Name: zebrafish In Situ Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a preparar a medula espinhal in situ de peixe-zebra para gravações eletrofisiológicas de neurônios sensoriais e motores em embriões e larvas de Danio rerio. Este método permite estudar a excitabilidade elétrica neural durante o desenvolvimento.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por bolsas do NIH (F32 NS059120 para RLM e R01NS25217 e P30NS048154 a ABR).

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Os métodos aqui descritos permitem a caracterização eléctrica e morfológica dos neurónios sensoriais e motores de embriões de peixes-zebra após dissecção mínima da medula espinhal. Neurônios permanecem saudáveis ​​por pelo menos 1 h, o limite de tempo imposto sobre essas gravações. Os neurónios foram registados utilizando a configuração de célula inteira padrão, bem como a partir de manchas nucleadas; este último método minimiza os problemas de espaço-de braçadeira que pode impedir um estudo detalhado biofísico de corre...

<html> George Streisinger pioneira no uso de Danio rerio, vulgarmente conhecido como peixe-zebra, como um sistema modelo para a análise genética do desenvolvimento dos vertebrados 10. O modelo oferece várias vantagens, incluindo: (1) criação de animais relativamente simples e de baixo custo; (2) a fertilização externa, permitindo um acesso fácil aos embriões desde os primeiros estádios de desenvolvimento; e (3) um embrião transparente, permitindo observações directas e repetidas de células, tecidos e órgãos, como eles formam. Ao longo das décadas que se seguiram, vários avanços aumentou ainda mais o poder do modelo peixe-zebra. Em particular, telas genéticos para a frente e os esforços de sequenciação de todo o genoma desempenharam um papel-chave na identificação de mutações e genes críticos para muitos processos de desenvolvimento 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, os métodos de clonagem 16. Gateway permitiram a aplicação de rotina transgénico se aproxima de 17, 18. Recentes avanços na edição genoma, exemplificado pelo activador da transcrição do tipo (TALENS) e agrupados repete regularmente interspaced curtas palindrómicos (CRISPR) -Cas9 nucleases, permitir a introdução alvo de mutações, bem como knock-out e knock-in se aproxima de 19, 20, 21, 22. Combinada, estes métodos fazem peixe-zebra um poderoso modelo para o estudo dos mecanismos genéticos subjacentes comportamentos específicos e várias doenças humanas 23, 24, 25, 26, 27. Este trabalho se concentra em desenvolverregulação mental e o papel da atividade elétrica no desenvolvimento neuronal. O foco é sobre a medula espinal, para os quais o modelo de peixe-zebra proporciona várias vantagens. Em primeiro lugar, é relativamente fácil de acessar peixe-zebra em estágios embrionários e larval; portanto, pode-se estudar a função da medula espinal durante os estágios de desenvolvimento que têm menos neurónios e circuitos mais simples 28, 29. Além disso, a espinal medula de peixe-zebra tem um conjunto diversificado de neurónios, semelhante a outros vertebrados, como demonstrou padrões característicos e distintivas de factores de transcrição 30, 31, 32, 33, 34, 35. A maioria dos estudos em peixes-zebra que têm como objectivo de desvendar os mecanismos subjacentes à função de circuitos da medula espinhal, especialmenteaqueles que suportam a locomoção, são compreensivelmente focada em estágios larvais 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. No entanto, muitos dos neurónios que formam as redes locomotiva espinhais iniciar a sua diferenciação em estágios embrionários iniciais, ~ 9-10 h pós-fertilização (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Em vista disso, a compreensão de como as propriedades morfológicas e eléctricas dos neurónios espinais e surgem alterações entre os estágios embrionários e larval é importante para uma overacompreensão ll de formação e função circuito locomotor. Os métodos aqui descritos permitem dissecção gravações de patch clamp de neurónios espinais e têm sido aplicados com sucesso em estágios embrionários (~ 17-48 HPF) e as fases larvares (~ 3-7 dias após a fertilização [dpf]). Esta abordagem limita a quantidade de dissecção requerida para fornecer acesso aos neurônios de interesse. O protocolo difere da maioria dos outros métodos publicados para a gravação de neurónios espinais zebrafish em que a cola veterinário sutura é utilizado, em vez de um pino de tungsténio finos, para fixar o embrião ou larva para a câmara de registo. A disponibilidade de duas abordagens diferentes (isto é, cola de sutura contra o pino de tungsténio) para a montagem dos embriões de peixe-zebra ou larvas para análise electrofisiológica fornece investigadores com opções alternativas para alcançar os seus objectivos específicos experimentais. Em primeiro lugar, os procedimentos para acessar e gravar a partir de um pop<html> ulação de neurónios sensoriais primários, células Rohon-Beard, são descritos. Os corpos celulares destes neurónios se encontram dentro da espinal medula dorsal. Existem células Rohon-Beard em numerosas espécies de vertebrados, diferenciar no início do desenvolvimento, e estão subjacentes à resposta ao toque embrionário 6, 44, 47, 48. Em segundo lugar, os procedimentos de acesso e gravação de neurónios motores espinais são detalhados. Zebrafish neurónios motores espinais surgir durante duas ondas de neurogese. Os neurónios motores primários anterior-nascidos surgem no final da gastrulação (~ 9-16 HPF), com apenas 3-4 neurónios motores primária presentes por hemisegmento 45, 46, 49. Em contraste, a população depois-nascido de neurónios motores secundários é mais numerosos e surge durante um período prolongado, a partir das ~ 14 hpfef &quot;&gt; 45, 50. Secundário neurônio motor gênese nos segmentos mid-tronco é principalmente concluída até 51 hpf 50. neurônios motores secundários são considerados a contrapartida dos neurônios motores em amniotes 46. Curiosamente, os neurônios supraespinhais, via dopamina, regular locomoção na larva e motor secundário neurónio génese no embrião e jovem larva 50, 51. neurónios motores primários e secundários compreendem cada um vários subtipos diferentes. cada motor primário projectos neurónio subtipo a de axónios periférica que inerva um grupo muscular característico, resultando em um estereotipada, identificar trajectória axonal. Geralmente, os neurónios motores secundários seguir as vias axonais previamente estabelecidos por neurónios motores primários. Assim, no que diz respeito a trajectórias axonal, os neurónios motores primária e secundária são semelhantes, com a excepção de que a espessura axonal e uma somata tamanhore maior para os neurónios motores primários 45. Em terceiro lugar, são discutidos métodos para gravação de alguns tipos de interneurônios. No entanto, nestes casos, é necessária uma limitada quantidade de remoção de outras células do cordão espinal, e, assim, a medula espinal é menos intacta do que para as gravações de células Rohon-barba ou neurónios motores.

