Glicose |
| KCl | Roth | 6781 | |
| MgCl2 | Roth | 2189 | MgCl2 6H2O |
| NaCl | Roth 3957 | ||
| NMG | Sigma Aldrich | M2004 | N-Metil-D-glucamina |
| Na-Aspartato | Sigma Aldrich | A6683 | Sal de sódio do ácido L-aspártico monohidratado |
| Ácido cítrico | Roth | 6490 | |
| AgeI | ThermoFischerScientific | ER1462 | Enzima de restrição |
| XhoI | ThermoFischerScientific | ER0695 | Enzima de restrição |
| NheI | ThermoFischerScientific | ER0975 | Enzima de restrição |
| XL1Blue E. coli | Agilent Technologies | 200249 | Quimioterapia competente E. coli |
| Kanamicina | Roth | T832 | |
| Caldo de lisogenia médio | Roth | X964 | |
| Ágar-Ágar | Roth | 6494 | Placas de ágar |
| Kit de purificação de plasmídeo | Marchery-Nagel | 740727.25 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Biocromo | A 2213 | Cultura de células |
| Bromidrato de poli-D-lisina | Sigma Aldrich | P6407-5MG | Revestimento de lamínula |
| Microforge | Pipetas serológicas de | polimento de fogo | |
| TPP | Diferentes tamanhos | ||
| Bancada limpa | Kojair | Biowizard SL130 | |
| Agitador | IKA | RCT clássico | |
| Fio de prata | Produtos científicos | AG-T25; AG-T10 | Eléctrodos, 0,64 mm (banho); 0,25 mm (eléctrodo) |
| medidor de pH | Knick | 765 Osmómetro Calimétrico | |
| Vogel | OM 815 | ||
| Microscópio | Carl Zeiss | ID03 | Polimento a fogo |
| Incubadora de CO2 | Binder | CB150 | |
| Placas de cultura de células | TPP | 93040 | 34 mm internas Termômetro |
| Roth | P232 | 15 mm de diâmetro | |
| ssel Messtechnik | MTM12 | ||
| Beamsplitter | Chroma | 21011 | 90/10 suporte |
| pipeta | ALA Scientific Instruments | PPH-1P-AXU-0-1.5 | |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Amplificador | Molecular Dispositivos Moleculares | AxoPatch200B | |
| Digitizer | Molecular Devices | DigiData1400 | Conversor analógico digital |
| Fonte de luz | TILL Photonics | Polychrome V | Ajustado para 540 nm microscópio de intensidade total |
| Carl Zeiss | Axiovert 100 | ||
| Obturador | Vincent Associates | VS25 | |
| Driver de obturador | Vincent Associates | VCM-D1 | |
| Vidro capilarries | Warner Instruments | G150F-3 | Capilares de borsilicato com extremidades polidas a fogo OD 1.5 mm ID 0.86 mm |
| Extrator de micropipetas | Sutter Instruments | P1000 | |
| Manipulador de banho | Lorenz Messgerä Conjunto de filtros de | MPCU | |
| Chroma | 69008 | Filtro de fluorescência ECFP/EYFP/mCherry | |
| Câmera CCD | Watec | Wat-221SCCD | |
| Optômetro | Gigahertz Optik | P9710 | Medir intensidades de luz |
| Objetivo | Carl Zeiss | 421462-9900-000 | W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC |
| Micromanipulador | Scientifica | PatchStar | |
| Câmara de gravação | Fonte de | sob | |
| Manson | HCS-3202 | Evita o ruído elétrico do microscópio fonte de alimentação embutida | |
| Mesa isolada por vibração | Newport | M-VW-3636-OPT-01 | |
| Gaiola de Faraday | Mesa de Faraday feita sob medida ou qualquer mesa | ||
| Mangueiras | Qualquer comercial; por exemplo, Roth | Diferentes tamanhos e materiais para manuseio de banho e aplicação de pressão de pipeta; pontes de ágar | |
| Linear agitador | Sunlab Instruments | SU 1000 | |
| Calculadora de potencial de junção líquida | Molecular Devices ou diretamente de Peter H. Barry | O programa está incluído no software de aquisição Clampex ou pode ser obtido em p.barry@unsw.edu.au | |
| Software de aquisição de dados | Molecular Devices | Clampex 10.X | |
| Software de avaliação de dados | Molecular Devices | Clampfit 10.X | |
| PsACR1 | GenBank ou Addgene | KF992074.1 ou Addgene plasmídeo #85465 | Codificação de gene para PsACR1 |
| Guia do amplificador | Dispositivos moleculares | O guia |
Referências
- Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Bruegmann, T., et al.
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Reimpressões e permissões
