zebrafish In Situ Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

George Streisinger pioneira no uso de Danio rerio, vulgarmente conhecido como peixe-zebra, como um sistema modelo para a análise genética do desenvolvimento dos vertebrados ^10. O modelo oferece várias vantagens, incluindo: (1) criação de animais relativamente simples e de baixo custo; (2) a fertilização externa, permitindo um acesso fácil aos embriões desde os primeiros estádios de desenvolvimento; e (3) um embrião transparente, permitindo observações directas e repetidas de células, tecidos e órgãos, como eles formam.

Ao longo das décadas que se seguiram, vários avanços aumentou ainda mais o poder do modelo peixe-zebra. Em particular, telas genéticos para a frente e os esforços de sequenciação de todo o genoma desempenharam um papel-chave na identificação de mutações e genes críticos para muitos processos de desenvolvimento ^{11, 12, 13, 14,}"> ^15, os métodos de clonagem ^16. Gateway permitiram a aplicação de rotina transgénico se aproxima de ^{17, 18.} Recentes avanços na edição genoma, exemplificado pelo activador da transcrição do tipo (TALENS) e agrupados repete regularmente interspaced curtas palindrómicos (CRISPR) -Cas9 nucleases, permitir a introdução alvo de mutações, bem como knock-out e knock-in se aproxima de ^{19, 20, 21, 22.} Combinada, estes métodos fazem peixe-zebra um poderoso modelo para o estudo dos mecanismos genéticos subjacentes comportamentos específicos e várias doenças humanas ^{23, 24, 25, 26, 27.}

Este trabalho se concentra em desenvolverregulação mental e o papel da atividade elétrica no desenvolvimento neuronal. O foco é sobre a medula espinal, para os quais o modelo de peixe-zebra proporciona várias vantagens. Em primeiro lugar, é relativamente fácil de acessar peixe-zebra em estágios embrionários e larval; portanto, pode-se estudar a função da medula espinal durante os estágios de desenvolvimento que têm menos neurónios e circuitos mais simples ^{28, 29.} Além disso, a espinal medula de peixe-zebra tem um conjunto diversificado de neurónios, semelhante a outros vertebrados, como demonstrou padrões característicos e distintivas de factores de transcrição ^{30, 31, 32, 33, 34, 35.}

A maioria dos estudos em peixes-zebra que têm como objectivo de desvendar os mecanismos subjacentes à função de circuitos da medula espinhal, especialmenteaqueles que suportam a locomoção, são compreensivelmente focada em estágios larvais ^{36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.} No entanto, muitos dos neurónios que formam as redes locomotiva espinhais iniciar a sua diferenciação em estágios embrionários iniciais, ~ 9-10 h pós-fertilização (HPF) ^{44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51.} Em vista disso, a compreensão de como as propriedades morfológicas e eléctricas dos neurónios espinais e surgem alterações entre os estágios embrionários e larval é importante para uma overacompreensão ll de formação e função circuito locomotor.

Os métodos aqui descritos permitem dissecção gravações de patch clamp de neurónios espinais e têm sido aplicados com sucesso em estágios embrionários (~ 17-48 HPF) e as fases larvares (~ 3-7 dias após a fertilização [dpf]). Esta abordagem limita a quantidade de dissecção requerida para fornecer acesso aos neurônios de interesse. O protocolo difere da maioria dos outros métodos publicados para a gravação de neurónios espinais zebrafish em que a cola veterinário sutura é utilizado, em vez de um pino de tungsténio finos, para fixar o embrião ou larva para a câmara de registo. A disponibilidade de duas abordagens diferentes (isto é, cola de sutura contra o pino de tungsténio) para a montagem dos embriões de peixe-zebra ou larvas para análise electrofisiológica fornece investigadores com opções alternativas para alcançar os seus objectivos específicos experimentais.

Em primeiro lugar, os procedimentos para acessar e gravar a partir de um pop ulação de neurónios sensoriais primários, células Rohon-Beard, são descritos. Os corpos celulares destes neurónios se encontram dentro da espinal medula dorsal. Existem células Rohon-Beard em numerosas espécies de vertebrados, diferenciar no início do desenvolvimento, e estão subjacentes à resposta ao toque embrionário ^{6, 44, 47, 48.}

Em segundo lugar, os procedimentos de acesso e gravação de neurónios motores espinais são detalhados. Zebrafish neurónios motores espinais surgir durante duas ondas de neurogese. Os neurónios motores primários anterior-nascidos surgem no final da gastrulação (~ 9-16 HPF), com apenas 3-4 neurónios motores primária presentes por hemisegmento ^{45, 46, 49.} Em contraste, a população depois-nascido de neurónios motores secundários é mais numerosos e surge durante um período prolongado, a partir das ~ 14 hpfef "> ^{45, 50.} Secundário neurônio motor gênese nos segmentos mid-tronco é principalmente concluída até 51 hpf ^50. neurônios motores secundários são considerados a contrapartida dos neurônios motores em amniotes ^46. Curiosamente, os neurônios supraespinhais, via dopamina, regular locomoção na larva e motor secundário neurónio génese no embrião e jovem larva ^{50, 51.} neurónios motores primários e secundários compreendem cada um vários subtipos diferentes. cada motor primário projectos neurónio subtipo a de axónios periférica que inerva um grupo muscular característico, resultando em um estereotipada, identificar trajectória axonal. Geralmente, os neurónios motores secundários seguir as vias axonais previamente estabelecidos por neurónios motores primários. Assim, no que diz respeito a trajectórias axonal, os neurónios motores primária e secundária são semelhantes, com a excepção de que a espessura axonal e uma somata tamanhore maior para os neurónios motores primários ^45.

