O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como a expor e remover o cérebro de porco e glândula pituitária pós-morte num estado intacto, adequado para análise macroscópica e histológica subsequente.
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Artigo de método
Exposição do SNC porco para análise histológica: A manual por decapitação, crânio de abertura, e Cérebro Remoção
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os porcos têm se tornado cada vez mais popular em grande animal investigação translacional neurociência como um substituto economicamente e eticamente viável para primatas não-humanos. O tamanho grande do cérebro do porco permite o uso de geradores de imagens cerebrais clínica convencionais e a utilização directa e testes de procedimentos e equipamentos neurocirúrgicos de clínica humana. Uma análise mais aprofundada macroscópico e histológico, no entanto, requer exposição post-mortem do sistema de porco nervoso central (SNC) e subsequente remoção do cérebro. Esta não é uma tarefa fácil, como o porco SNC é encapsulado por uma cabeça dura, ósseo e da coluna vertebral. O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como a expor e remover o cérebro de porco post-mortem e a glândula pituitária num estado intacto, adequado para análise macroscópica e histológica subsequente.
Introdução
estudos de neurociência de translação em suínos têm se tornado cada vez mais popular durante as últimas duas décadas. O grande tamanho do cérebro de porco permite o uso de geradores de imagens cerebrais clínica convencionais e a utilização directa e os ensaios de procedimentos neurocirúrgicos e equipamento de clínica humana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Nos últimos 20 anos, porcos, especialmente porcos chineses (por exemplo, Gottingen minipig), foram usadas para examinar as modalidades de tratamento neuromoduladores, tais como transplante de células estaminais; transfecção de vector viral; e estimulação cerebral profunda dirigida para a doença de Parkinson, obesidade, depressão, doença de Alzheimer e 2, 6,= "refex"> 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Esta foi seguida pelo desenvolvimento de abordagens cirúrgicas estereotáxicas e para manipular o minipig SNC 3, 18, 19, 20, 21. As alterações do sistema nervoso central instituídos foram avaliadas em animais vivos utilizando imagiologia cerebral (PET 10, 13, 22, 24 e 23 MR), cistometria 11, 12, 25, a análise da marcha17, a avaliação neurológica 9, 17, e exame pós-morte com base na histologia e análise estereologia 14, 15, 17, 26, 27, 31. No entanto, a análise post-mortem requer a exposição e a remoção do cérebro de porco, que não é uma tarefa fácil, como uma cabeça dura, ósseo e uma dura-máter fibrosa que cobre rodeiam o cérebro de porco.
O objectivo deste trabalho e vídeo de instruções é descrever como o cérebro de porco post-mortem e na pituitária podem ser expostos e removido em estado intacto em 15-20 min, utilizando instrumentos cirúrgicos não motorizados. O vídeo de instruções e ilustrações fotográficas mostram miniporcos do sexo masculino (idade: 6 meses, peso corporal: 20-25 kg) utilizados para um estudo anatômico na glândula pituitária minipig.
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Protocolo
A anestesia dos animais e euthanesia foi realizada em conformidade com o "Princípios de cuidados de animais de laboratório" (publicação NIH No. 86-23, revista 1985) e aprovado pelo Conselho dinamarquês para animal de Ética.
1. Instrumentos
- Recolher os instrumentos apresentados no vídeo e listadas na Tabela de Materiais.
2. decapitação
NOTA: A anestesia foi induzida através de uma injecção intramuscular de 5 ml de midazolam (5 mg / ml) e 5 ml de cetamina (25 mg / mL). 5-10 minutos mais tarde, quando o animal foi profundamente sedados, uma veia da orelha foi canulada e uma sobredosagem letal (100 mg / kg de peso corporal) com pentobarbital de sódio (200 mg / mL) foi administrada por via intravenosa. Para assegurar que o animal estava completamente sacrificados, o reflexo dor interdigital foi testado como mostrado por Ettrup et al. (2011) 20. eutanásia completa foi assegurada, conforme descrito noa instrução ética acima e seguido por uma perfusão transcardial com 5 L de solução salina isotónica, tal como demonstrado por Ettrup et al. (2011) 20. Todos os procedimentos são realizados demonstraram post-mortem, excluindo a necessidade das precauções necessárias para o bem-estar anestesia longo prazo e sobrevivência pós-procedimento.
- Decapitar o porco por um elevado incisão cervical circular, usando um bisturi cirúrgico, um pouco abaixo do ângulo de mandíbula (Figura 1A).
- Ainda com o bisturi cirúrgico, continuar a incisão anterior através do tecido mole do pescoço, incluindo a laringe e o esago, até que a coluna vertebral óssea é atingido, aproximadamente ao nível da junção crânio-cervical.
- Avançar o corte com um bisturi cirúrgico a partir do lado anterior da junção crânio-cervical, acima do arco anterior do atlas, e através da membrana atlanto anterior, expondo desse modo o canal vertebral e da medula espinhal (A Figura 1B). Simultaneamente pedir um assistente para puxar o corpo de porco longe da cabeça de porco para facilitar o acesso entre a base do crânio ea primeira vértebra cervical.
