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Artigo de método

zebrafish

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DOI:

10.3791/55507

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18 de abril de 2017

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC), 2Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC)

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

Resumo

Peixe-zebra, introduzido pela primeira vez como um modelo de desenvolvimento, ganharam popularidade em muitos outros campos. A facilidade de criação de um grande número de organismos em rápido desenvolvimento, combinada com a clareza óptica embrionário, serviu como atributos atraentes iniciais deste modelo. Ao longo das últimas duas décadas, o sucesso deste modelo foi ainda mais impulsionado por sua receptividade às telas de mutagênese em larga escala e pela facilidade de transgenia. Mais recentemente, de edição de gene abordagens ter aumentado a potência do modelo.

Para os estudos do neurodesenvolvimento, o embrião do peixe-zebra e larva de fornecer um modelo para que vários métodos podem ser aplicados. Aqui, vamos nos concentrar em métodos que permitem o estudo de uma propriedade essencial de neurônios, excitabilidade elétrica. A nossa preparação para o estudo electrofisiológico de neurónios espinais zebrafish envolve o uso de cola veterinário de sutura para fixar a preparação para uma câmara de registo. Métodos alternativos para gravaçãoa partir de embriões de peixe-zebra e larvas envolver a fixação da preparação para a câmara utilizando um pino fina de tungsténio de 1, 2, 3, 4, 5. Um pino de tungsténio é mais frequentemente usado para montar a preparação de uma orientação lateral, embora tenha sido usado para montar dorso-lateral larvas até 4. A cola de sutura tem sido utilizado para montar os embriões e larvas em ambas as orientações. Usando a cola, uma dissecção mínima pode ser realizada, permitindo o acesso a neurónios espinais sem o uso de um tratamento enzimático, evitando assim qualquer dano resultante. No entanto, para as larvas, é necessário aplicar um breve tratamento com enzima para remover o tecido muscular em torno da medula espinhal. Os métodos aqui descritos têm sido utilizados para estudar as propriedades eléctricas intrínsecas de neurónios motores, interneurónios, e neurónios sensoriais em vários DevelopmentAl módulos 6, 7, 8, 9.

Introdução

George Streisinger pioneira no uso de Danio rerio, vulgarmente conhecido como peixe-zebra, como um sistema modelo para a análise genética do desenvolvimento dos vertebrados 10. O modelo oferece várias vantagens, incluindo: (1) criação de animais relativamente simples e de baixo custo; (2) a fertilização externa, permitindo um acesso fácil aos embriões desde os primeiros estádios de desenvolvimento; e (3) um embrião transparente, permitindo observações directas e repetidas de células, tecidos e órgãos, como eles formam.

Ao longo das décadas que se seguiram, vários avanços aumentou ainda mais o poder do modelo peixe-zebra. Em particular, telas genéticos para a frente e os esforços de sequenciação de todo o genoma desempenharam um papel-chave na identificação de mutações e genes críticos para muitos processos de desenvolvimento 11, 12, 13, 14,"> 15, os métodos de clonagem 16. Gateway permitiram a aplicação de rotina transgénico se aproxima de 17, 18. Recentes avanços na edição genoma, exemplificado pelo activador da transcrição do tipo (TALENS) e agrupados repete regularmente interspaced curtas palindrómicos (CRISPR) -Cas9 nucleases, permitir a introdução alvo de mutações, bem como knock-out e knock-in se aproxima de 19, 20, 21, 22. Combinada, estes métodos fazem peixe-zebra um poderoso modelo para o estudo dos mecanismos genéticos subjacentes comportamentos específicos e várias doenças humanas 23, 24, 25, 26, 27.

Este trabalho se concentra em desenvolverregulação mental e o papel da atividade elétrica no desenvolvimento neuronal. O foco é sobre a medula espinal, para os quais o modelo de peixe-zebra proporciona várias vantagens. Em primeiro lugar, é relativamente fácil de acessar peixe-zebra em estágios embrionários e larval; portanto, pode-se estudar a função da medula espinal durante os estágios de desenvolvimento que têm menos neurónios e circuitos mais simples 28, 29. Além disso, a espinal medula de peixe-zebra tem um conjunto diversificado de neurónios, semelhante a outros vertebrados, como demonstrou padrões característicos e distintivas de factores de transcrição 30, 31, 32, 33, 34, 35.

A maioria dos estudos em peixes-zebra que têm como objectivo de desvendar os mecanismos subjacentes à função de circuitos da medula espinhal, especialmenteaqueles que suportam a locomoção, são compreensivelmente focada em estágios larvais 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. No entanto, muitos dos neurónios que formam as redes locomotiva espinhais iniciar a sua diferenciação em estágios embrionários iniciais, ~ 9-10 h pós-fertilização (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Em vista disso, a compreensão de como as propriedades morfológicas e eléctricas dos neurónios espinais e surgem alterações entre os estágios embrionários e larval é importante para uma overacompreensão ll de formação e função circuito locomotor.

Os métodos aqui descritos permitem dissecção gravações de patch clamp de neurónios espinais e têm sido aplicados com sucesso em estágios embrionários (~ 17-48 HPF) e as fases larvares (~ 3-7 dias após a fertilização [dpf]). Esta abordagem limita a quantidade de dissecção requerida para fornecer acesso aos neurônios de interesse. O protocolo difere da maioria dos outros métodos publicados para a gravação de neurónios espinais zebrafish em que a cola veterinário sutura é utilizado, em vez de um pino de tungsténio finos, para fixar o embrião ou larva para a câmara de registo. A disponibilidade de duas abordagens diferentes (isto é, cola de sutura contra o pino de tungsténio) para a montagem dos embriões de peixe-zebra ou larvas para análise electrofisiológica fornece investigadores com opções alternativas para alcançar os seus objectivos específicos experimentais.

Em primeiro lugar, os procedimentos para acessar e gravar a partir de um pop ulação de neurónios sensoriais primários, células Rohon-Beard, são descritos. Os corpos celulares destes neurónios se encontram dentro da espinal medula dorsal. Existem células Rohon-Beard em numerosas espécies de vertebrados, diferenciar no início do desenvolvimento, e estão subjacentes à resposta ao toque embrionário 6, 44, 47, 48.