Em terceiro lugar, são discutidos métodos para gravação de alguns tipos de interneurônios. No entanto, nestes casos, é necessária uma limitada quantidade de remoção de outras células do cordão espinal, e, assim, a medula espinal é menos intacta do que para as gravações de células Rohon-barba ou neurónios motores.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC; Office of Laboratory Animal Resources, Universidade do Colorado Anschutz Medical Campus).

1. Zebrafish Husbandry

1. Aumentar e manter o peixe-zebra adulto (Danio rerio) a 28,5 ° C em um / 14 h ciclo de luz de 10 h de escuro e com tratamento de água apropriado e troca ^52.
2. Elevar zebrafish embriões / larvas a 28,5 ° C em meio de embriões até que atinjam a fase desejado (por exemplo, 2 dpf).

2. Preparação de Dissecção Materiais

1. Dispensador de cola para dissecção peixe-zebra
   NOTA: Este protocolo envolve o uso de cola veterinário de sutura para fixar a preparação para a câmara de registo. O uso bem sucedido da cola sutura requer a aplicação de pequenas quantidades de cola de uma maneira controlada. A cola começa a endurecer assim queencontra um ambiente aquoso. Por conseguinte, extrair a cola para uma micropipeta e entregar pequenas quantidades, utilizando um "dispensador de cola" caseiro que permite a aplicação de pressão negativa ou positiva, por via oral. A parte central do distribuidor de cola é um furo de vidro, uma parte que está incluído no interior da embalagem que contém os de parede fina capilares de vidro de borosilicato (Figura 1A). De um lado, o furo está ligada através de um pedaço de tubo flexível a um bocal, enquanto a outra extremidade segura a micropipeta de vidro (Figura 1).
   1. Remover o bulbo de um furo de vidro e substituí-lo com o adaptador de borracha branca a partir de um outro furo de vidro (Figura 1B e 1C).
      NOTA: Este furo de vidro duplo com tampa de adaptador permite a conexão com uma micropipeta de vidro em uma extremidade e, na outra extremidade, a um pedaço de tubo flexível através de um pequeno, encaixe de polipropileno linear (Figura 1B, inserção).
   <li> Corte um pedaço de tubo flexível com um comprimento de 38 cm ~. Anexar o bocal (por exemplo, um amarelo 200 uL ponta da micropipeta) à extremidade da tubagem flexível não está ligado ao furo de vidro.
   NOTA: O pedaço de tubo deve ser suficientemente longo para permitir a manipulação da micropipeta de vidro sob um escopo de dissecação, enquanto a ponta da micropipeta amarelo é na boca (Figura 1D).

Figura 1: dispensador de cola. Furo (AC) Um vidro liga a tubagem flexível numa extremidade e a micropipeta de vidro no outro. Os adaptadores de borracha permitir a ligação por meio de um pequeno ajuste de polipropileno (B, inserir) para o tubo e, finalmente, para uma micropipeta de vidro na outra extremidade. (D) O dispensador de cola final tem um bocal (por exemplo, feita a partir de um plastic ponta de pipeta), a uma extremidade da tubagem e o furo de vidro com a micropipeta ligada na outra (ponta de seta).

2. Dissecção / câmara de gravação
   NOTA: A câmara de dissecção também serve como câmara de gravação electrofisiologia. A câmara é formada sobre uma lâmina de vidro usando peças pré-cortadas de elastómero de silicone curado (Figura 2A).
   1. Para preparar o elastómero de silicone, adicionar a base e o agente de cura para um tubo cónico de plástico em uma proporção de 4: 1, respectivamente.
   2. Misture a base de elastómero e o agente de cura completamente e derramar a mistura em duas placas de Petri de 100 milímetros. Verter o elastómero com uma espessura de <1 mm de uma placa de Petri e ~ 2,5 mm na outra.
   3. Permitir que o elastómero de silicone de cura por exposição ao ar durante ~ 4-5 dias. Se elastómero curado é necessária mais cedo, incubar-lo a 60 ° C.
   4. Cortar pedaços do elastómero de silicone curado com os seguintes tamanhos:
      1. Do ~ 1 milímetro-grossa elastómero curado, cortar um ~ 3,8 x 6,3 centímetros rectângulo; esta peça serve como a parte inferior da câmara (Figura 2A). A partir do silicone curado é aproximadamente de 2,5 mm de espessura, cortar um rectângulo ~ 3,8 x 6,3 centímetros. A partir da última rectângulo, cortar um rectângulo interno ~ 2,5 x 5 cm; a estrutura resultante serve como a parte superior da câmara (Figura 2A).
   5. Para fazer o / câmara de gravação de dissecção, colocar o rectângulo de silicone fino directamente no topo de uma lâmina de vidro (5 x 7,6 cm), certificando-se para remover quaisquer bolhas de ar entre o silicone e o vidro (Figura 2A). Colocar a moldura de silicone rectângulo, cortadas a partir do elastómero mais espesso, no topo da camada de fundo fino de silicone.
   6. Verificar que as camadas de silicone anexar bem uns com os outros e de que não existem bolhas de ar entre as duas camadas (Figura 2A).
   7. Após o uso, a câmara de desmontar através da remoção do quadro rectângulo de silicone de espessura a partir da postura de silicone inferiorer que está ligado à lâmina de vidro. Lavam-se as superfícies de silicone com _ddH2O antes de usar e depois de cada sessão de gravação e seco com toalhetes baixo fiapos.
   8. Armazenar a seco câmara para impedir o crescimento de fungos entre as duas peças de silicone.
      NOTA: Se se utilizarem toxinas ou agentes farmacológicos que não pode lavar facilmente a partir de silicone, dedicar câmaras específicos para essas finalidades.

