Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Resumo

Este artigo descreve como a seletividade iônica da channelrodopsina é determinada com registros eletrofisiológicos de patch-clamp de células inteiras usando células HEK293. Aqui, o procedimento experimental para investigar a seletividade de cloreto de uma channelrodopsina seletiva de ânions é demonstrado. No entanto, o procedimento é transferível para outras canalrodopsinas de seletividade distinta.

Resumo

Ao longo da última década, os channelrhodopsins tornaram-se indispensáveis ​​na pesquisa neurocientífica onde eles são usados ​​como ferramentas para manipular não-invasivamente processos elétricos em células-alvo. Neste contexto, a selectividade iónica de uma canalrhodopsina é de particular importância. Este artigo descreve a investigação da seletividade de cloretos para uma canalrhodopsina de Proteomonas sulcata, condutora de aniões, recentemente identificada, por meio de gravações electrofisiológicas em células HEK293. O procedimento experimental para a medição de fotocorrentes de luz-gated exige uma fonte de luz rápida comutável - idealmente monocromática - acoplada ao microscópio de uma instalação de patch-clamp, de outra forma convencional. Os procedimentos preparativos antes da experiência são descritos envolvendo a preparação de soluções tamponadas, considerações sobre potenciais de junção de líquidos, semeadura e transfecção de células e puxar de pipetas de remendo. A gravação real da relação tensão-correnteS para determinar os potenciais de reversão para diferentes concentrações de cloreto ocorre 24 h a 48 h após a transfecção. Finalmente, os dados eletrofisiológicos são analisados ​​com respeito a considerações teóricas de condução de cloreto.

Introdução

Channelrhodopsins (ChR) são luz-gated canais iônicos que ocorrem na mancha do olho de algas verdes motile, e servem como fotossensores primários para phototaxis e respostas fóbicas [ ^1] . Desde sua primeira descrição em 2002 ² , os CHRs abriram o caminho para o campo emergente da optogenética e podem ser aplicados em uma variedade de células excitáveis, por exemplo, dentro dos músculos esqueléticos, do coração ou do cérebro ^{3 , 4 , 5} . A expressão de ChRs em células alvo resulta na permeabilidade iónica controlável pela luz da respectiva célula. Num contexto neuronal, isto permite a activação ^{6 , 7 , 8} ou inibição ^{9 , 10} de potencial de acção (AP) disparando - dependendo do ião conduzido - com o espaço e temporalPrecisão da luz enfatizando como a seletividade iónica de uma variante ChR determina sua aplicação optogenética.

Os primeiros ChRs descobertos de Chlamydomonas reinhardtii e Volvox carteri são permeáveis ​​aos prótons, mas também aos catiões monovalentes como o sódio, o potássio e, em menor grau, os catiões divalentes como o cálcio eo magnésio ^{11 , 12 , 13} . Actualmente, mais do que 70 canais de canal condutores naturais (CCR) ^{14 , 15 , 16 , 17} e várias variantes de engenharia ^{18 , 19 , 20} com propriedades diferentes tais como Tamanho da fotocorriente, sensibilidade espectral, cinética e selectividade catiónica. Considerando que em neurociência, CCRs aRe usado para ativar as células e disparar APs, bombas microbianas conduzidas pela luz foram os únicos antagonistas disponíveis para silenciar neurônios por anos. Em 2014, dois grupos demonstraram simultaneamente que os CCRs podem ser convertidos em canalrhodopsins condutores de aniões (ACRs) por alteração da polaridade ao longo do suposto poro de condução iónica através da engenharia molecular ^{9 , 21} . Subseqüentemente, os ACRs naturais foram identificados em várias algas criptofitas ^{22 , 23 , 24} . Mais importante ainda, a ativação de luz de ACRs medeia as correntes de cloreto em neurônios adultos permitindo a inibição da atividade neuronal em intensidades de luz muito menores do que as bombas microbianas que apenas transportam cargas únicas por fóton absorvido.