Em segundo lugar, os procedimentos de acesso e gravação de neurónios motores espinais são detalhados. Zebrafish neurónios motores espinais surgir durante duas ondas de neurogese. Os neurónios motores primários anterior-nascidos surgem no final da gastrulação (~ 9-16 HPF), com apenas 3-4 neurónios motores primária presentes por hemisegmento 45, 46, 49. Em contraste, a população depois-nascido de neurónios motores secundários é mais numerosos e surge durante um período prolongado, a partir das ~ 14 hpfef "> 45, 50. Secundário neurônio motor gênese nos segmentos mid-tronco é principalmente concluída até 51 hpf 50. neurônios motores secundários são considerados a contrapartida dos neurônios motores em amniotes 46. Curiosamente, os neurônios supraespinhais, via dopamina, regular locomoção na larva e motor secundário neurónio génese no embrião e jovem larva 50, 51. neurónios motores primários e secundários compreendem cada um vários subtipos diferentes. cada motor primário projectos neurónio subtipo a de axónios periférica que inerva um grupo muscular característico, resultando em um estereotipada, identificar trajectória axonal. Geralmente, os neurónios motores secundários seguir as vias axonais previamente estabelecidos por neurónios motores primários. Assim, no que diz respeito a trajectórias axonal, os neurónios motores primária e secundária são semelhantes, com a excepção de que a espessura axonal e uma somata tamanhore maior para os neurónios motores primários 45.

Em terceiro lugar, são discutidos métodos para gravação de alguns tipos de interneurônios. No entanto, nestes casos, é necessária uma limitada quantidade de remoção de outras células do cordão espinal, e, assim, a medula espinal é menos intacta do que para as gravações de células Rohon-barba ou neurónios motores.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC; Office of Laboratory Animal Resources, Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus).

1. Zebrafish Husbandry

  1. Aumentar e manter o peixe-zebra adulto (Danio rerio) a 28,5 ° C em um / 14 h ciclo de luz de 10 h de escuro e com tratamento de água apropriado e troca 52.
  2. Elevar zebrafish embriões / larvas a 28,5 ° C em meio de embriões até que atinjam a fase desejado (por exemplo, 2 dpf).

2. Preparação de Dissecção Materiais

  1. Dispensador de cola para dissecção peixe-zebra
    NOTA: Este protocolo envolve o uso de cola veterinário de sutura para fixar a preparação para a câmara de registo. O uso bem sucedido da cola sutura requer a aplicação de pequenas quantidades de cola de uma maneira controlada. A cola começa a endurecer assim queencontra um ambiente aquoso. Por conseguinte, extrair a cola para uma micropipeta e entregar pequenas quantidades, utilizando um "dispensador de cola" caseiro que permite a aplicação de pressão negativa ou positiva, por via oral. A parte central do distribuidor de cola é um furo de vidro, uma parte que está incluído no interior da embalagem que contém os de parede fina capilares de vidro de borosilicato (Figura 1A). De um lado, o furo está ligada através de um pedaço de tubo flexível a um bocal, enquanto a outra extremidade segura a micropipeta de vidro (Figura 1).
    1. Remover o bulbo de um furo de vidro e substituí-lo com o adaptador de borracha branca a partir de um outro furo de vidro (Figura 1B e 1C).
      NOTA: Este furo de vidro duplo com tampa de adaptador permite a conexão com uma micropipeta de vidro em uma extremidade e, na outra extremidade, a um pedaço de tubo flexível através de um pequeno, encaixe de polipropileno linear (Figura 1B, inserção).
    2. Corte um pedaço de tubo flexível com um comprimento de 38 cm ~. Anexar o bocal (por exemplo, um amarelo 200 uL ponta da micropipeta) à extremidade da tubagem flexível não está ligado ao furo de vidro.
      NOTA: O pedaço de tubo deve ser suficientemente longo para permitir a manipulação da micropipeta de vidro sob um escopo de dissecação, enquanto a ponta da micropipeta amarelo é na boca (Figura 1D).

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Figura 1: dispensador de cola. Furo (AC) Um vidro liga a tubagem flexível numa extremidade e a micropipeta de vidro no outro. Os adaptadores de borracha permitir a ligação por meio de um pequeno ajuste de polipropileno (B, inserir) para o tubo e, finalmente, para uma micropipeta de vidro na outra extremidade. (D) O dispensador de cola final tem um bocal (por exemplo, feita a partir de um plastic ponta de pipeta), a uma extremidade da tubagem e o furo de vidro com a micropipeta ligada na outra (ponta de seta).

  1. Dissecção / câmara de gravação
    NOTA: A câmara de dissecção também serve como câmara de gravação electrofisiologia. A câmara é formada sobre uma lâmina de vidro usando peças pré-cortadas de elastómero de silicone curado (Figura 2A).
    1. Para preparar o elastómero de silicone, adicionar a base e o agente de cura para um tubo cónico de plástico em uma proporção de 4: 1, respectivamente.
    2. Misture a base de elastómero e o agente de cura completamente e derramar a mistura em duas placas de Petri de 100 milímetros. Verter o elastómero com uma espessura de <1 mm de uma placa de Petri e ~ 2,5 mm na outra.
    3. Permitir que o elastómero de silicone de cura por exposição ao ar durante ~ 4-5 dias. Se elastómero curado é necessária mais cedo, incubar-lo a 60 ° C.
    4. Cortar pedaços do elastómero de silicone curado com os seguintes tamanhos:
      1. Do ~ 1 milímetro-grossa elastómero curado, cortar um ~ 3,8 x 6,3 centímetros rectângulo; esta peça serve como a parte inferior da câmara (Figura 2A). A partir do silicone curado é aproximadamente de 2,5 mm de espessura, cortar um rectângulo ~ 3,8 x 6,3 centímetros. A partir da última rectângulo, cortar um rectângulo interno ~ 2,5 x 5 cm; a estrutura resultante serve como a parte superior da câmara (Figura 2A).
    5. Para fazer o / câmara de gravação de dissecção, colocar o rectângulo de silicone fino directamente no topo de uma lâmina de vidro (5 x 7,6 cm), certificando-se para remover quaisquer bolhas de ar entre o silicone e o vidro (Figura 2A). Colocar a moldura de silicone rectângulo, cortadas a partir do elastómero mais espesso, no topo da camada de fundo fino de silicone.
    6. Verificar que as camadas de silicone anexar bem uns com os outros e de que não existem bolhas de ar entre as duas camadas (Figura 2A).
    7. Após o uso, a câmara de desmontar através da remoção do quadro rectângulo de silicone de espessura a partir da postura de silicone inferiorer que está ligado à lâmina de vidro. Lavam-se as superfícies de silicone com ddH2O antes de usar e depois de cada sessão de gravação e seco com toalhetes baixo fiapos.
    8. Armazenar a seco câmara para impedir o crescimento de fungos entre as duas peças de silicone.
      NOTA: Se se utilizarem toxinas ou agentes farmacológicos que não pode lavar facilmente a partir de silicone, dedicar câmaras específicos para essas finalidades.