Figura 2: câmara de Electrofisiologia e ferramentas de dissecação. (A) A câmara utilizada para as dissecações e registos electrofisiolicos consiste de uma lâmina de vidro sobre o qual são colocadas duas peças de elastómero de silicone curado, em camadas em cima uma da outra para proporcionar uma armação e uma parte inferior para um poço. O tamanho do poço, ~ 2,5 x 5 cm, permite a utilização de pequenos volumes (2-2,5 mL) de registo extracelularsolução. A camada de silicone de fundo permite um posicionamento seguro do embrião utilizando adesivo de tecido de peixe-zebra que não adere ao vidro. (B) uma micropipeta de vidro (topo) é usado para entrega de cola durante a dissecção. O vidro de parede fina é puxado para criar uma extremidade longa, afunilada que é mais tarde cortada, a criação de uma ponta com um diâmetro de ~ 75? M. A micropipeta de vidro cónico está ligado à extremidade livre do distribuidor de cola (Figura 1D, ponta de seta) e frente-enchido com cola, através da aplicação de sucção. A outra micropipeta (inferior), como puxado para uma usado para uma gravação de patch-clamp, é usado para o corte transversal da parte posterior do cérebro e para a remoção da pele. (C) Sob um microscópio vertical, um micromanipulador é utilizado para manobrar o micropipeta para os passos finais de dissecação. A micropipeta de vidro, como em B, parte inferior, está ligada ao suporte de eléctrodo (seta). remoção muscular é conseguido por umpplying sucção através do tubo ligado à saída de ar (ponta de seta). Na sua outra extremidade, o tubo liga a uma torneira de passagem (seta preta) que, no seu outro lado (asterisco), tem tubo ligado a um bocal.