A actividade de ChR pode ser direccionada directamente por gravações electrofisiológicas de "patch-clamp" de correntes induzidas pela luz em células HEK293. O grampo de fixaçãoTécnica foi originalmente desenvolvida no final da década de 1970 ²⁵ e melhorada por Hamill et al. , Permitindo a gravação da entidade de correntes de uma célula pequena (modo célula inteira) com alta resolução de corrente e controle direto da tensão da membrana ²⁶ . Aplicada em cultura de células, esta técnica proporciona um controlo preciso das condições de gravação iónicas e eléctricas e permite estudar a selectividade dos iões juntamente com a contribuição relativa dos iões para a corrente total. Aqui, exemplificamos o exame da seletividade iónica para a canalrhodopsina condutora de ânions de Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) ^{22 , 23} através do registro das relações tensão-corrente em várias concentrações de cloreto extracelular para provar alta condutância ao cloreto.

Protocolo

Figura 1: Configuração do Patch-clamp. (1) fonte de luz, (2) fibra óptica, (3) obturador programável, (4) digitalizador, (5) obturador, (6) amplificador, (7) sistema de perfusão, (8) computador pessoal, , (10) gaiola faraday, (11) fase de microscópio, (12) entrada de perfusão, (13) saída de perfusão, (14) câmara de gravação, (15) (22) Microscópio invertido, (21) Microscópio lâmpada, (22) Lâmpada de microscópio fonte de alimentação, (23) água-cheio U-tubo, (24) de três vias Válvula, (25) tabela anti-vibração, (26) câmera CCD. ( A ) Fotografias e ( B ) representação esquemática da configuração. Clique aqui para ver uma versão maior do tSua figura.

1. Configuração antes das gravações

	Intra.	Extra.1	Extra.2
	Cloreto alto	Cloreto alto	Baixo teor de cloreto
	C [mM]	C [mM]	C [mM]
Na-ASP	0	0	140
NaCl	110	140	0
KCl	1	1	1
CsCl	1	1	1
CaCl2	2	2	2
MgCl2	2	2	2
HEPES	10	10	10
EGTA	10	0	0
PH	7,2	7,2	7,2
Osmolaridade	290 mOsm	320 mOsm	320 mOsm

Tabela 1: Composição Iónica das Soluções Tamponadas. Composição de tampões intracelulares (intra) e extracelulares (extra) para experiências de selectividade de cloreto em células HEK. Abreviaturas utilizadas: ácido etileno glicol tetraacético (EGTA), ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) e aspartato (ASP). Todas as concentrações estão em mM.