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Figura 2: câmara de Electrofisiologia e ferramentas de dissecação. (A) A câmara utilizada para as dissecações e registos electrofisiolicos consiste de uma lâmina de vidro sobre o qual são colocadas duas peças de elastómero de silicone curado, em camadas em cima uma da outra para proporcionar uma armação e uma parte inferior para um poço. O tamanho do poço, ~ 2,5 x 5 cm, permite a utilização de pequenos volumes (2-2,5 mL) de registo extracelularsolução. A camada de silicone de fundo permite um posicionamento seguro do embrião utilizando adesivo de tecido de peixe-zebra que não adere ao vidro. (B) uma micropipeta de vidro (topo) é usado para entrega de cola durante a dissecção. O vidro de parede fina é puxado para criar uma extremidade longa, afunilada que é mais tarde cortada, a criação de uma ponta com um diâmetro de ~ 75? M. A micropipeta de vidro cónico está ligado à extremidade livre do distribuidor de cola (Figura 1D, ponta de seta) e frente-enchido com cola, através da aplicação de sucção. A outra micropipeta (inferior), como puxado para uma usado para uma gravação de patch-clamp, é usado para o corte transversal da parte posterior do cérebro e para a remoção da pele. (C) Sob um microscópio vertical, um micromanipulador é utilizado para manobrar o micropipeta para os passos finais de dissecação. A micropipeta de vidro, como em B, parte inferior, está ligada ao suporte de eléctrodo (seta). remoção muscular é conseguido por umpplying sucção através do tubo ligado à saída de ar (ponta de seta). Na sua outra extremidade, o tubo liga a uma torneira de passagem (seta preta) que, no seu outro lado (asterisco), tem tubo ligado a um bocal.