3. Dissecção de Embriões e larvas de gravações de patch-clamp de espinal Neurons

Figura 3: dissecção dorsal de uma medula espinal peixe-zebra. (AA'), após a transecção rombencéfalo (a) de um embrião de 2 dpf, a pele é cortada nos lados esquerdo e direito do embrião (b). Um segundo corte, perpendicular à primeira, é então executado (c). Em seguida, a pele é levantada usando uma micropipeta, permitindo uma pinça para agarrar e puxar longe da pele. (B) A remoção da pele expõe a medula espinal dorsal. Rostral à linha preta, o esquin foi removido e a superfície da medula espinhal (asterisco), contido no interior das meninges, está exposta. A pele permanece intacta caudal para a linha preta (seta). (CC') A ponta da micropipeta de vidro é pressionado sobre as meninges, e rápidas, movimentos laterais curtas, são realizadas para perfurar as meninges. (DD e EE ') Uma vez que as meninges são perfuradas (DD '), a micropipeta é avançada e (EE') movido rostral para rasgar as meninges em dois segmentos. O somata de neurónios Rohon-Beard tipicamente surgem após a remoção das meninges (seta). (FG') Em uma larva 7-dpf, camadas de músculo cobrir o aspecto dorsal da medula espinal, dificultando o acesso aos neurónios Rohon-barba. Após a remoção da pele, a larva é tratada com 0,05% de colagenase. (F) Uma incubação de 5 min com 0,05% de colagenase é muito rigorosas, resultandoem dano muscular excessiva, tal como evidenciado pelo músculo desgastado (seta e baixo-relevo). (F') de tratamento de colagenase excessiva pode também danificar os neurónios Rohon-barba (seta), revelada aqui pela sua expressão de GFP no Tg (islet2b: gfp) linha. No Tg (islet2b: gfp) linha, os neurónios do gânglio da raiz dorsal, também expressam GFP (ponta de seta). Uma breve 1 min de incubação com 0,05% de colagenase suficientemente solta o músculo (L), enquanto conserva a morfologia miótomo (seta e baixo-relevo). Células de pigmento (L') estão presentes na parte superior da camada de músculo mais dorsal (ponta de seta). (H e I) no Tg (islet2b: gfp) linha, neurónios Rohon-barba (setas) e o gânglio da raiz dorsal (ponta de seta) continuam a expressar a GFP em 7 dpf. Dorsal vistas de Tg (islet2b: gfp) embriões de peixe-zebra em 2 dpf (H) umd 7 dpf (I). Em barras Painel A Escala = 500 um; SER (mostrado no painel B) Escala barras = 80 um; F 'e G' (mostrado no painel F) Escala barras = 200? M; H e I (mostrado no painel H) Escala barras = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Dissecação de embriões de gravações de células Rohon-Beard
   1. Coloque um embrião numa câmara de dissecção contendo ~ 2-3 ml de solução de Ringer (Figura 2A). Imobilizar o embrião por adição de ~ 100 mL de solução de tricaina 0,4% para a câmara.
   2. Puxar micropipetas de vidro de parede fina sobre uma micropipeta extrator utilizando um filamento de caixa para se obter um longo, ponta fina, semelhante a uma micropipeta de injecção (Figura 2B, em cima) ^53.
   3. Anexar a micropipeta de vidro puxado para o furo de vidro of o dispensador de cola. Sob o microscópio de dissecação, use uma pinça para quebrar a ponta da micropipeta de vidro de modo a que a ponta é ~ 75 m (Figura 2B, em cima).
      NOTA: O tamanho da ponta deve ser suficientemente grande para permitir o carregamento eficiente da cola na ponta, através da aplicação de pressão negativa (sucção boca) para frente-preencher a micropipeta, mas suficientemente pequeno para permitir a aplicação precisa da cola por meio de pressão positiva .
   4. Carregar o micropipeta de vidro com ~ 3-5 uL de cola por aplicação de sucção através do bocal. Trazer a ponta cheio de cola para a câmara de dissecção.
      NOTA: Encher a micropipeta com cola requer sucção forte. Se a micropipeta enche rapidamente com sucção fraca, a ponta é muito grande.
   5. Coloque o embrião na câmara de gravação (Figura 3A e 3A'); para gravações de embriões e larvas jovens (≤72 HPF), não há necessidade de remover o tecido muscular.
   6. Trazera ponta da micropipeta carregado-cola perto da cabeça do embrião / larva, mantendo a pressão positiva leve para a micropipeta através do tubo de boca (para impedir a entrada de solução aquosa). Uma vez que a ponta está perto do cabeça do embrião, aplicar pressão positiva suficiente para expelir uma pequena gota de cola sobre a parte inferior da câmara.
      NOTA: A cola endurece uma vez em contacto com a solução aquosa, por isso, é importante aplicar e manter a pressão positiva leve, uma vez que é colocado na solução de dissecção.
   7. Usar uma ferramenta de dissecação pino para mover o embrião / larva no sentido da gota de cola de modo a que a cabeça faz contacto com a cola. Orientar o dorso-lateral embrião se e pressione sobre a cabeça para assegurar um bom contacto com a cola.
   8. À medida que a cola endurece lentamente, utilizar o pino de dissecação para reposicionar o embrião / larva de modo que se encontre do lado ventral para baixo, do lado dorsal para cima. Mergulhar a ferramenta de dissecação pin para a gota de cola e desenhar fios da cola ao longo e através da cabeçado embrião para garantir ainda mais a sua posição.
      NOTA: tricaina acelera a taxa em que a cola endurece. Para permitir mais tempo para trabalhar com a cola, utilizar a quantidade mínima de tricaina necessária para imobilizar o embrião / larva. Além disso, a taxa de endurecimento pode variar com diferentes lotes de cola. Por conseguinte, quando se utiliza um novo lote de cola, determinar a sua velocidade de endurecimento antes de o utilizar para dissecção.
   9. Uma vez que a cabeça está firmemente ligado ao silicone e a cola ter solidificado, sacrificar o embrião / larva por transecção ao nível do encéfalo posterior com outra micropipeta de vidro (Figura 3A- um e 4A- um).
      NOTA: transecção rombencéfalo é o método que é usado aqui para o sacrifício animal humano. No entanto, dependendo dos objectivos experimentais (por exemplo, o estudo de natação fictício), pode ser necessário um outro método.
   10. Antes de fixar a cauda para a câmara, retire a pele do tronco.
       1. Usaruma micropipeta de vidro fresco (Figura 2B, fundo) para cortar a pele superficialmente várias vezes numa posição caudal em relação ao cérebro posterior (Figura 3A- b e 4A- b). Pierce a pele superficialmente ao mover a pipeta perpendicular ao eixo rostro-caudal em cada lado do tronco para dorsalmente montados espécimes (Figura 3A- b) ou no lado exposto do tronco para os espécimes montados lateralmente (Figura 4A- B).
   11. Para criar uma aba de pele por pinça para agarrar, raspar a pele várias vezes com a micropipeta no nível de e perpendicularmente ao corte inicial no passo 3.1.10.1 (Figura 3A- C e 4A- c).
   12. Usando pinças, gradualmente levantar a aba de pele e puxar a pele caudalmente.
       NOTA: Isso muitas vezes resulta na remoção da totalidade da pele do tronco. No entanto, é SOMETImes necessárias para remover a pele em várias secções efectuando reiterado raspagem e puxar da pele. Para algumas aplicações, a remoção parcial da pele pode permitir um acesso suficiente para os segmentos da medula espinhal de interesse (Figuras 3B e 4B).
   13. Entregar uma pequena gota de cola perto da cauda do embrião / larva. Use esta cola para fixar a cauda para o fundo da câmara de dissecção. Durante esta etapa, tal como a cola endurece, ajustar a posição do tronco, com a ferramenta de dissecação pino para assegurar que o tronco permanece orientada dorsalmente e que está firmemente ligado à câmara.
   14. Seguindo esta dissecção inicial, enxaguar a preparação extensivamente com solução de Ringer para remover tricaina e detritos. Permitir que a preparação em repouso durante ~ 5 min.
   15. Substitua a solução de dissecção com solução de gravação extracelular. Se necessário, adicionar um agente imobilizante para a preparao (por ex., Α-bungarotoxina [conce definitivantration de 1 uM]).
       Nota: 1 uM α-bungarotoxina imobiliza 1-2 dpf embriões dentro de ~ 30 min. Para larvas mais velha, pode ser necessária uma concentração mais elevada de α-bungarotoxina. a-bungarotoxina é mantida na solução de banho durante a gravação, que são tipicamente realizadas dentro de um período de 1 h. soluções de gravação que contêm catiões bivalentes, tais como cobalto, que não requerem a adição de um agente imobilizante. Para as experiências que requerem períodos de gravação prolongados (mais de 1 h), a preparação é perfundido com uma solução de banho a uma taxa de 0,5-1 mL / min.
   16. Mover a câmara de dissecção com o embrião montado na platina de um microscópio composto vertical equipado com uma objectiva de longa distância de trabalho 40X-imersão em água.
       NOTA: Este microscópio faz parte da plataforma onde as gravações serão realizados. A sonda também deve ser equipado com um andar de entrada, um amplificador de patch-clamp, um micromanipulador, e um sistema de aquisição de dados / computador (Figura 2C).
   17. Montar um borosilicato vazio de paredes espessas micropipeta de vidro no suporte de eléctrodo do andar de entrada (Figuras 2B, 2C e inferior, seta). Prenda o tubo (diâmetro interno: 0,16 cm, diâmetro externo: 0,32 cm, e comprimento: ~ 90 cm) numa extremidade para a saída de ar de suporte do eléctrodo (ponta de seta) e na outra extremidade a uma torneira de passagem de três vias (Figura 2C , seta preta).
       1. Coloque um bocal numa das extremidades de um outro pedaço de tubo (~ 60-70 cm de comprimento) e anexar-lo para a torneira de três vias na outra extremidade (Figura 2C, asterisco preto).
          NOTA: Este sistema de tubos permite a aplicação de pressão positiva e negativa para o interior da pipeta de gravação durante a formação da vedação.
   18. Traga a ponta da micropipeta para a porção mais dorsal da medula espinal e suavemente perfurar as meninges. Siga com a SWIFT, curtos, movimentos laterais para loosen as meninges (Figura 3C e 3C').
   19. Depois da ponta da micropipeta ter atravessado as meninges, avançar e aumentar a micropipeta para puxar as meninges longe da medula espinal (Figura 3D e 3D').
   20. Mover a micropipeta rostral, avançando ao longo de 1 a 2 hemisegments para expor células Rohon-Beard (Figura 3E e 3E').
       NOTA: Dissecar a quantidade mínima de meninges necessários para expor apenas algumas células Rohon-barba. Depois de cada gravação, dissecção adicional é realizada para revelar mais células Rohon-barba. Em ambos os embriões e larvas, neurónios Rohon-Beard podem, ocasionalmente, abriu-se para contacto com a micropipeta remendo. Outros neurônios da medula espinhal não se comportam desta maneira, sugerindo que isso pode refletir propriedades únicas das células Rohon-Beard, como sua mecanossensitividade. Em apoio disto, várias composições em solução (por exemplo, componentes iónicose a osmolaridade) foram testados e nenhum ter evitado este comportamento de células Rohon-barba.
2. Dissecção de larvas para as gravações de células Rohon-Beard
   NOTA: Em sete larvas dpf, músculo em torno do cordão espinal dorsal deve ser removido. Siga passos 3.1.1 a 3.1.15 (com uma larva substituído por um embrião) antes do tratamento com o enzima.
   1. Para remover o músculo, incubar a larva com 0,05% de colagenase durante 1 min.
   2. Remova a colagenase enxaguando preparações ~ 5 vezes com solução de Ringer. Siga com ~ 5 lavagens de solução extracelular para remover completamente o colagenase.
   3. Efectua-se a parte restante da dissecção após a montagem da câmara de registo na fase do microscópio do equipamento de gravação. Anexar um borosilicato de paredes espessas remendo micropipeta (Figura 2B, parte inferior) para o suporte do eléctrodo e quebrar a ponta da micropipeta, escovando-suavemente contra o fundo dea câmara de silicone.
   4. Utilizar a micropipeta ligeiramente quebrado para provocar o músculo de distância e expor a espinal medula dorsal. Para remover as fibras musculares da preparação, aplicar sucção através do tubo ligado à saída do suporte de eléctrodo. Usar o micromanipulador para mover a micropipeta ao longo do comprimento de uma fibra muscular durante a aplicação de sucção.
      NOTA: O objectivo é usar o primeiro micropipeta para soltar mecanicamente o músculo e, em seguida, para sugar e remover as fibras musculares individuais. Ocasionalmente, durante a remoção do músculo, a micropipeta torna-se saturado com o tecido aspirado.
      1. Para desobstruir a micropipeta, a escovar micropipeta contra o fundo da câmara, ligeiramente quebrar a ponta, enquanto se fazia borbulhar ar através do tubo para expelir o conteúdo.
         NOTA: Se o tamanho da ponta micropipeta torna-se excessivamente grande, um novo micropipeta pode ser necessária. O tamanho da ponta da micropipeta é mais crítica quando se remove as camadas musculares closest para as membranas que envolvem a espinal medula ou as meninges (pequenas pontas de micropipeta permitir um trabalho mais controlada).
   5. Retirar as meninges como descrito nos passos 3.1.18-3.1.20 usando um novo micropipeta (Figura 2B, parte inferior).