1. Preparar as soluções de gravação com concentrações iónicas como indicado na Tabela 1.
   1. Preparar 15 mL de soluções mãe 2 M em água ultrapura para MgCl2, CaCl2, KCl e CsCl.
   2. Pesar os componentes sólidos para 100 mL do intracelular e500 mL das solu�es tamponadas extracelulares de acordo com a tabela 1 em taças separadas e adiciona-se a quantidade respectiva das solu�es de reserva preparadas depois. Por exemplo, para o tampão intracelular, utilizar 0,3803 g (10 mM) de EGTA, 0,2383 g (10 mM) de HEPES e 0,6428 g (110 mM) de NaCl e adicionar 100 μL de 2 M MgCl2 e CaCl2 e 50 μL do Soluções mãe KCl 2 M e CsCl.
   3. Adicionar água ultrapura e ajustar cuidadosamente o pH utilizando ácidos e bases, que não interferem com a medição, ou seja , não são conduzidos pelo ChR, como ácido cítrico e N-metil-D-glucamina (NMG ⁺ ).
   4. Ajustar a osmolaridade para 290 mOsm para o intracelular e 320 mOsm para as soluções extracelulares com glicose.
      Nota: As soluções intracelulares ligeiramente hipoosmóticas aumentam a taxa de sucesso da aplicação de patches ²⁶ .
   5. Estéril filtra todas as soluções através de filtros de 0,22 μm. Armazenar as soluções a 4 ° C por duas semanasS ou congelar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.
2. Calcule os potenciais de junção de líquidos e prepare protocolos de gravação.
   NOTA: A alteração da concentração de cloreto extracelular após o estabelecimento da configuração de células inteiras causa um potencial de junção de líquidos significativo (LJP) que tem de ser corrigido ^{27 , 28} . Os LJPs podem ser diretamente medidos ou calculados, aqui a última opção é usada. Neste protocolo, a correção on-line será usada exigindo um protocolo de gravação para cada buffer externo. No entanto, para um conjunto maior de soluções externas é recomendada uma correção pós-LJP para evitar falsas correções.
   1. Abra a calculadora de junção potencial (JPC) ²⁷ e abra o diálogo 'New Experiment'. Em seguida, selecione "Medições de grampo-patch". Selecione "Medições de célula inteira", "Eletrodo de solução de sal padrão" e insira uma temperatura de25 ° C. Entre cada passo, vá para a frente, aceitando a seleção pressionando o botão "próximo".
      NOTA: As experiências são realizadas a uma temperatura ambiente de 25 ° C num laboratório com ar condicionado. Certifique-se de que as soluções tampão têm temperatura ambiente antes de iniciar as experiências. Para variar a temperatura da amostra pode utilizar-se uma fase ou câmara de incubação. A temperatura do banho pode ser medida com freqüência com um termômetro.
   2. Adicionar todas as concentrações individuais de aniões e catiões da solução pipetada eo tampão de cloreto alto de acordo com as concentrações listadas na Tabela 1 .
      NOTA: O JPC calculará um LJP de -0,5 mV para as condições de partida.
   3. Clique em "New Bath Solution" para introduzir a composição aniónica e catiónica do tampão de baixo teor de cloreto.
      NOTA: O JPC calcula agora um novo LJP de +12,6 mV de acordo com a solução de gravação extracelular alterada.
   4. Prepare dois protocolos corrigidos por LJP paraDuas condições de medição subtraindo o LJP calculado do potencial de retenção aplicado; -0,5 mV para o alto e +12,6 mV para as soluções de baixo teor de cloretos. Assim, os protocolos começam com -79,5 mV (cloreto alto) e -92,6 mV (baixo cloreto), respectivamente, para obter um potencial de retenção inicial corrigido de LJP de -80 mV em ambos os casos.
      NOTA: As etapas a seguir se aplicam ao software de aquisição de dados mencionado na lista de materiais.
   5. Abra o editor de protocolo no software de aquisição. Mude para o menu "Modo" selecione "Estimulação episódica" e incluir 7 varreduras.
   6. Mude para o menu "Waveform" no editor e inclua um período de 200 ms com potencial de retenção de 0 mV seguido de um período de 2 s com potencial de retenção variável começando em -79,5 mV para cloreto de alta. Inclua um "nível Delta" de 20 mV para o segundo período para aumentar o potencial de retenção em 20 mV em cada varredura.
   7. Dentro dos passos de tensão da forma de onda edOu aplicar um período de iluminação de 500 ms com luz de 540 nm (3,10 mW / mm²). Para fazer isso, altere o "padrão de bits digital" do obturador conectado que controla a fonte de luz a ser ativada 500 ms após o segundo período descrito acima (veja 1.2.6).
      NOTA: A intensidade da luz pode influenciar propriedades biofísicas de correntes de canal como amplitude ou inativação. Portanto, as densidades de potência de luz devem ser sempre relatadas. Para medir a potência da luz após passar por todas as ópticas e a lamela, use um optometro calibrado. Para calcular a densidade de potência, determine o campo iluminado do objetivo por um micrômetro de objeto e divida a potência de luz medida pelo campo iluminado determinado.
   8. Salve o protocolo para a solução extracelular de cloreto alto. Modifique o protocolo e substitua o potencial de retenção do primeiro nível por -92,6 mV (cloreto externo baixo). Salve este segundo protocolo para medir a baixa condição extracelular de cloreto.