3. Dissecção de Embriões e larvas de gravações de patch-clamp de espinal Neurons

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Figura 3: dissecção dorsal de uma medula espinal peixe-zebra. (AA'), após a transecção rombencéfalo (a) de um embrião de 2 dpf, a pele é cortada nos lados esquerdo e direito do embrião (b). Um segundo corte, perpendicular à primeira, é então executado (c). Em seguida, a pele é levantada usando uma micropipeta, permitindo uma pinça para agarrar e puxar longe da pele. (B) A remoção da pele expõe a medula espinal dorsal. Rostral à linha preta, o esquin foi removido e a superfície da medula espinhal (asterisco), contido no interior das meninges, está exposta. A pele permanece intacta caudal para a linha preta (seta). (CC') A ponta da micropipeta de vidro é pressionado sobre as meninges, e rápidas, movimentos laterais curtas, são realizadas para perfurar as meninges. (DD e EE ') Uma vez que as meninges são perfuradas (DD '), a micropipeta é avançada e (EE') movido rostral para rasgar as meninges em dois segmentos. O somata de neurónios Rohon-Beard tipicamente surgem após a remoção das meninges (seta). (FG') Em uma larva 7-dpf, camadas de músculo cobrir o aspecto dorsal da medula espinal, dificultando o acesso aos neurónios Rohon-barba. Após a remoção da pele, a larva é tratada com 0,05% de colagenase. (F) Uma incubação de 5 min com 0,05% de colagenase é muito rigorosas, resultandoem dano muscular excessiva, tal como evidenciado pelo músculo desgastado (seta e baixo-relevo). (F') de tratamento de colagenase excessiva pode também danificar os neurónios Rohon-barba (seta), revelada aqui pela sua expressão de GFP no Tg (islet2b: gfp) linha. No Tg (islet2b: gfp) linha, os neurónios do gânglio da raiz dorsal, também expressam GFP (ponta de seta). Uma breve 1 min de incubação com 0,05% de colagenase suficientemente solta o músculo (L), enquanto conserva a morfologia miótomo (seta e baixo-relevo). Células de pigmento (L') estão presentes na parte superior da camada de músculo mais dorsal (ponta de seta). (H e I) no Tg (islet2b: gfp) linha, neurónios Rohon-barba (setas) e o gânglio da raiz dorsal (ponta de seta) continuam a expressar a GFP em 7 dpf. Dorsal vistas de Tg (islet2b: gfp) embriões de peixe-zebra em 2 dpf (H) umd 7 dpf (I). Em barras Painel A Escala = 500 um; SER (mostrado no painel B) Escala barras = 80 um; F 'e G' (mostrado no painel F) Escala barras = 200? M; H e I (mostrado no painel H) Escala barras = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Dissecação de embriões de gravações de células Rohon-Beard
    1. Coloque um embrião numa câmara de dissecção contendo ~ 2-3 ml de solução de Ringer (Figura 2A). Imobilizar o embrião por adição de ~ 100 mL de solução de tricaina 0,4% para a câmara.
    2. Puxar micropipetas de vidro de parede fina sobre uma micropipeta extrator utilizando um filamento de caixa para se obter um longo, ponta fina, semelhante a uma micropipeta de injecção (Figura 2B, em cima) 53.
    3. Anexar a micropipeta de vidro puxado para o furo de vidro of o dispensador de cola. Sob o microscópio de dissecação, use uma pinça para quebrar a ponta da micropipeta de vidro de modo a que a ponta é ~ 75 m (Figura 2B, em cima).
      NOTA: O tamanho da ponta deve ser suficientemente grande para permitir o carregamento eficiente da cola na ponta, através da aplicação de pressão negativa (sucção boca) para frente-preencher a micropipeta, mas suficientemente pequeno para permitir a aplicação precisa da cola por meio de pressão positiva .
    4. Carregar o micropipeta de vidro com ~ 3-5 uL de cola por aplicação de sucção através do bocal. Trazer a ponta cheio de cola para a câmara de dissecção.
      NOTA: Encher a micropipeta com cola requer sucção forte. Se a micropipeta enche rapidamente com sucção fraca, a ponta é muito grande.
    5. Coloque o embrião na câmara de gravação (Figura 3A e 3A'); para gravações de embriões e larvas jovens (≤72 HPF), não há necessidade de remover o tecido muscular.
    6. Trazera ponta da micropipeta carregado-cola perto da cabeça do embrião / larva, mantendo a pressão positiva leve para a micropipeta através do tubo de boca (para impedir a entrada de solução aquosa). Uma vez que a ponta está perto do cabeça do embrião, aplicar pressão positiva suficiente para expelir uma pequena gota de cola sobre a parte inferior da câmara.
      NOTA: A cola endurece uma vez em contacto com a solução aquosa, por isso, é importante aplicar e manter a pressão positiva leve, uma vez que é colocado na solução de dissecção.
    7. Usar uma ferramenta de dissecação pino para mover o embrião / larva no sentido da gota de cola de modo a que a cabeça faz contacto com a cola. Orientar o dorso-lateral embrião se e pressione sobre a cabeça para assegurar um bom contacto com a cola.
    8. À medida que a cola endurece lentamente, utilizar o pino de dissecação para reposicionar o embrião / larva de modo que se encontre do lado ventral para baixo, do lado dorsal para cima. Mergulhar a ferramenta de dissecação pin para a gota de cola e desenhar fios da cola ao longo e através da cabeçado embrião para garantir ainda mais a sua posição.
      NOTA: tricaina acelera a taxa em que a cola endurece. Para permitir mais tempo para trabalhar com a cola, utilizar a quantidade mínima de tricaina necessária para imobilizar o embrião / larva. Além disso, a taxa de endurecimento pode variar com diferentes lotes de cola. Por conseguinte, quando se utiliza um novo lote de cola, determinar a sua velocidade de endurecimento antes de o utilizar para dissecção.
    9. Uma vez que a cabeça está firmemente ligado ao silicone e a cola ter solidificado, sacrificar o embrião / larva por transecção ao nível do encéfalo posterior com outra micropipeta de vidro (Figura 3A- um e 4A- um).
      NOTA: transecção rombencéfalo é o método que é usado aqui para o sacrifício animal humano. No entanto, dependendo dos objectivos experimentais (por exemplo, o estudo de natação fictício), pode ser necessário um outro método.
    10. Antes de fixar a cauda para a câmara, retire a pele do tronco.
      1. Usaruma micropipeta de vidro fresco (Figura 2B, fundo) para cortar a pele superficialmente várias vezes numa posição caudal em relação ao cérebro posterior (Figura 3A- b e 4A- b). Pierce a pele superficialmente ao mover a pipeta perpendicular ao eixo rostro-caudal em cada lado do tronco para dorsalmente montados espécimes (Figura 3A- b) ou no lado exposto do tronco para os espécimes montados lateralmente (Figura 4A- B).
    11. Para criar uma aba de pele por pinça para agarrar, raspar a pele várias vezes com a micropipeta no nível de e perpendicularmente ao corte inicial no passo 3.1.10.1 (Figura 3A- C e 4A- c).
    12. Usando pinças, gradualmente levantar a aba de pele e puxar a pele caudalmente.
      NOTA: Isso muitas vezes resulta na remoção da totalidade da pele do tronco. No entanto, é SOMETImes necessárias para remover a pele em várias secções efectuando reiterado raspagem e puxar da pele. Para algumas aplicações, a remoção parcial da pele pode permitir um acesso suficiente para os segmentos da medula espinhal de interesse (Figuras 3B e 4B).
    13. Entregar uma pequena gota de cola perto da cauda do embrião / larva. Use esta cola para fixar a cauda para o fundo da câmara de dissecção. Durante esta etapa, tal como a cola endurece, ajustar a posição do tronco, com a ferramenta de dissecação pino para assegurar que o tronco permanece orientada dorsalmente e que está firmemente ligado à câmara.
    14. Seguindo esta dissecção inicial, enxaguar a preparação extensivamente com solução de Ringer para remover tricaina e detritos. Permitir que a preparação em repouso durante ~ 5 min.
    15. Substitua a solução de dissecção com solução de gravação extracelular. Se necessário, adicionar um agente imobilizante para a preparao (por ex., Α-bungarotoxina [conce definitivantration de 1 uM]).
      Nota: 1 uM α-bungarotoxina imobiliza 1-2 dpf embriões dentro de ~ 30 min. Para larvas mais velha, pode ser necessária uma concentração mais elevada de α-bungarotoxina. a-bungarotoxina é mantida na solução de banho durante a gravação, que são tipicamente realizadas dentro de um período de 1 h. soluções de gravação que contêm catiões bivalentes, tais como cobalto, que não requerem a adição de um agente imobilizante. Para as experiências que requerem períodos de gravação prolongados (mais de 1 h), a preparação é perfundido com uma solução de banho a uma taxa de 0,5-1 mL / min.
    16. Mover a câmara de dissecção com o embrião montado na platina de um microscópio composto vertical equipado com uma objectiva de longa distância de trabalho 40X-imersão em água.
      NOTA: Este microscópio faz parte da plataforma onde as gravações serão realizados. A sonda também deve ser equipado com um andar de entrada, um amplificador de patch-clamp, um micromanipulador, e um sistema de aquisição de dados / computador (Figura 2C).
    17. Montar um borosilicato vazio de paredes espessas micropipeta de vidro no suporte de eléctrodo do andar de entrada (Figuras 2B, 2C e inferior, seta). Prenda o tubo (diâmetro interno: 0,16 cm, diâmetro externo: 0,32 cm, e comprimento: ~ 90 cm) numa extremidade para a saída de ar de suporte do eléctrodo (ponta de seta) e na outra extremidade a uma torneira de passagem de três vias (Figura 2C , seta preta).
      1. Coloque um bocal numa das extremidades de um outro pedaço de tubo (~ 60-70 cm de comprimento) e anexar-lo para a torneira de três vias na outra extremidade (Figura 2C, asterisco preto).
        NOTA: Este sistema de tubos permite a aplicação de pressão positiva e negativa para o interior da pipeta de gravação durante a formação da vedação.
    18. Traga a ponta da micropipeta para a porção mais dorsal da medula espinal e suavemente perfurar as meninges. Siga com a SWIFT, curtos, movimentos laterais para loosen as meninges (Figura 3C e 3C').
    19. Depois da ponta da micropipeta ter atravessado as meninges, avançar e aumentar a micropipeta para puxar as meninges longe da medula espinal (Figura 3D e 3D').
    20. Mover a micropipeta rostral, avançando ao longo de 1 a 2 hemisegments para expor células Rohon-Beard (Figura 3E e 3E').
      NOTA: Dissecar a quantidade mínima de meninges necessários para expor apenas algumas células Rohon-barba. Depois de cada gravação, dissecção adicional é realizada para revelar mais células Rohon-barba. Em ambos os embriões e larvas, neurónios Rohon-Beard podem, ocasionalmente, abriu-se para contacto com a micropipeta remendo. Outros neurônios da medula espinhal não se comportam desta maneira, sugerindo que isso pode refletir propriedades únicas das células Rohon-Beard, como sua mecanossensitividade. Em apoio disto, várias composições em solução (por exemplo, componentes iónicose a osmolaridade) foram testados e nenhum ter evitado este comportamento de células Rohon-barba.
  2. Dissecção de larvas para as gravações de células Rohon-Beard
    NOTA: Em sete larvas dpf, músculo em torno do cordão espinal dorsal deve ser removido. Siga passos 3.1.1 a 3.1.15 (com uma larva substituído por um embrião) antes do tratamento com o enzima.
    1. Para remover o músculo, incubar a larva com 0,05% de colagenase durante 1 min.
    2. Remova a colagenase enxaguando preparações ~ 5 vezes com solução de Ringer. Siga com ~ 5 lavagens de solução extracelular para remover completamente o colagenase.
    3. Efectua-se a parte restante da dissecção após a montagem da câmara de registo na fase do microscópio do equipamento de gravação. Anexar um borosilicato de paredes espessas remendo micropipeta (Figura 2B, parte inferior) para o suporte do eléctrodo e quebrar a ponta da micropipeta, escovando-suavemente contra o fundo dea câmara de silicone.
    4. Utilizar a micropipeta ligeiramente quebrado para provocar o músculo de distância e expor a espinal medula dorsal. Para remover as fibras musculares da preparação, aplicar sucção através do tubo ligado à saída do suporte de eléctrodo. Usar o micromanipulador para mover a micropipeta ao longo do comprimento de uma fibra muscular durante a aplicação de sucção.
      NOTA: O objectivo é usar o primeiro micropipeta para soltar mecanicamente o músculo e, em seguida, para sugar e remover as fibras musculares individuais. Ocasionalmente, durante a remoção do músculo, a micropipeta torna-se saturado com o tecido aspirado.
      1. Para desobstruir a micropipeta, a escovar micropipeta contra o fundo da câmara, ligeiramente quebrar a ponta, enquanto se fazia borbulhar ar através do tubo para expelir o conteúdo.
        NOTA: Se o tamanho da ponta micropipeta torna-se excessivamente grande, um novo micropipeta pode ser necessária. O tamanho da ponta da micropipeta é mais crítica quando se remove as camadas musculares closest para as membranas que envolvem a espinal medula ou as meninges (pequenas pontas de micropipeta permitir um trabalho mais controlada).
    5. Retirar as meninges como descrito nos passos 3.1.18-3.1.20 usando um novo micropipeta (Figura 2B, parte inferior).