Figura 4: dissecção lateral da medula espinal de peixe-zebra. Montagem embriões de peixe-zebra de uma orientação lateral facilita o acesso aos neurónios motores. A remoção do músculo e dissecção das meninges para expor os neurónios motores é realizada sob um microscópio vertical adaptado com uma objectiva de 40x de imersão em água (ver Figura 2). Os corpos celulares dos neurónios motores (A) estão localizados ventral e lateralmente no interior da medula espinal. Os embriões são ligados à câmara de modo a que o seu lado dorsal enfrenta o suporte do eléctrodo.Note-se que a cola sutura aparece em branco, uma vez que endurece (asteriscos). Uma vez que a parte posterior do cérebro é seccionado (a), a pele é cortada superficialmente várias vezes em um local (b) caudal em relação ao cérebro posterior utilizando uma micropipeta de vidro. Cortes superficiais adicionais (c), perpendicular ao primeiro conjunto (b), formam uma guia de pele que uma pinça pode agarrar para a remoção da pele. (BG) Uma micropipeta de vidro vazio, puxado para uma curta ponta, cónica (Figura 2B, parte inferior), está ligada ao suporte de eléctrodo. A micropipeta é manobrado usando o micromanipulador para a dissecção fina e subsequente remoção do tecido muscular. (B) A ponta da micropipeta de vidro é primeiro quebrada ligeiramente, escovando-suavemente contra o fundo da câmara, criando uma extremidade recortada e um diâmetro da ponta maior. A micropipeta é movido ao longo do comprimento das fibras do músculo, enquanto a sucção é aplicada. As fibras musculares são removidas uma camadade cada vez para evitar o rompimento das meninges subjacentes. Em embriões, as camadas musculares mais dorsal são removidos em primeiro lugar, uma vez que estas tendem a ser mais fino. A pele não é removido hemisegments caudais mais (seta). (C) A metade dorsal do músculo em um hemisegmento foi removido (seta). (D) As linhas pretas demarcar uma hemisegmento desprovido de fibras musculares, com meninges intactas que cobrem a medula espinal (asterisco). (EE') Usando uma micropipeta, a pressão é aplicada para as meninges, numa posição ligeiramente dorsal para neurónio motor somata. Rápidos, curtos movimentos, laterais da micropipeta levar à perfuração das meninges. (FF') A micropipeta é avançada ventralmente, para o aspecto ventral do hemisegmento, e levantado para separar as meninges do tecido neuronal. (Gg') meninges estão seccionado movendo a micropipeta rostral ao longo do comprimento dohemisegmento. Neurónios imediatamente emergir a partir da medula espinal expostos e são agora acessível para eléctrodos de patch (seta). Barras de escala = 500 um em (A); Barras de escala = 100 um em BG (mostrado no painel B).