<table><tbody><tr><td>Filtro de vácuo/Garrafa de armazenamento, poro de 0,22 mm</td><td>Corning</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 0,2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato sal&nbsp;</td></tr><tr><td>&alfa;-bugarotoxina</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 sal de hidrazina</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-10438</td><td>corante fluorescente</td></tr><tr><td>Spin-X filtro de tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio de vidro</td><td>Fisher</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silicone kit de elastômero</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>placas de Petri de elastômero de silicone</td></tr><tr><td></td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>diâmetros internos e externos de 0,78 e 1,0 mm (capilares de vidro de paredes finas)</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>diâmetros internos e externos de 1,13 e 1,55 mm (capilares de vidro de parede grossa)Encaixe</td></tr> <tr><td>de polipropileno barpado em miniatura&nbsp;</td><td>Adesivo de tecido Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de microeletrodos</td><td>Sutter Instruments</td><td>&nbsp; Modelo P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Head stage</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado&nbsp; &nbsp;</td><td>Tubulação Tygon</td><td>MP-285</td><td></td>da Sutter Instruments</tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN e PAREDE 1/32 IN (tubulação flexível de laboratório)</td></tr> <tr><td>Suporte de eletrodo</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal Torneiras de Três Vias&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS mais</td><td></td></tr><tr><td>objetiva Achroplan de 40X/0,80W</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição e análise de dados&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex e Clampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modelo P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td colspan="4">Soluções de dissecação e gravação (em mM)</td></tr><tr><td>Todas as soluções, exceto a intracelular, são estáveis por ~ 2-3 meses quando filtradas (copos de filtro de 0,22 mm) e armazenadas em temperatura ambiente (RT).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A solução intracelular é filtrada (filtros de seringa de 0,2 mm) e armazenada congelada (-20 &deg; C) em pequenas alíquotas que são descongeladas individualmente no dia do uso.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecção / Campainha' s solução</td><td></td><td></td><td>145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2,2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (com NaOH)</td></tr><tr><td>Solução de registro</td><td></td><td></td> de pipeta (intracelular) <td>135 KCl, 10 EGTA-ácido, 10 HEPES; pH 7,4 (com KOH).</td></tr><tr><td>Solução de registro de banho (extracelular) / pinça</td><td></td><td></td> de tensão e corrente <td>125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2,2H2O, 5 HEPES; pH 7,4 (com NaOH).</td></tr><tr><td>Solução de estoque de sal de hidrazina Alexa-594.&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Prepare um estoque de 13,2 mM em ddH2O, alíquota (~100 &micro; l) e armazene a -20 ° C. Para uso, dilua a solução de estoque 132 vezes com solução de pipeta até uma concentração final de 100 mM. Após a diluição, filtre a solução de pipeta contendo Alexa-594&nbsp; com um filtro de tubo de centrífuga.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Agentes imobilizadores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4% de sal de etilo 3-aminobenzoato de metanossulfonato (Tricaine)</td><td></td><td></td><td>Prepare uma solução estoque a 0,4% em 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g de Tricaína/100 mL 0,2 M Tris</td></tr><tr><td colspan="4">Ajuste o pH para 7 com NaOH e armazene a -20 °C.</td></tr><tr><td colspan="4">Para uso, dilua a solução estoque ~25 vezes em meio embrionário</td></tr><tr><td>250 mM &alfa;-bungarotoxina</td><td></td><td></td><td>Prepare um estoque de 250 mM em ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 &micro; L alíquotas e sotre a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Para uso, dilua 2.500 vezes com solução extracelular até uma concentração final de 100 nM.</td></tr><tr><td>1 mM Tetrodotoxina</td><td></td><td></td><td>Prepare um estoque de 1 mM em ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 &micro; L alíquotas e sotre a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Para uso, diluir 2.000 vezes com solução extracelular até uma concentração final de 500 nM.</td></tr></tbody></table>