figure-protocol-4
Figura 4: dissecção lateral da medula espinal de peixe-zebra. Montagem embriões de peixe-zebra de uma orientação lateral facilita o acesso aos neurónios motores. A remoção do músculo e dissecção das meninges para expor os neurónios motores é realizada sob um microscópio vertical adaptado com uma objectiva de 40x de imersão em água (ver Figura 2). Os corpos celulares dos neurónios motores (A) estão localizados ventral e lateralmente no interior da medula espinal. Os embriões são ligados à câmara de modo a que o seu lado dorsal enfrenta o suporte do eléctrodo.Note-se que a cola sutura aparece em branco, uma vez que endurece (asteriscos). Uma vez que a parte posterior do cérebro é seccionado (a), a pele é cortada superficialmente várias vezes em um local (b) caudal em relação ao cérebro posterior utilizando uma micropipeta de vidro. Cortes superficiais adicionais (c), perpendicular ao primeiro conjunto (b), formam uma guia de pele que uma pinça pode agarrar para a remoção da pele. (BG) Uma micropipeta de vidro vazio, puxado para uma curta ponta, cónica (Figura 2B, parte inferior), está ligada ao suporte de eléctrodo. A micropipeta é manobrado usando o micromanipulador para a dissecção fina e subsequente remoção do tecido muscular. (B) A ponta da micropipeta de vidro é primeiro quebrada ligeiramente, escovando-suavemente contra o fundo da câmara, criando uma extremidade recortada e um diâmetro da ponta maior. A micropipeta é movido ao longo do comprimento das fibras do músculo, enquanto a sucção é aplicada. As fibras musculares são removidas uma camadade cada vez para evitar o rompimento das meninges subjacentes. Em embriões, as camadas musculares mais dorsal são removidos em primeiro lugar, uma vez que estas tendem a ser mais fino. A pele não é removido hemisegments caudais mais (seta). (C) A metade dorsal do músculo em um hemisegmento foi removido (seta). (D) As linhas pretas demarcar uma hemisegmento desprovido de fibras musculares, com meninges intactas que cobrem a medula espinal (asterisco). (EE') Usando uma micropipeta, a pressão é aplicada para as meninges, numa posição ligeiramente dorsal para neurónio motor somata. Rápidos, curtos movimentos, laterais da micropipeta levar à perfuração das meninges. (FF') A micropipeta é avançada ventralmente, para o aspecto ventral do hemisegmento, e levantado para separar as meninges do tecido neuronal. (Gg') meninges estão seccionado movendo a micropipeta rostral ao longo do comprimento dohemisegmento. Neurónios imediatamente emergir a partir da medula espinal expostos e são agora acessível para eléctrodos de patch (seta). Barras de escala = 500 um em (A); Barras de escala = 100 um em BG (mostrado no painel B).