- Continue a incisão cirúrgica através do saco durai e a medula espinal (Figura 1B). Tomar cuidado especial para assegurar que o corte transversal completo da medula espinal é conseguido.
NOTA: A incapacidade de realizar a etapa anterior pode resultar em tração indesejada sobre a medula espinhal e do cérebro durante as seguintes etapas do processo de decapitação. - Vigorosamente estender a junção cranocervical ao nível da secção (Figura 1C). Ao mesmo tempo, utilizar o bisturi cirúrgico para os restantes secção ligamentos atlanto para soltar a articulação entre os côndilos occipitais e o processo articular superior do atlas. Separar a cabeça do porco do corpo.
Figura 1: Minipig decapitação. Incisão (A) Pescoço (seta, o ângulo da mandíbula). (B) A incisão através dos ligamentos atlanto e da medula espinhal rodeado-dura (SC) na junção craniocervical (C1, arco anterior do atlas; OC, côndilo occipital). (C) A parte posterior da articulação atlanto é libertado por uma extensão vigorosa (setas) ao nível de secção. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Crânio Abertura
- Posicionar a cabeça de porco em uma mesa.
- Faça uma incisão longitudinal dorsal com um bisturi cirúrgico através da pele e dos tecidos moles subjacente da parte de trás do focinho, sobre o vértice da cabeça, e para baixo através da parte posterior doa região occipital.
- Expor a parte dorsal e posterior do crânio, removendo o tecido macio localizado lateral à incisão inicial com um bisturi cirúrgico.
- Libertar o músculo temporal bilateral a partir do crânio (Figura 2A) com um bisturi cirúrgico. Certifique-se de que o osso occipital posterior é limpo de tecidos moles.
- Utilizar a entrada posterior do forâmen magno para remover o osso occipital com um Kerrison perfurador e osso rongeurs osso e expor o cerebelo coberto-dura (Figura 2B).
- Retornar para o lado anterior exposta do crânio e selecione um ponto de entrada no osso frontal, mesmo em frente dos olhos. Neste ponto, usar um cinzel osso com um martelo para penetrar o crânio e entrar no seio frontal (Figura 2C).
- Utilizar a extensão do seio frontal para promover a remoção da lâmina dorsoposterior crânio exterior com um rongeur óssea ou soco e expor o interior, finalâmina crânio ósseo cobrindo o cérebro (Figura 2D).
- Suavemente abrir o interior lâmina crânio ósseo anteriormente com um martelo e um cinzel osso para expor o cérebro coberto-dura (Figura 2E).
- Continuar a remoção de osso lateralmente utilizando um cinzel osso e um rongeur osso através do osso temporal e parietal, a fim de libertar a parte dorsoposterior final do crânio, localizada entre as partes já expostas do cérebro e cerebelo coberto-dura (Figura 2F).
NOTA: Muitas vezes, é possível, durante a etapa final deste processo, para usar o cinzel de abrir o restante do osso do crânio posterior de um lado, como se abre uma porta.
Figura 2: Minipig abertura crânio. (A) Exposição da dorsoposteriosuperfície do crânio r, incluindo a remoção do occipital e temporal do músculo. (B) A remoção do osso occipital (CB, cerebelo coberto-dura; OB, osso occipital; OC, côndilo occipital; e SC, medula espinal). (C) Um martelo e um cinzel osso são utilizadas para penetrar o crânio anteriormente e para introduzir o seio frontal ao nível dos olhos. (D) A extensão do seio frontal (FS) é utilizado para remover o osso do crânio espessa exterior (1), expondo uma lâmina óssea fina interior (2), cobrindo o cérebro. (E) Remoção da lâmina óssea fina, expondo o cérebro coberto-dura (seta). (F) Por fim, um martelo e um cinzel osso são utilizadas para ligar lateralmente o anterior e as aberturas posterior do crânio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. REMOV Cérebroai
- Use uma pinça cirúrgica para levantar a dura e criar uma incisão perto suave para o seio sagital superior venosa utilizando um bisturi cirúrgico fina (Figura 3A).
- Use micro-tesoura ou uma dura-faca para abrir ainda mais a dura-máter que cobre a superfície dorsal do cérebro.
NOTA: cuidado especial deve ser feita quando a remoção da dura-máter correspondente ao tentorium cerebelo (Figura 3B), com a preservação deste folha dural irá impedir a remoção do cérebro posterior. - Posicionar a cabeça de porco verticalmente (Figura 3C).
- Utilizar o cinzel osso ou um dissecador para libertar o cérebro ventroanterior por dissecção romba do bolbo olfactivo do piso coberto de dura-máter da cavidade craniana (Figura 3D).
- Use um bisturi cirúrgico multa a seção do quiasma exposta (Figura 3E). Expor e secção da haste hipofisária e os nervos oculomotores.