3. Dissecação de embriões para neurônio motor e gravações interneurônio
   1. Coloque o embrião numa câmara de dissecção contendo solução de Ringer e imobilizar o embrião com tricaína, como no passo 3.1.1.
   2. Montar o embrião lateralmente, com o seu lado dorsal virada para o lado da câmara que é óptimo para o utilizador (tipicamente depende da destreza manual). Siga passos 3.1.2-3.1.17 e assegurar que o embrião permanece plana contra a silicone (Figura 4A e 4A').
   3. Usar uma micropipeta de borosilicato de paredes espessas, com uma ponta que foi quebrada a ~ 25? M para raspar e aspirar o músculo de distância e expor as meninges, como descrito nos passos 3.2.4-3.2.4.1 (Figura 4B - <strong> 4D).
   4. Uma vez que as camadas de músculo são removidos do hemisegmento (s) de interesse (Figura 4D), substituir a micropipeta de vidro com um novo que tem uma ponta intacta (Figura 2B, parte inferior). Perfurar as meninges numa posição que é dorsal para os neurónios alvo. Usando o micromanipulador, empurrar a micropipeta para baixo sobre as meninges e em seguida movê-lo rapidamente para os lados para rasgar e atravessar as meninges (Figura 4E e 4E').
   5. Após a ruptura das meninges, avançar e aumentar a micropipeta para levantar as meninges longe da medula espinal (Figura 4F e 4F'). Mover a micropipeta rostral para rasgar a membrana ao longo do comprimento do hemisegmento (Figura 4G e 4G').
      NOTA: Para obter gravações de células Rohon-barba e neurônios motores primários, a dissecção é limitado a limpar as meninges longe do immédiatregião alvo e. Em contraste, para gravações de interneurónios e neurónios motores secundários, é necessário remover os neurónios no interior da medula espinal que dificultam o acesso à célula de interesse. Neste último caso, devido ao grande perturbação de circuitos da medula espinhal, os estudos são limitados à análise de propriedades da membrana eléctricas intrínsecas.