  1. Dissecação de embriões para neurônio motor e gravações interneurônio
    1. Coloque o embrião numa câmara de dissecção contendo solução de Ringer e imobilizar o embrião com tricaína, como no passo 3.1.1.
    2. Montar o embrião lateralmente, com o seu lado dorsal virada para o lado da câmara que é óptimo para o utilizador (tipicamente depende da destreza manual). Siga passos 3.1.2-3.1.17 e assegurar que o embrião permanece plana contra a silicone (Figura 4A e 4A').
    3. Usar uma micropipeta de borosilicato de paredes espessas, com uma ponta que foi quebrada a ~ 25? M para raspar e aspirar o músculo de distância e expor as meninges, como descrito nos passos 3.2.4-3.2.4.1 (Figura 4B - 4D).
    4. Uma vez que as camadas de músculo são removidos do hemisegmento (s) de interesse (Figura 4D), substituir a micropipeta de vidro com um novo que tem uma ponta intacta (Figura 2B, parte inferior). Perfurar as meninges numa posição que é dorsal para os neurónios alvo. Usando o micromanipulador, empurrar a micropipeta para baixo sobre as meninges e em seguida movê-lo rapidamente para os lados para rasgar e atravessar as meninges (Figura 4E e 4E').
    5. Após a ruptura das meninges, avançar e aumentar a micropipeta para levantar as meninges longe da medula espinal (Figura 4F e 4F'). Mover a micropipeta rostral para rasgar a membrana ao longo do comprimento do hemisegmento (Figura 4G e 4G').
      NOTA: Para obter gravações de células Rohon-barba e neurônios motores primários, a dissecção é limitado a limpar as meninges longe do immédiatregião alvo e. Em contraste, para gravações de interneurónios e neurónios motores secundários, é necessário remover os neurónios no interior da medula espinal que dificultam o acesso à célula de interesse. Neste último caso, devido ao grande perturbação de circuitos da medula espinhal, os estudos são limitados à análise de propriedades da membrana eléctricas intrínsecas.

4. As gravações eletrofisiológicas da coluna vertebral Neurônios

  1. Para as gravações de células Rohon-barba e os neurónios motores, utilizar capilares de vidro de borosilicato de espessura de parede puxados para uma resistência de ~ 3 mohms, quando cheio com a solução da pipeta (Figura 2B, parte inferior).
    1. Aplicar pressão positiva soprando suavemente através do tubo ligado ao suporte do eléctrodo antes da imersão da micropipeta no banho.
      NOTA: A pressão positiva impede detritos de obstruir a ponta da micropipeta e é mantida rodando a torneira de três vias para o fora de pOSIÇÃO. Uma vez que perto do neurónio-alvo, a pressão positiva irá resultar em um recuo distintivo da membrana celular, um indicador útil de que a micropipeta está perto o suficiente para iniciar a formação de vedação.
    2. Libertar a pressão positiva, rodando a válvula de bloqueio para a posição aberta durante a aplicação de sucção luz adicional através do bocal.
    3. Após a formação de um GÊ-vedação entre a membrana celular e a ponta da micropipeta, aplicar pulsos breves de sucção para romper a membrana e conseguir uma configuração de célula inteira.
    4. Depois de estabelecer uma configuração de célula inteira estável, com uma resistência de entrada 500 MQ e uma resistência de acesso 10 mohms, obter gravações em qualquer um dos modos da voltagem ou da corrente de braçadeira.

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Resultados

Temos registos com sucesso a partir de neurónios Rohon-Beard em 17 hpf embriões através 7 dpf larvas (Figura 5A e 5B). Quando as células Rohon-Beard foram registados, a preparação foi montada do lado dorsal para cima. Essa montagem permite a identificação inequívoca de células Rohon-Beard com base nas suas posições dorsais superficiais e tamanhos grandes soma. A identificação é adicionalmente confirmada pelo potencial de membrana em repouso hiperpolariza...