- Solte o tronco cerebral ventral pela secção do lonervos cranianos WER (Figura 3F), com um bisturi cirúrgico fina. Certifique-se de que o tentorium cerebelar durai foi completamente incisão (Figura 3B), como esta folha da dura-máter, de outro modo atravessam o tronco cerebral durante o processo de libertação.
Figura 3: Remoção do cérebro Minipig. Abertura (A) dural com pinça cirúrgica e uma faca de dura-máter. (B) Cuidados devem ser tomados para inciso completamente a folha de dural (seta), localizado entre o cérebro e cerebelo. (C) A cabeça de porco é posicionado verticalmente para melhor visualização das estruturas da base do crânio e em ordem para a gravidade para ajudar no deslocamento pretendida do cérebro. (D) Um de dissecção ou um cinzel osso é usado para aliviar o bolbo olfactivo por secção romba da dura-covered da base do crânio. (E) A dissecção é continuada numa direcção posterior ao longo da base do crânio para exposição e seccionamento do quiasma óptico (seta), haste infundibular, e nervos oculomotores. (F) A libertação do cérebro é completado com a secção dos nervos cranianos inferiores tal como estas se afastem da superfície ventral do tronco cerebral (III, nervo oculomotor; IV, nervo troclear; V, nervo trigeminal; e VI, abducens nervo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. pituitária Remoção
- Identificar o talo pituitária e a sua folha dural circundante (da sela diapragma) no andar crânio (Figura 4A).
- Incisão lateral da folha da dura-máter com a haste hipofisária usando um bisturi cirúrgico fino (Figura 4B).
- Use um dissector para liberar o poçouitary e levantá-lo para fora da fossa pituitária (Figura 4C).
Figura 4: Minipig remoção da pituitária. (A) A fossa pituitária (*) é identificado no chão crânio (1, bolbo olfactivo; 2, quiasma; e PF, fossa posterior). (B) A cobertura dural (diagphragm selar, (seta)) é incisado lateralmente. (C) A pituitária (seta) é libertado com um dissecador e elevado para fora da fossa pituitária. Escala da barra (AC) = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Resultados
Para evitar que o material tecido de secar, recomenda-se a armazenar o cérebro removido e pituitária em um frasco cheio com o fixador ou solução salina isotónica imediatamente após análise macroscópica foi realizada. O material de tecido pode ser armazenado no fixador por ano, ao passo que o armazenamento em solução salina isotónica, mesmo no frigorífico, irá conduzir à deterioração do tecido com o tempo.
A pituitária removida...
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Discussão
A maior parte dos estudos experimentais neuroscience são realizados em espécies animais pequenos, tais como ratinhos e ratos, em que o acesso ao SNC é facilitado por um de espessura da dura-máter e o crânio fina. No entanto, em animais experimentais maiores, como porcos 1, 4, 8, ovinos 32, e primatas não-humanos, a espessura considerável destas estruturas que requer a utilização de instrumentos robustos ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem com gratidão a ajuda hábil de Sra Trine W. Mikkelsen, Sra Lise M. Fitting, e os funcionários da Påskehøjgaard. O Medical Conselho Dinamarquês de Pesquisas, a Fundação Lundbeck, ea Nordisk Fundação Novo suportado financeiramente o estudo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cabo de Bisturi Pesado #4 | FST (Ferramentas de Ciência Fina) | 10008-13 | Bom para incisão na pele e remoção de tecidos |
| moles Lâminas de bisturi não estéreis #23 | FST | 10023-00 | |
| #7 | FST | 10007-12 | Ideal para incisão dural e trabalho de precisão |
| Lâminas de bisturi não estéreis #11 | FST | 10011-00 | |
| Fórceps Cirúrgico | FST | 11024-18 | A ponta da pinça cirúrgica garante uma pegada firme |
| Kerrison Bone Punch | Aesculap Neurosurgery | FF713R | Deve ser robusto, tamanho da mordida 3-5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | MD615 | Deve ser robusto, tamanho da mordida 15 x 5 mm |
| Bone Rongeur | Aesculap Neurosurgery | FO551R | Deve ser robusto, tamanho da mordida 25 x 15 mm |
| Cinzel de Osso | Lawton | 67-0335 | O tamanho da cabeça do cinzel não deve exceder 20 mm |
| Martelo (Martelo) | Millarco | 5624108 | Peso 300 g, comprimento 30 cm, tamanho da área de impacto da cabeça 2 x 2 cm |
| Micro-Scissor | FST | 14002-14 | |
| Dissector | Aesculap Neurocirurgia | OL165R | |
| Gö ttingen minipigs | Ellegaard Gö ttingen Minipigs A/S, Dinamarca | ||
| Euthanimal | pentobarbital | ||
| Cetamina | Pfizer | ||
| Midazolam | Hameln Farmacêutica |
Referências
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Reimpressões e permissões