4. As gravações eletrofisiológicas da coluna vertebral Neurônios

1. Para as gravações de células Rohon-barba e os neurónios motores, utilizar capilares de vidro de borosilicato de espessura de parede puxados para uma resistência de ~ 3 mohms, quando cheio com a solução da pipeta (Figura 2B, parte inferior).
   1. Aplicar pressão positiva soprando suavemente através do tubo ligado ao suporte do eléctrodo antes da imersão da micropipeta no banho.
      NOTA: A pressão positiva impede detritos de obstruir a ponta da micropipeta e é mantida rodando a torneira de três vias para o fora de pOSIÇÃO. Uma vez que perto do neurónio-alvo, a pressão positiva irá resultar em um recuo distintivo da membrana celular, um indicador útil de que a micropipeta está perto o suficiente para iniciar a formação de vedação.
   2. Libertar a pressão positiva, rodando a válvula de bloqueio para a posição aberta durante a aplicação de sucção luz adicional através do bocal.
   3. Após a formação de um GÊ-vedação entre a membrana celular e a ponta da micropipeta, aplicar pulsos breves de sucção para romper a membrana e conseguir uma configuração de célula inteira.
   4. Depois de estabelecer uma configuração de célula inteira estável, com uma resistência de entrada 500 MQ e uma resistência de acesso 10 mohms, obter gravações em qualquer um dos modos da voltagem ou da corrente de braçadeira.

Temos registos com sucesso a partir de neurónios Rohon-Beard em 17 hpf embriões através 7 dpf larvas (Figura 5A e 5B). Quando as células Rohon-Beard foram registados, a preparação foi montada do lado dorsal para cima. Essa montagem permite a identificação inequívoca de células Rohon-Beard com base nas suas posições dorsais superficiais e tamanhos grandes soma. A identificação é adicionalmente confirmada pelo potencial de membrana em repouso hiperpolarizado estereotipada destes neurónios (Figura 5, tabela inserção) 6, 54. Além disso, como os neurónios sensoriais primários, os neurónios Rohon-Beard falta de entrada sináptica. Por conseguinte, na ausência da estimulação eléctrica, não há mudanças no potencial da membrana deve ocorrer durante a gravação em modo de corrente-braçadeira (Figura 5B). Desde os registos iniciais de células-Rohon Beard em peixes-zebra foram realizadas <sup classe = "refex"> 6, várias linhas transgénicas (por exemplo, Tg (islet2b: gfp), Tg (NGN: gfp), e Tg (isletss: GFP)) foram geradas que expressam repórteres fluorescentes nestes neurónios, facilitando ainda mais a sua identificação 55, 56, 57.

Figura 5: Voltage- de células inteiras e de corrente-clamp gravações de neurónios Rohon-Beard em 1 e 2 dpf embriões e 7 dpf larvas. (A) gravações de tensão-clamp de correntes de entrada para fora e foram obtidos a partir de neurónios Rohon-Beard em 1- (linha preta fina), 2- (linha preta espessa), e 7-dpf (linha cinzenta) embriões / larvas. O potencial segurando era -80 mV e correntes foram activados por uma etapa de despolarização de 20 mV. (B) potenciais de acção simples são induzidas por (1 ms) corrente breveinjecções (~ 0,35 nA) para neurónios Rohon-Barba de 1- (linha preta fina), 2- (linha preta espessa), e 7-dpf (linha cinzenta) embriões / larvas. (B') Na ausência de estimulação eléctrica, não há alterações no potencial de membrana, tais como despolarizações pós-sinápticos espontâneos, ocorrem nos neurónios Rohon-barba. A tabela resume os valores de inserção de potenciais de membrana em repouso registados a partir de neurónios Rohon-Barba de 1- (n = 21) e 2- (n = 9) dpf embriões e 7- (n = 7) dpf larvas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As linhas transgénicas que permitem a identificação inequívoca de outros subtipos de neurónios espinais também estão disponíveis. Entre estes, a linha mnx1 transgénico Tg (mnx1: gfp) expressa a proteína fluorescente verde (GFP) em um subconjunto de neurónios motores espinais logo após a sua especificação (~ 14-16 HPF) <sup class = "xref"> 58, 59. Devido ao posicionamento estereotipada dos neurónios motores primárias dentro de cada hemisegmento (Figura 6A), juntamente com a expressão da GFP no transgénico mnx1, é possível identificar os vários subtipos de neurónios motores principal (Figura 6B e 6C). Incluindo um corante fluorescente na solução de eléctrodo de registo permite a visualização de trajectórias axonais, proporcionando confirmação adicional da identidade do neurónio motor, como algumas interneurónios também expressam GFP no Tg (mnx1: gfp) linha. Em alternativa, uma outra linha transgénica que permite a identificação de neurónios motores é a linha ET2 60.