zebrafish<em&gt; in situ</em&gt; spinal cord preparação para gravações eletrofisiológicas da spinal sensorial e motor neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Peixe-zebra, introduzido pela primeira vez como um modelo de desenvolvimento, ganharam popularidade em muitos outros campos. A facilidade de criação de um grande número de organismos em rápido desenvolvimento, combinada com a clareza óptica embrionário, serviu como atributos atraentes iniciais deste modelo. Ao longo das últimas duas décadas, o sucesso deste modelo foi ainda mais impulsionado por sua receptividade às telas de mutagênese em larga escala e pela facilidade de transgenia. Mais recentemente, de edição de gene abordagens ter aumentado a potência do modelo. Para os estudos do neurodesenvolvimento, o embrião do peixe-zebra e larva de fornecer um modelo para que vários métodos podem ser aplicados. Aqui, vamos nos concentrar em métodos que permitem o estudo de uma propriedade essencial de neurônios, excitabilidade elétrica. A nossa preparação para o estudo electrofisiológico de neurónios espinais zebrafish envolve o uso de cola veterinário de sutura para fixar a preparação para uma câmara de registo. Métodos alternativos para gravaçãoa partir de embriões de peixe-zebra e larvas envolver a fixação da preparação para a câmara utilizando um pino fina de tungsténio de 1, 2, 3, 4, 5. Um pino de tungsténio é mais frequentemente usado para montar a preparação de uma orientação lateral, embora tenha sido usado para montar dorso-lateral larvas até 4. A cola de sutura tem sido utilizado para montar os embriões e larvas em ambas as orientações. Usando a cola, uma dissecção mínima pode ser realizada, permitindo o acesso a neurónios espinais sem o uso de um tratamento enzimático, evitando assim qualquer dano resultante. No entanto, para as larvas, é necessário aplicar um breve tratamento com enzima para remover o tecido muscular em torno da medula espinhal. Os métodos aqui descritos têm sido utilizados para estudar as propriedades eléctricas intrínsecas de neurónios motores, interneurónios, e neurónios sensoriais em vários DevelopmentAl módulos 6, 7, 8, 9.

