Um método versátil de padronização proteínas e células

Summary

Este relatório descreve uma técnica simples e fácil de executar, usando vácuo de baixa pressão, para preencher canais microfluídicos com células e substratos para pesquisa biológica.

Abstract

As técnicas de padronização de substrato e célula são amplamente utilizadas em biologia celular para estudar as interações célula a célula e célula a substrato. As técnicas convencionais de padronização funcionam bem apenas com formas simples, pequenas áreas e biomateriais selecionados. Este artigo descreve um método para distribuir suspensões celulares, bem como soluções de substrato, em microcanais complexos, longos, fechados (sem saída) de polidimetilsiloxano (PDMS) usando pressão negativa. Este método permite que os pesquisadores padronizem vários substratos, incluindo fibronectina, colágeno, anticorpos (Sal-1), poli-D-lisina (PDL) e laminina. A padronização de substratos permite padronizar indiretamente uma variedade de células. Testamos mioblastos C2C12, a linhagem celular neuronal PC12, neurônios corticais embrionários de ratos e neurônios retinianos anfíbios. Além disso, demonstramos que essa técnica pode padronizar diretamente os fibroblastos em canais microfluídicos por meio da breve aplicação de um baixo vácuo em suspensões celulares. O baixo vácuo não diminui significativamente a viabilidade celular, conforme mostrado pelos ensaios de viabilidade celular. Modificações são discutidas para aplicação do método a diferentes tipos de células e substratos. Essa técnica permite que os pesquisadores padronizem células e proteínas em padrões específicos sem a necessidade de materiais ou equipamentos exóticos e pode ser feita em qualquer laboratório com vácuo.

Introduction

Em engenharia de tecidos e biosensing, a capacidade de controlar a organização espacial de proteínas e células em uma escala um, tornou-se cada vez mais importante ao longo das últimas quatro décadas ^{1, 2, 3.} Organização espacial precisa de proteínas e células tem permitido aos pesquisadores examinar a interação entre as células e os substratos que contêm tipos semelhantes ou diferentes de células, para orientar o crescimento celular, e para imobilizar biomoléculas para a fabricação de biossensores ^{4, 5,} <....

Protocol

NOTA: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Alguns dos produtos químicos utilizados no presente protocolo são tóxicos e cancerígenos. Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas (extractor de fumo, porta-luvas) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, sapatos fechados) ao utilizar materiais tóxicos ou ácido / base.

1. Fabricação de Mestre Moldes para macio Litografia usando fotolitografia

1. Desenhar o layout dos microcanais, utilizando uma ferramenta de desenho assistido por computador (CAD).
2. Imprim....

Results

Este método permite a padronização de proteínas e padronização indireta de células usando canais microfluídicos sem saída com dimensões tão pequenas quanto 10 mm e equipamentos disponíveis em quase todos os laboratórios biológicos uma vez que o molde mestre é feita. Esta técnica pode ser utilizada com canais microfluídicos PDMS criados usando fotolitografia suave tradicional, ou com canais microfluídicos PDMS criadas com fita adesiva de fabricação (Figura 1)

Discussion

Enquanto fotolitografia convencional é uma técnica bem estabelecida para a realização de moldes de litografia macia, o equipamento, materiais, e as competências necessárias para utilizar fotolitografia convencional não estão prontamente disponíveis para a maioria dos laboratórios. Para laboratórios que não têm acesso a esses recursos, nós apresentamos a fabricação de fita adesiva como um método de criação de moldes com características relativamente simples para dispositivos microfluídicos. Este método permite que qualqu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ferramentas de desenho CAD CorelDRAW X4	Corel Corporation, Canadá	X4 Versão 14.0.0.701	Ferramenta CAD usada para desenhar o layout do dispositivo microfluídico
Impressora a laser HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Usada para imprimir o layout do dispositivo microfluídico para técnica de fita adesiva
Bel-Art Dessecator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Usado para desgaseificar a mistura
PDMSFita adesiva escocesa	3M Produto, MN	Tape 600	Usado para fabricar fita adesiva Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Fundição de polímero
Petri Dish	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Usado para manter o molde para fundir com PDMS
Bisturi de aço inoxidável com lâmina (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Japão	2976 # 11	Usado para cortar o PDMS
Pinças	Ted Pella, CA	5627-07	Usado para manusear o molde PDMS durante o descascamento
de lâminas de vidro	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Usado como superfície para padronizar as
lâminas de vidro	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Usado como superfície para padronizar o rolo de borracha de substrato
	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Usado para fixar fita adesiva em vidro sem prender bolhas de ar
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Alemanha	DWL66fs	Usado para fabricar máscara de quartzo usado no processo de fabricação de fotolitografia
EVG Mask Aligner (ferramenta de exposição UV de fotolitografia)	EV Group, Alemanha	EVG 620T (B)	Usado para expor o fotorresistente à luz UV
Spin Coater Headway	Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Usado para girar o revestimento do fotorresiste em wafer de silício
Fotorresistes SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Fotorresistente negativo usado para fabricação de moldes
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Desenvolvedor de fotorresistência
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahidrooctil-1-Triclorossilano	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Molde de revestimento para evitar a adesão de PDMS
Isopropanol	Sigma-Aldrich, MO	Solvente de	Limpeza
Etanol	Sigma-Aldrich, MO	24102	Solvente de Esterilização
Bromidrato de Poli-D-Lisina (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	A solução de PDL é feita a 0,1 mg/mL em Tampão Tetraborato de Sódio
Laminina	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Laminina aliquotada em 10 µ L alíquotas e diluídas a 20 µ g/µ L em PBS antes de usar BSA
	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Cultura de células
C2C12 Linha de células de mioblast	ATCC, VA	CRL-1722	Usado para demonstrar a padronização de C2C12
Linha celular PC12	ATCC, VA	CRL-1721	Usado para demonstrar a padronização de PC12
Colágeno tipo 1, cauda de rato	BD Biosciences	40236	Cultura de células
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Cultura de células
Soro de cavalo, inativado por calor	Fisher Scientific, MA	26050-070	Cultura de células
Faloidina-tetrametilrodamina B isotiocianato (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	Para rotular células
Calceína-AM células mortas vivas Kit de ensaio	Invitrogen, MA	L-3224	Viabilidade celular Ensaio
Biópsia Perfurador	Ted Pella, CA	15110-10	Furo perfurado no PDMS