3. Revestimento de lisina de cobertura de vidro conforme protocolo adaptado ²⁹ .
   1. Coloque várias 100 tampas em uma placa de Petri de vidro e adicione 250 mL de HCl (1 N).
   2. Colocar a placa de Petri com as tampas em um agitador linear e agitar a 120 rpm por 72 h para limpar as tampas e depois enxaguar com água ultrapura para neutralizar o pH.
   3. Mergulhe estes em um pequeno volume de 95% de etanol para limpeza adicional.
      NOTA: As tampas de cobertura limpas podem ser armazenadas em etanol a 70% antes de prosseguir. Trabalhe sob capa de fluxo laminar para os seguintes passos.
   4. Usando um queimador Bunsen e pinças, chama cada escorregar e transferi-lo para uma nova placa de Petri.
   5. Incubar os tampões de vidro com uma solução estéril de poli-D-lisina 50 μg / mL durante pelo menos 1 h (ou durante a noite) à temperatura ambiente enquanto se agita com um agitador linear a 150 rpm.
   6. Lave as tampas com água ultrapura para remover o excesso de poli-D-lisina.
   7. Espalhe as tampas em papel estéril para secar durante 10 min e exponha-as à luz UV para esterilização (pelo menos 20 minutos).
   8. Recolher as tampas em uma placa de Petri estéril coberto em folha de alumínio até o uso.
4. Preparar DNA do gene Ps ACR1 fundido a mCherry usando técnicas de biologia molecular padrão.
   1. Clonar a sequência do gene otimizado por codão humano que codifica Ps ACR1 num plasmídeo peGFP-C1 (promotor de CMV, resistência à kanamicina) em enquadramento com o fluoróforo mCherry utilizando enzimas de restrição ou outros métodos de clonagem estabelecidos.
      Nota: Outros fluoróforos podem ser usados ​​também, mas certifique-se de ter os correspondentes conjuntos de filtros disponíveis para observar sua fluorescência sob o microscópio na configuração.
   2. Transformar o ADN plasmídico em células de E. coli XL1Blue quimocompetentes através de choque térmico de acordo com o protocolo padrão e plaqueá-las em placas de ágar (30 μg / mL de canamicina) ³⁰
   3. No dia seguinte, inocular 4 mL de meio de caldo de lisogénese suplementado com 30 μg / mL de canamicina com células de colónias individuais e incubar durante a noite a 37 ° C e 180 rpm numa incubadora.
   4. Após incubação durante a noite, purificar o ADN plasmídico a partir das culturas utilizando um kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
5. Semear as células
   NOTA: Execute as etapas sob uma capa de fluxo laminar.
   1. Coloque até três revestimentos de vidro revestidos com lisina lado a lado em uma placa de Petri de 35 mm.
      NOTA: Pressione suavemente contra a parte inferior do prato para evitar que deslize uns nos outros.
   2. Semear 1,5 x IO5 células HEK em 2 mL de meio de Eagle Modificado Dulbecco padrão (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) em cada prato.
   3. Suplementar todos os trans- retinal emUma concentração final de 1 μM. Cultivar as células durante pelo menos um dia antes de prosseguir com o passo 1.6.
6. Transfecção transitória das células via lipofecção [ ^31] .
   1. Para cada placa de células, preparar uma solução de 2 μg de ADN plasmídico ( tal como preparado no passo 1.4) em 250 μL de DMEM sem FBS e 6 μL de reagente de transfecção (ver Tabela de Materiais ).
   2. Após 15 min de incubação, adiciona-se suavemente (gota a gota) a solução às células.
7. Preparar pontes de ágar
   1. Adicionar 0,75 g de agarose a 50 ml de solução de cloreto de sódio estéril (140 mM) e dissolvê-la por aquecimento num micro-ondas.
      NOTA: O KCl 2 - 3 M para a preparação da ponte de ágar reduz ainda mais a LJP devido à concentração mais elevada ( por exemplo, difusão constante a partir da ponte) e mobilidade igual dos iões K ⁺ e Cl ^- , mas foi evitada para minimizar o vazamento iónico Em t Solução de banho ³² .
   2. Encha 10 μL de pontas de pipeta (ou uma mangueira de pequeno diâmetro) com a solução de agarose líquida usando uma seringa.
      NOTA: Evite bolhas de ar na ponte.
   3. Depois de as pontes de ágar terem sido arrefecidas e solidificadas, armazená-las em solução estéril de cloreto de sódio 140 mM.
8. Prepare os eletrodos de gravação e banho.
   1. Remova fios de prata do banho e eletrodo de gravação da configuração de patch-clamp.
   2. Polir os fios com lixa para remover cloreto de prata de experiências anteriores. Mergulhe o fio de prata limpo em KCl 3 M e ligue-o ao pólo positivo de uma bateria de 1,5 V para revestimento electrolítico com cloreto de prata.
      NOTA: Uma fonte de alimentação do laboratório pode ser usada em vez de uma bateria.
9. Puxe as pipetas de patch de baixa resistência (1,5-3,0 MΩ) dos capilares de vidro com um extrator de micropipeta e polonês de fogo conforme descrito por Brown et alLass = "xref"> 33. Armazene pipetas sem poeira para o dia da medição.
10. Ligue todos os componentes de configuração para aquecer até a temperatura de trabalho 30 minutos antes gravações. Certifique-se de que os tampões estejam à temperatura ambiente.