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Discussão

Os métodos aqui descritos permitem a caracterização eléctrica e morfológica dos neurónios sensoriais e motores de embriões de peixes-zebra após dissecção mínima da medula espinhal. Neurônios permanecem saudáveis ​​por pelo menos 1 h, o limite de tempo imposto sobre essas gravações. Os neurónios foram registados utilizando a configuração de célula inteira padrão, bem como a partir de manchas nucleadas; este último método minimiza os problemas de espaço-de braçadeira que pode impedir um estudo detalhado biofísico de corre...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH (F32 NS059120 para RLM e R01NS25217 e P30NS048154 a ABR).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro de vácuo/Garrafa de armazenamento, poro de 0,22 mmCorning431096
Seringa de 0,2 mmWhatman6780-2502
TricaineSigmaA-5040Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato sal 
&alfa;-bugarotoxinaTocris11032-79-4
TetrodotoxinaTocris4368-28-9
Alexa-549 sal de hidrazinaSondas molecularesA-10438corante fluorescente
Spin-X filtro de tubo de centrífugaCorning8161
Lâmina de microscópio de vidroFisher12-550C
Sylgard silicone kit de elastômeroDow Corning184placas de Petri de elastômero de silicone
Falcon351029
Capilares de vidro borossilicatoHarvard Apparatus30-0038diâmetros internos e externos de 0,78 e 1,0 mm (capilares de vidro de paredes finas)
Capilares de vidro borossilicatoDrummond Scientific1-000-1000-100diâmetros internos e externos de 1,13 e 1,55 mm (capilares de vidro de parede grossa)Encaixe
de polipropileno barpado em miniatura Adesivo de tecido Cole-Palmer6365-90
Vetbond 3M1469SB
Collagenase XISigmaC7657
Extrator de microeletrodosSutter Instruments  Modelo P-97 
AmplificadorMolecular DevicesAxopatch 200B
Head stageMolecular DevicesCV203BU
Micromanipulador motorizado   Tubulação TygonMP-285
Fisher14-169-1BID 1/16 IN, OD 1/8 IN e PAREDE 1/32 IN (tubulação flexível de laboratório)
Suporte de eletrodoMolecular Devices1-HC-U
Pharmaseal Torneiras de Três Vias BaxterK75
DigitizerAxon InstrumentsDigidata 1440A
Microscópio invertido ZeissAxioskop2 FS mais
objetiva Achroplan de 40X/0,80WZeiss
Software de aquisição e análise de dados Axon InstrumentsPClamp 10 - Clampex e Clampfit 
Extrator de micropipetasSutter InstrumentsModelo P-97
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Soluções de dissecação e gravação (em mM)
Todas as soluções, exceto a intracelular, são estáveis por ~ 2-3 meses quando filtradas (copos de filtro de 0,22 mm) e armazenadas em temperatura ambiente (RT).
A solução intracelular é filtrada (filtros de seringa de 0,2 mm) e armazenada congelada (-20 ° C) em pequenas alíquotas que são descongeladas individualmente no dia do uso.
Dissecção / Campainha' s solução145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2,2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (com NaOH)
Solução de registro135 KCl, 10 EGTA-ácido, 10 HEPES; pH 7,4 (com KOH).
Solução de registro de banho (extracelular) / pinça125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2< / sub>,2H2< / sub>O, 5 HEPES; pH 7,4 (com NaOH).
Solução de estoque de sal de hidrazina Alexa-594. Prepare um estoque de 13,2 mM em ddH2O, alíquota (~100 µ l) e armazene a -20 ° C. Para uso, dilua a solução de estoque 132 vezes com solução de pipeta até uma concentração final de 100 mM. Após a diluição, filtre a solução de pipeta contendo Alexa-594  com um filtro de tubo de centrífuga.
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agentes imobilizadores
0,4% de sal de etilo 3-aminobenzoato de metanossulfonato (Tricaine)Prepare uma solução estoque a 0,4% em 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g de Tricaína/100 mL 0,2 M Tris
Ajuste o pH para 7 com NaOH e armazene a -20 °C.
Para uso, dilua a solução estoque ~25 vezes em meio embrionário
250 mM &alfa;-bungarotoxinaPrepare um estoque de 250 mM em ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µ L alíquotas e sotre a -20 °C.
Para uso, dilua 2.500 vezes com solução extracelular até uma concentração final de 100 nM.
1 mM TetrodotoxinaPrepare um estoque de 1 mM em ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µ L alíquotas e sotre a -20 °C.
Para uso, diluir 2.000 vezes com solução extracelular até uma concentração final de 500 nM.
da Sutter Instruments de pipeta (intracelular) de tensão e corrente