Temos registos com sucesso a partir de neurónios Rohon-Beard em 17 hpf embriões através 7 dpf larvas (Figura 5A e 5B). Quando as células Rohon-Beard foram registados, a preparação foi montada do lado dorsal para cima. Essa montagem permite a identificação inequívoca de células Rohon-Beard com base nas suas posições dorsais superficiais e tamanhos grandes soma. A identificação é adicionalmente confirmada pelo potencial de membrana em repouso hiperpolariza...

Este manuscrito descreve métodos para registos electrofisiolicos de neurónios espinais de embriões de peixe-zebra e larvas. A preparação mantém neurónios in situ e muitas vezes envolve a dissecção mínima. Estes métodos permitem o estudo electrofisiológico de uma variedade de neurónios espinais, a partir da aquisição inicial excitabilidade eléctrica através dos primeiros estádios larvares.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

O objetivo geral desta preparação é permitir o estudo eletrofisiológico de neurônios da medula espinhal de peixe-zebra in situ nas fases embrionária e larval. As análises eletrofisiológicas complementam as abordagens genéticas e de imagem poderosas que também são possíveis com o modelo de peixe-zebra. Embora o método tenha sido originalmente desenvolvido para estudar os neurônios de Rohon-Beard, adaptamos facilmente a abordagem ao longo do tempo e agora podemos estudar vários tipos de neurônios da medula espinhal.Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Rosa Moreno, pesquisadora associada, com quem tive o prazer de colaborar por muitos anos. Para iniciar este procedimento, remova a bolha preta de um dos orifícios de vidro e substitua-a por um adaptador de borracha branco proveniente de outro orifício de vidro. Em seguida, corte um pedaço de tubo flexível com cerca de 38 centímetros de comprimento.Em seguida, conecte o tubo flexível por meio de um pequeno adaptador reto de polipropileno. Para preparar o elastômero de silicone, adicione a base e o agente de cura a um tubo cônico de plástico na proporção de quatro para um. Posteriormente, misture bem a base do elastômero e o agente de cura.Despeje a mistura em dois pratos de Petri de 100 milímetros, com cerca de um milímetro de profundidade em um prato de Petri e cerca de 2,5 milímetros de profundidade no outro. Deixe a elastômero de silicone curar mediante exposição ao ar por quatro a cinco dias. Se for necessário o elastômero curado mais cedo, incube-o a 60 graus Celsius.Em seguida, recorte um retângulo de 3,8 centímetros por 6,3 centímetros do elastômero curado com espessura de um milímetro para servir como base da câmara. Do silicone curado com espessura de 2,5 milímetros, recorte um retângulo de 3,8 centímetros por 6,3 centímetros. Em seguida, recorte desse retângulo um retângulo interno de 2,5 centímetros por cinco centímetros para gerar uma moldura para o topo da câmara.Para preparar a câmara de dissecação, coloque o retângulo fino de silicone diretamente sobre a lâmina de vidro, certificando-se de remover todas as bolhas de ar entre o silicone e o vidro. Em seguida, coloque o retângulo de silicone com moldura sobre a camada inferior fina de silicone. Neste procedimento, coloque um embrião em uma câmara de dissecação contendo dois a três mililitros de solução de Ringer.Imobilize o embrião adicionando 100 microlitros de solução de tricaina 0,4% à câmara. Em seguida, puxe algumas micropipetas de injeção com pontas longas e finas a partir do vidro de parede fina usando um puxador de micropipetas. Fixe uma micropipeta de vidro puxada ao fundo de vidro do dispensador de cola.Sob o microscópio estereoscópico, use pinças para quebrar a ponta da micropipeta de vidro, resultando em uma abertura de aproximadamente 75 micrômetros de diâmetro. Em seguida, carregue a micropipeta de vidro com três a cinco microlitros de cola aplicando sucção através da peça bucal. Traga a ponta cheia de cola até a câmara de dissecação.Em seguida, aproxime a ponta da micropipeta carregada com cola da cabeça do embrião, mantendo uma leve pressão positiva na micropipeta por meio do tubo bucal. Uma vez que a ponta esteja próxima à cabeça do embrião, aplique pressão positiva suficiente para expelir uma pequena gota de cola no fundo da câmara. Utilize um alfinete