2. Medições de seletividade

1. Iniciar as gravações 24 a 48 h após transfecção transitória das células descritas em 1.6.
2. Coloque uma tampa deslizante na câmara de medição e feche-a com silicone para evitar vazamento do tampão externo. Armazenar a placa de Petri com a outra tampa desliza em uma incubadora para o próximo conjunto de experiências.
3. Cuidadosamente preencher a câmara com tampão extracelular (alta [Cl ^- ]) para evitar a separação das células, em seguida, colocá-lo sob o microscópio e usar o objetivo 40X para a visualização celular.
4. Coloque uma ponte de ágar sobre o eletrodo de banho e coloque-o na câmara, juntamente com o sensor de nível de fluido ea saída de perfusão do manipulador do banho.
5. Troque o exTracelular duas vezes com 1 mL de solução externa fresca (alta [Cl ^- ]) para remover o meio de cultura residual e as células desprendidas.
6. Coloque as células em foco e procure por uma célula transfectada (fluorescente), que precisa ser isolada de outras células. Use um conjunto de filtros de banda tripla e luz laranja (590 nm, largura de banda 15 nm, 100% de intensidade) para excitar e visualizar mCherry.
   NOTA: As células HEK podem ser acopladas electricamente aos seus vizinhos por junções de intervalo ³⁴ resultando em baixa resistência à membrana na configuração de células inteiras.
7. Encha uma das pipetas com solução intracelular e remova as bolhas de ar, movendo a pipeta várias vezes.
8. Monte a pipeta no suporte da pipeta e aplique alguma pressão positiva para impedir o entupimento da ponta.
9. Localize a ponta da pipeta de remendo sob o microscópio e navegue perto da célula usando o micromanipulador.
   NOTA: As etapas a seguir se aplicam ao aMplifier, aquisição de dados e software de avaliação mencionados na lista de materiais.
10. Iniciar o "teste de membrana" no software de aquisição de dados e aplicar um passo de tensão ( por exemplo, 5 mV por 10 ms, linha de base a 0 mV), manual ou automaticamente através do software especificado usando "modo de banho" No software de aquisição de dados.
11. Verifique se a resistência da pipeta está na faixa desejada (1,5-3,0 MΩ).
12. Correntes de desvio zero ajustando o potencial da pipeta rodando o botão de deslocamento da pipeta no amplificador enquanto trabalha no "modo de banho" do "teste de membrana".
13. Estabeleça um patch na configuração de células inteiras ²⁶ .
    NOTA: As etapas a seguir requerem a aplicação de pressão positiva e negativa entregue na porta lateral do suporte de pipeta usado. Isto pode ser feito usando uma seringa, através de uma boca ou um eletronicamente conRegulador de pressão controlado. Neste protocolo, a pressão positiva e negativa é aplicada através de uma peça bucal.
    1. Lentamente aproximar a célula com a pipeta patch a partir do topo e aliviar a pressão positiva direita antes de tocá-lo.
       NOTA: Quando a ponta está perto da célula, a resistência aumentará ligeiramente; Isto é indicado por um tamanho reduzido do impulso de teste.
    2. Mude o "teste de membrana" de "modo de banho" para "modo de remendo", assim, o potencial de retenção para o potencial de repouso esperado das células (-30 a -40 mV).
    3. Em alguns casos, a configuração ligada às células forma-se após a libertação da pressão positiva (2.13.1), se não, aplicar suavemente pressão negativa para auxiliar a formação de gigase.
       NOTA: A configuração ligada à célula é estabelecida quando o impulso de teste é reduzido a dois pequenos picos capacitivos no início e fim do impulso ea resistência da membrana está na gama GΩ; Tensões negativas até -60 mV mPode facilitar a formação de gigase.
    4. Compensar a capacitância da pipeta girando os botões de "compensação da capacitância da pipeta" para obter uma resposta plana do pulso de teste.
    5. Rupture o remendo sem destruir o selo aplicando pulsos curtos da pressão negativa ou da pressão negativa com força crescente, para obter a conformação da pilha inteira.
       NOTA: A transição bem sucedida da configuração célula-anexada para célula inteira é indicada por um aumento dos picos capacitivos.
    6. Aplique compensação de resistência em série ajustando parâmetros de célula inteira e ajustes de compensação do amplificador usado para aperto preciso do potencial de membrana para a tensão de retenção desejada.
       1. Alternar o "teste de membrana" para "célula inteira" modo, no painel "Compensação de resistência série" ativar "previsão" e "correção" até 90% evitando overshots e oscilação da resposta capacitiva, transformar a célula inteiraA compensação liga e ajusta os parâmetros de célula inteira com os botões apropriados do painel frontal ("capacidade de célula inteira" e "resistência em série") do amplificador de uma maneira iterativa para obter uma resposta de vedação de teste idealmente plana.
          NOTA: Para uma descrição detalhada da compensação e correção da resistência da série, consulte o manual ou diretriz do amplificador, pois este procedimento varia entre diferentes fabricantes.
    7. Depois de estabelecer a configuração de células inteiras, aguarde pelo menos 2 minutos antes da gravação para assegurar a substituição suficiente da solução intracelular através da pipeta de remendo ³⁵ .
14. Registre as correntes induzidas pela luz em diferentes potenciais de retenção usando os protocolos que foram configurados anteriormente (em 1.2).
15. Troque o tampão extracelular para baixo [Cl ^- ] na câmara pelo menos cinco vezes sem destruir o remendo e registrar outra relação tensão-corrente ( ver etapa 1.2) em tNova concentração de cloreto.
    NOTA: Um sistema de perfusão para troca automática de tampão facilita este processo, mas não é necessário.
16. Repita 2.15. Para cada condição iónica a ser testada, mas verifica repetidamente a qualidade do adesivo entre as medições por um "teste de membrana" descrito acima.
    NOTA: Para garantir tensão de membrana precisa e composição de íons intracelular estável, a resistência da membrana deve ser acima de 500 MΩ, enquanto a resistência de acesso não deve ultrapassar 10 MΩ, veja . 2.12.6). Não se esqueça de desligar a compensação do parâmetro da célula inteira para o teste de membrana.
17. Repetir 2.2. A 2,15. Para várias células, mas tomar uma nova capa para cada série de teste para garantir a salubridade das células.