Figura 6: tensão de célula inteira e corrente-clamp gravações de neurónios motores de uma dpf embry peixe-zebraOS. (A) Um desenho mostra as características morfológicas específicas dos subtipos primárias de neurónios motores presentes na medula espinhal peixe-zebra. Neurónios motores primários são identificados pela posição da sua soma dentro de um segmento (isto é, rostral [RoP], medial [MiP], ou caudal [CaP]) 45. Além disso, cada subtipo estende um axónio para a periferia por meio de um caminho distinto. A utilização combinada de a Tg (mnx1: gfp) linha e corante rotulagem revela o mandril axonal estereotipado e a identidade do neurónio motor subtipo durante uma gravação. Usando os métodos aqui apresentados, é possível sequencialmente ficha de três diferentes de neurónios motor primário subtipos dentro do mesmo hemisegmento. (B) gravações de tensão-grampo são mostrados que foram obtidos a partir de RoP, MIP, e PAC, todos em um único hemisegmento. Um passo de voltagem a +20 mV foi usado para induzir correntes a partir de um potencial de manutenção de -80 mV. (C) Durante corrente de braçadeira recordings de RoP, MIP, e CaP, breves (1 ms, ~ 0,4 nA) injecções foram aplicadas correntes para disparar um potencial de acção. O potencial de membrana foi mantido a ~ -65 mV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma diferença principal entre os neurónios motores primários e secundários é a maior somata dos neurónios anterior-nascidos. No entanto, os subtipos de neurónios motores secundários não são identificáveis ​​por tamanho ou posição de soma. Para as gravações de neurónios específicos do motor secundário, duas linhas transgicas, Tg (GATA2: gfp), e Tg (islet1: GFP), foram usadas para a identificação de neurónios motores secundários com axónios ventral e dorsal que se projectam, respectivamente, 55, 61. No entanto, um terceiro derivado do neurónio motor subtipo está presente na medula espinhal peixe-zebra, com axons que dorsal do projeto e ventrally 62. Por conseguinte, corante pode ser utilizado para encher os neurónios motores secundários durante os registos para identificar subtipos com base na morfologia (Figura 7A) 8, 9. Muitas vezes, durante a tensão-grampo (Figura 7B, asteriscos) ou gravações corrente-clamp (Figura 7C e 7C', pontas de seta) a partir de neurónios motores secundários, eventos espontâneos ou sinápticas são registados.

Figura 7: tensão de célula inteira e corrente-clamp gravações de neurónios motores secundários de 2 dpf embriões. (A) No Tg (GATA2: gfp) linha, dois diferentes subtipos de neurónios motores secundário expressar GFP 62. No hemisegmento esquerda, um neurônio motor secundário ventral(Asterisco e seta indicam soma e axónio, respectivamente). No hemisegmento vizinha, à direita (caudal), há um neurónio dorsal ventral / motor secundário (asterisco indica soma; setas indicam as duas axónios que se projectam, um ventralmente [seta inferior] e os outros dorsalmente [seta topo]). Estes neurónios foram marcados com um corante fluorescente vermelho durante as gravações. Para identificar ventral / dorsais neurónios motores secundários, é crítico para assegurar que a dissecção não remove muscular no hemisegmento caudal adjacente, desse modo, danificar ou remover o axónio dorsal. Depois da gravação, o soma neurónio permanece ligado ao micropipeta, uma vez que é puxado para fora a partir da preparação (asterisco superior direito). Ao utilizar corantes para preencher neurónios durante gravações, o corante muitas vezes fugas, enquanto o eléctrodo está no banho, o que resulta num fundo fluorescente vermelha visível na medula espinal e do notocórdio (asterisco inferior no rostral [esquerdo] hemisegmento < / Em>). (B) gravações de tensão-clamp foram obtidos a partir de ventral e neurónios motores secundários ventral / dorsais. medidas de tensão (a -30, -10, 10, 30, 50, 70, 90, e 110 mV) provocou exterior e correntes de entrada. Potenciais de acção Unclamped / despolarizações podem estar presentes nas gravações (asteriscos). (C) Durante gravações corrente-clamp de neurónios motores secundários, breves (1 ms) injecções correntes de amplitude crescente foram aplicados aos neurónios para disparar um potencial de acção (asteriscos). (C') Exemplos de potenciais de acção único desencadeadas em neurónios motores secundários por injecções actuais ~ 0,4-NA são mostrados. Nesta fase, os potenciais de acção espontâneas são também observados (C e C', pontas de seta). (D) prolongada (100 ms) injecções correntes (~ 0,35 NA) provocar o disparo de potenciais de acção repetitivos. O potencial de membrana foi mantido a ~ -65 mV.carga / 55507 / 55507fig7large.jpg" target = '_ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.