Referências

  1. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
  2. Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  3. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Whole cell patch-clamp recordings from identified spinal neurons in the zebrafish embryo. Methods Cell Sci. 25, 59-64 (2003).
  4. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive Swimming Motor Patterns in Wild Type and Mutant Larval Zebrafish. J Neurophysiol. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  5. Wen, H., Brehm, P. Paired motor neuron-muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J Neurosci. 25 (35), 8104-8111 (2005).
  6. Ribera, A. B., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish Touch-Insensitive Mutants Reveal an Essential Role for the Developmental Regulation of Sodium Current. J Neurosci. 18, 9181-9191 (1998).
  7. Pineda, R. H., Heiser, R. A., Ribera, A. B. Developmental, molecular, and genetic dissection of INa in vivo in embryonic zebrafish sensory neurons. J Neurophysiol. 93, 3582-3593 (2005).
  8. Moreno, R. L., Ribera, A. B. Zebrafish motor neuron subtypes differ electrically prior to axonal outgrowth. J Neurophysiol. 102, 2477-2484 (2009).
  9. Moreno, R. L., Ribera, A. B. Spinal neurons require Islet1 for subtype-specific differentiation of electrical excitability. Neural Dev. 9 (1), 19(2014).
  10. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
  13. Vogel, G. Genomics: Sanger will sequence zebrafish genome. Science. 290 (5497), 1671(2000).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21 (1), 48-64 (2011).
  16. Yates, A., et al. Ensembl. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D710-D716 (2016).
  17. Kawakami, K. Transgenesis and gene trap methods in zebrafish by using the Tol2 transposable element. Methods Cell Biol. 77, 201-222 (2004).
  18. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  19. Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29, 699-700 (2011).
  20. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  21. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  22. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  23. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  24. Levin, E. D., Cerutti, D. T. Behavioral neuroscience of zebrafish. Methods of behavior analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
  25. Stewart, A., Gaikwad, S., Kyzar, E., Green, J., Roth, A., Kalueff, A. Modeling anxiety using adult zebrafish: A conceptual review. Neuropharmacology. 62, 135-143 (2012).
  26. Mushtaq, M. Y., Verpoorte, R., Kim, H. K. Zebrafish as a model for systems biology. Biotechnol Genet Eng Rev. 29 (2), 187-205 (2013).
  27. Phillips, J. B., Westerfield, M. Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward advancements in human health. Dis Model Mech. 7 (7), 739-743 (2014).
  28. Weis, J. S. Analysis of the development of nervous system of the zebrafish, Brachydanio rerio. I. The normal morphology and development of the spinal cord and ganglia of the zebrafish. J Embryol Exp Morphol. 19 (2), 109-119 (1968).
  29. Bernhardt, R. R., Chitnis, A. B., Lindamer, L., Kuwada, J. Y. Identification of spinal neurons in the embryonic and larval zebrafish. J Comp Neurol. 302 (3), 603-616 (1990).
  30. Tsuchida, T., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
  31. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
  32. Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: Moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
  33. Fetcho, J. R., McLean, D. L. Some principles of organization of spinal neurons underlying locomotion in zebrafish and their implications. Ann N Y Acad Sci. 1198, 94-104 (2010).
  34. Del Barrio, M. G., et al. A transcription factor code defines nine sensory interneuron subtypes in the mechanosensory area of the spinal cord. PLoS One. 8 (11), (2013).
  35. Satou, C., Kimura, Y., Hirata, H., Suster, M. L., Kawakami, K., Higashijima, S. Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development. 140 (18), 3927-3931 (2013).
  36. McLean, D. L., Fan, J., Higashijima, S., Hale, M. E., Fetcho, J. R. A topographic map of recruitment in spinal cord. Nature. 446, 71-75 (2007).
  37. McLean, D. L., Masino, M. A., Koh, I. Y., Lindquist, W. B., Fetcho, J. R. Continuous shifts in the active set of spinal interneurons during changes in locomotor speed. Nat. Neurosci. 11, 1419-1429 (2008).
  38. McLean, D. L., Fetcho, J. R. Spinal interneurons differentiate sequentially from those driving the fastest swimming movements in larval zebrafish to those driving the slowest ones. J. Neurosci. 29, 13566-13577 (2009).
  39. Ampatzis, K., Song, J., Ausborn, J., El Manira, A. Separate microcircuit modules of distinct V2a interneurons and motoneurons control the speed of locomotion. Neuron. 83, 934-943 (2014).
  40. Ljunggren, E. E., Haupt, S., Ausborn, J., Ampatzis, K., El Manira, A. Optogenetic activation of excitatory premotor interneurons is sufficient to generate coordinated locomotor activity in larval zebrafish. J. Neurosci. 34, 134-139 (2014).
  41. Menelaou, E., VanDunk, C., McLean, D. L. Differences in the morphology of spinal V2a neurons reflect their recruitment order during swimming in larval zebrafish. J Comp Neurol. 522, 1232-1248 (2014).
  42. Hubbard, J. M., et al. Intraspinal Sensory Neurons Provide Powerful Inhibition to Motor Circuits Ensuring Postural Control during Locomotion. Curr Biol. 26 (21), 2841-2853 (2016).
  43. Song, J., Ampatzis, K., Björnfors, E. R., El Manira, A. Motor neurons control locomotor circuit function retrogradely via gap junctions. Nature. 529 (7586), 399-402 (2016).
  44. Lamborghini, J. E. Rohon-beard cells and other large neurons in Xenopus embryos originate during gastrulation. J. Comp. Neurol. 189, 323-333 (1980).
  45. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6, 2278-2289 (1986).
  46. Kimmel, C. B., Westerfield, M. Primary neurons of the zebrafish. Signals and Sense: Local and Global Order in Perceptual Maps. Edelman, G. M., Gall, W. E., Cowan, W. M. , Wiley-Liss. New York. 561-588 (1990).
  47. Metcalfe, W. K., Myers, P. Z., Trevarrow, B., Bass, M. B., Kimmel, C. B. Primary neurons that express the L2/HNK-1 carbohydrate during early development in the zebrafish. Development. 110 (2), 491-504 (1990).
  48. Rossi, C. C., Kaji, T., Artinger, K. B. Transcriptional control of Rohon-Beard sensory neuron development at the neural plate border. Dev Dyn. 238, 931-943 (2009).
  49. Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Progress in Neurobiology. 69 (6), 419-449 (2003).
  50. Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Dev Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
  51. Lambert, A. M., Bonkowsky, J. L., Masino, M. A. The conserved dopaminergic diencephalospinal tract mediates vertebrate locomotor development in zebrafish larvae. J Neurosci. 32 (39), 13488-13500 (2012).
  52. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
  53. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette pullers. , Sutter Instrument. (2015).
  54. Spitzer, N. C. The ionic basis of the resting potential and a slow depolarizing response in Rohon-Beard neurons of Xenopus tadpoles. J Physiol. 255 (1), 105-135 (1976).
  55. Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20, 206-218 (2000).
  56. Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
  57. Palanca, A. M., et al. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev Neurobiol. 73, 152-167 (2013).
  58. Flanagan-Street, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132, 4471-4481 (2005).
  59. Arkhipova, V., Wendik, B., Devos, N., Ek, O., Peers, B., Meyer, D. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365, 290-302 (2012).
  60. Balciunas, D., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Hermanson, S. B., Welle, Z., Ekker, S. C. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62(2004).
  61. Meng, A., Tang, H., Ong, B. A., Farrell, M. J., Lin, S. Promoter analysis in living zebrafish embryos identifies a cis-acting motif required for neuronal expression of GATA-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 6267-6272 (1997).
  62. Menelaou, E., McLean, D. L. A gradient in endogenous rhythmicity and oscillatory drive matches recruitment order in an axial motor pool. J Neurosci. 32, 10925-10939 (2012).
  63. Rohrbough, J., Pinto, S., Mihalek, R. M., Tully, T., Broadie, K. latheo, a Drosophila gene involved in learning, regulates functional synaptic plasticity. Neuron. 23 (1), 55-70 (1999).
  64. McKeown, K. A., Moreno, R., Hall, V. L., Ribera, A. B., Downes, G. B. Disruption of Eaat2b, a glutamate transporter, results in abnormal motor behaviors in developing zebrafish. Dev Biol. 362 (2), 162-171 (2012).
  65. Carmean, V., et al. pigk mutation underlies macho behavior and affects Rohon-Beard cell excitability. J Neurophysiol. 114 (2), 1146-1157 (2015).

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