de dissecação para mover o embrião em direção à gota de cola, de modo que a cabeça entre em contato com a cola.Oriente o embrião com o lado dorsal voltado para cima e pressione a cabeça para garantir um bom contato com a cola. Conforme a cola endurece lentamente, use o alfinete de dissecação para reposicionar o embrião de modo que ele fique com o lado ventral para baixo e o lado dorsal para cima. Mergulhe o alfinete de dissecação na gota de cola e arraste alguns filamentos da cola sobre a cabeça do embrião, atravessando-a, para fixar ainda mais sua posição.Uma vez que a cabeça esteja firmemente presa à silicone e a cola tenha solidificado, sacrifique o embrião por transecção ao nível do cérebro posterior com outra micropipeta de vidro. Use uma micropipeta de vidro nova para cortar superficialmente a pele várias vezes em uma posição caudal ao cérebro posterior. Fure a pele superficialmente movendo a pipeta perpendicularmente ao eixo rostrocaudal em cada lado do tronco para espécimes montados dorsalmente, ou no lado exposto do tronco para espécimes montados lateralmente.Para criar uma aba de pele para a pinça segurar, raspe a pele várias vezes com a micropipeta, no nível e perpendicularmente ao corte inicial. Usando uma pinça, levante gradualmente a aba de pele e puxe a pele em direção caudal. Em seguida, aplique uma pequena gota de cola próximo à cauda do embrião.Use esta cola para fixar a cauda na parte inferior da câmara de dissecação. À medida que a cola endurece, ajuste a posição do tronco com o alfinete de dissecação para garantir que o tronco permaneça orientado dorsalmente e que esteja firmemente preso à câmara. Após esta dissecação inicial, lave extensivamente o preparado com solução de Ringer para remover a tricaina e os detritos, e deixe o preparado repousar por cinco minutos.Em seguida, substitua a solução de dissecação pela solução de registro extracelular. Se necessário, adicione um agente imobilizante ao preparo. Em seguida, transfira a câmara de dissecação com o embrião montado para a platina de um microscópio composto ereto, equipado com uma objetiva de imersão em água de longa distância de trabalho 40 X.Em seguida, acople um capilar vazio de vidro de parede grossa de silicato ao suporte do eletrodo do estágio de cabeçote. Conecte um tubo em uma extremidade à saída de ar do suporte do eletrodo e na outra extremidade a uma torneira de três vias. Depois disso, coloque uma peça bucal em uma extremidade de outro trecho de tubo e conecte-a à torneira de três vias na outra extremidade.Posteriormente, leve a ponta da micropipeta até a porção mais dorsal da medula espinhal e perfure suavemente as meninges. Em seguida, realize movimentos laterais rápidos e curtos para soltar as meninges. Após a ponta da micropipeta atravessar as meninges, avance e levante a micropipeta para puxar as meninges para longe da medula espinhal.Posteriormente, mova o micropipetador em direção rostral, avançando por um a dois hemissegmentos para expor as células de Rohon-Beard. Em nossa experiência, os neurônios de Rohon-Beard são mais frágeis do que outros neurônios espinais. Para mantê-los saudáveis, expomos um ou dois Rohon-Beard por vez.Registros em regime de tensão fixa de correntes para fora e para dentro foram obtidos de neurônios de barba rohon em embriões e larvas com um, dois e sete dias após a fertilização. O potencial de retenção foi de 80 milivolts, e as correntes foram induzidas por um degrau despolarizante até +20 milivolts. No modo de fixação de corrente, a injeção de corrente de 0,35 nanoampère por um milissegundo induz um único potencial de ação nos neurônios de barba rohon tanto em embriões quanto em larvas.Na ausência de estimulação elétrica, os neurônios da barba de Rohon não apresentam disparos espontâneos. O potencial de repouso dos neurônios da barba de Rohon torna-se progressivamente mais negativo à medida que o desenvolvimento avança. Uma vez dominado este método, os embriões podem ser montados e dissecados para expor as barbas de Rohon em até 10 minutos.Como mencionado no protocolo, é importante compreender os fatores que determinam a velocidade com que a cola endurece. Este vídeo destaca os passos críticos para a gravação de neurônios da medula espinhal em peixes-zebra.