3. Avaliação de dados

1. Ajuste a linha de base de cada traço corrente subtraindo a corrente média antes da iluminação.
2. Calcular a fotocorrente estacionária média I _s ( NOTA: Analise as fotocorrentes de pico ou varie o comprimento da média para determinar a fotocorrente estacionária dependendo do protocolo ou questão científica.
3. Repita os passos 3.1) e 3.2) para todas as condições testadas e células diferentes.
4. Trace as fotocorrentes determinadas em relação ao respectivo potencial de retenção.
   NOTA: Se medições múltiplas são médias, gravações individuais podem ser normalizadas para uma condição especificada ou a capacitância da célula.
5. A intersecção da relação tensão-corrente com o eixo de tensão representa o potencial de reversão (corrente líquida é zero). Determine-o por interpolação linear entre os dois pontos de dados vizinhos.
   NOTA: Se não houver inversão de polaridade das fotocorrentes, extrapole linearmente a partir dos dois últimos pontos próximos de zero para obter uma aproximação do ponto de intersecção.
6. Média do r determinadoPara as mesmas condições e traçá-las em relação à concentração de cloreto das soluções tampão externas ( ver Figura 2B ).

Resultados

A Figura 2 mostra resultados representativos obtidos a partir de medições seguindo o protocolo descrito. Durante a iluminação com luz verde, Ps ACR1 apresenta uma corrente transitória rápida que decai rapidamente para um nível de corrente estacionária. Depois que a luz é desligada, as fotocorrentes decaem para zero em milissegundos ( Figura 2A ). A troca da concentração de cloreto extracelular provoca um deslocamento do potencial de inversão que...

Discussão

A determinação de potenciais de reversão em condições iónicas e elétricas definidas fornece informações sobre a espécie de íons transportada após a ativação leve de ChRs. Se exclusivamente uma espécie de iões é variada num meio fisiológico complexo e o potencial de reversão obtido se desloque de acordo com o potencial teórico de Nernst, esta espécie de iões é a única transportada.

No entanto, para ChRs, reversão potenciais turnos são geralmente menos pronunciada do que o esperado a partir da...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células HEK293	Sigma Aldrich	85120602	Células renais embrionárias humanas
	Retinal Sigma Aldrich	R2500	totalmente trans retinal
FuGENE HD	Promega	E2312	Reagente de transfecção
DMEM	Biochrome	FG 0445	Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose	Roth	3810	Pontes de ágar
CaCl2	Roth	5239	CaCl2 2H2O
CsCl		Biomol 2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	Cultura de células
Glicose	Roth	HN06	D(+)-Glicose
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2 6H2O
NaCl		Roth 3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-Metil-D-glucamina
Na-Aspartato	Sigma Aldrich	A6683	Sal de sódio do ácido L-aspártico monohidratado
Ácido cítrico	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	Enzima de restrição
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	Enzima de restrição
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	Enzima de restrição
XL1Blue E. coli	Agilent Technologies	200249	Quimioterapia competente E. coli
Kanamicina	Roth	T832
Caldo de lisogenia médio	Roth	X964
Ágar-Ágar	Roth	6494	Placas de ágar
Kit de purificação de plasmídeo	Marchery-Nagel	740727.25
Penicilina/Estreptomicina	Biocromo	A 2213	Cultura de células
Bromidrato de poli-D-lisina	Sigma Aldrich	P6407-5MG	Revestimento de lamínula
Microforge	Pipetas serológicas de	polimento de fogo
	TPP		Diferentes tamanhos
Bancada limpa	Kojair	Biowizard SL130
Agitador	IKA	RCT clássico
Fio de prata	Produtos científicos	AG-T25; AG-T10	Eléctrodos, 0,64 mm (banho); 0,25 mm (eléctrodo)
medidor de pH	Knick	765 Osmómetro Calimétrico
	Vogel	OM 815
Microscópio	Carl Zeiss	ID03	Polimento a fogo
Incubadora de CO2	Binder	CB150
Placas de cultura de células	TPP	93040	34 mm internas Termômetro
	Roth	P232	15 mm de diâmetro
	ssel Messtechnik	MTM12
Beamsplitter	Chroma	21011	90/10 suporte
pipeta	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage	Molecular Devices	CV203BU
Amplificador	Molecular Dispositivos Moleculares	AxoPatch200B
Digitizer	Molecular Devices	DigiData1400	Conversor analógico digital
Fonte de luz	TILL Photonics	Polychrome V	Ajustado para 540 nm microscópio de intensidade total
	Carl Zeiss	Axiovert 100
Obturador	Vincent Associates	VS25
Driver de obturador	Vincent Associates	VCM-D1
Vidro capilarries	Warner Instruments	G150F-3	Capilares de borsilicato com extremidades polidas a fogo OD 1.5 mm ID  0.86 mm
Extrator de micropipetas	Sutter Instruments	P1000
Manipulador de banho	Lorenz Messgerä Conjunto de filtros de	MPCU
	Chroma	69008	Filtro de fluorescência  ECFP/EYFP/mCherry
Câmera CCD	Watec	Wat-221SCCD
Optômetro	Gigahertz Optik	P9710	Medir intensidades de luz
Objetivo	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Micromanipulador	Scientifica	PatchStar
Câmara de gravação	Fonte de		sob
	Manson	HCS-3202	Evita o ruído elétrico do microscópio fonte de alimentação embutida
Mesa isolada por vibração	Newport	M-VW-3636-OPT-01
Gaiola de Faraday	Mesa de Faraday feita sob medida ou qualquer mesa
Mangueiras	Qualquer comercial; por exemplo, Roth		Diferentes tamanhos e materiais para manuseio de banho e aplicação de pressão de pipeta; pontes de ágar
Linear agitador	Sunlab Instruments	SU 1000
Calculadora de potencial de junção líquida	Molecular Devices ou diretamente de Peter H. Barry		O programa está incluído no software de aquisição Clampex ou pode ser obtido em  p.barry@unsw.edu.au
Software de aquisição de dados	Molecular Devices	Clampex 10.X
Software de avaliação de dados	Molecular Devices	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank ou Addgene	KF992074.1 ou Addgene plasmídeo #85465	Codificação de gene para PsACR1
Guia do amplificador	Dispositivos moleculares	O guia