zebrafish-situ-spinal-cord-preparation-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo espinhal esquelético. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP segmentar do neurônio motor e células do músculo-alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Este vídeo demonstra um ensaio não invasivo para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra. Ao medir o enrolamento da cauda nos embriões como resultado da despolarização espontânea dos neurônios motores da medula espinhal, um bloqueador dos canais de sódio é aplicado para reduzir a frequência de enrolamento Em seguida, os embriões são imobilizados em agarose e colocados sob um microscópio de fluorescência. Os neurônios motores geneticamente modificados...

Uma abordagem não invasiva para estudar a eletrofisiologia dos neurônios motores em embriões de peixe-zebra

Este vídeo demonstra a gravação de sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra paralisada, posicionando uma micropipeta perto do gânglio da linha lateral e formando uma vedação solta para captura de sinal. A solução extracelular mantém a viabilidade neuronal durante esse processo.

Monitorando sinais elétricos dos neurônios aferentes em uma larva de peixe-zebra imobilizada

Um método simples para gravar os potenciais de campo extracelulares no larval do peixe-zebra é descrita prosencéfalo. O método proporciona um...

Prosencéfalo gravação eletrofisiológico em larval Zebrafish

Nós desenvolvemos uma preparação cordão intacto cérebro espinhal para gravar e monitorar a atividade elétrica através de patches gravação braçadeira dos neurônios e outras células Mauthner reticulospinais em embriões de peixe-zebra. Assim, somos capazes de gravar correntes sinápticas excitatórias e inibitórias, a atividade do canal voltagem-dependentes e potenciais de ação dos neurônios-chave em um embrião em desenvolvimento.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos para permitir gravações e manipulação da atividade neural em um animal intacto.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Os protocolos descritos aqui permitem o estudo das propriedades elétricas de células excitáveis nas condições fisiológicas mais não invasivas, empregando embriões de peixe-zebra em um sistema in vivo, juntamente com um indicador de voltagem geneticamente codificado (GEVI) baseado em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) seletivamente expresso no tipo de célula de interesse.

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

Descrevemos um protocolo para monitorar mudanças na atividade de neurônios diferentes durante comandos motores em um sistema de células ciliadas vertebrados modelo.

Atividade da Linha Lateral Posterior Neurônios Diferentes durante a Natação em Zebrafish

A junção neuromuscular larval do peixe-zebra é um modelo atraente para o estudo da fisiologia sináptica. É passível de muitas técnicas experimentais, incluindo eletrofisiologia e imagens ópticas. Aqui, descrevemos um protocolo para transmissão sináptica de imagem usando uma sonda baseada em pHluorina sob um microscópio de epifluorescência vertical.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Aprenda a preparar a medula espinhal in situ de peixe-zebra para gravações eletrofisiológicas de neurônios sensoriais e motores em embriões e larvas de Danio rerio. Este método permite estudar a excitabilidade elétrica neural durante o desenvolvimento.

zebrafish

Explorar mais vídeos