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Artigo de método

Melhorando a Força, o Poder, a Capacidade Aeróbia Muscular e a Tolerância à Glucose através do Treinamento de Força Progressiva de Curto Prazo entre Pessoas Idosas

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DOI:

10.3791/55518

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5 de julho de 2017

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1Åstrand Laboratory of Work Physiology, The Swedish School of Sport and Health Sciences, GIH, 2Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet

Neste artigo

Resumo

O efeito do treinamento de resistência a curto prazo em pessoas idosas foi investigado através do uso simultâneo de vários métodos. Em comparação com um grupo de controle, foram observadas muitas melhorias, incluindo a capacidade aeróbica muscular, tolerância à glicose, força, potência e qualidade muscular ( ie, proteína envolvida na sinalização celular e composição do tipo de fibra muscular).

Resumo

Este protocolo descreve o uso simultâneo de uma ampla gama de métodos para examinar a capacidade aeróbica do músculo, tolerância à glicose, força e poder em pessoas idosas com treinamento de resistência a curto prazo (RET). O treinamento de resistência progressiva supervisionada por 1 h três vezes por semana durante 8 semanas foi realizado por participantes RET (71 ± 1 ano, intervalo 65-80). Em comparação com um grupo de controle sem treinamento, o RET apresentou melhorias nas medidas usadas para indicar força, potência, tolerância à glicose e vários parâmetros de capacidade aeróbica muscular. O treinamento de força foi realizado em uma academia com apenas equipamento de ginástica robusto. Um dinamômetro isocinético para a extensão do joelho permitiu a medição da força concêntrica, excêntrica e estática, que aumentou para o grupo RET (8-12% pós-versus pré-teste). O poder (taxa de desenvolvimento de força, RFD) nos primeiros 0-30 ms também mostrou um aumento para o grupo RET (52%). Um teste de tolerância à glicose com frequeAs medições de glicose no sangue nt mostraram melhorias apenas para o grupo RET em termos de valores de glicemia após 2 h (14%) e a área sob a curva (21%). O perfil lipídico do sangue também melhorou (8%). A partir de amostras de biópsias musculares preparadas usando histoquímica, a quantidade de fibra tipo IIa aumentou e uma tendência para uma diminuição em IIx no grupo RET refletiu uma mudança para um perfil mais oxidativo em termos de composição de fibras. Western blot (para determinar o conteúdo de proteína relacionado à sinalização para síntese de proteínas musculares) mostrou um aumento de 69% tanto em Akt quanto em mTOR no grupo RET; Isso também mostrou um aumento nas proteínas mitocondriais para OXPHOS complexo II e citrato sintase (ambos ~ 30%) e para IV complexo (90%), apenas no grupo RET. Demonstamos que este tipo de treinamento de resistência progressiva oferece várias melhorias ( por exemplo, força, potência, capacidade aeróbica, tolerância à glicose e perfil lipídico plasmático).

Introdução

O envelhecimento está associado a perda de massa muscular (sarcopenia), força e poder. A força reduzida, e provavelmente ainda mais importante, o poder, resulta em imobilidade, um risco aumentado de lesões e uma qualidade de vida reduzida. O treinamento de resistência é uma estratégia bem conhecida para contrariar a sarcopenia e a deterioração da função muscular. Uma estimativa aproximada da força muscular pode ser obtida a partir da carga ou número de repetições alcançadas. No entanto, este estudo obteve informações mais detalhadas e precisas sobre a função muscular usando um dinamômetro isocinético para coletar informações sobre o torque durante a contração isométrica, concêntrica e excêntrica, bem como sobre a cinética do desenvolvimento da força.

A capacidade aeróbica, tanto no nível do corpo inteiro (VO 2max ) quanto no músculo esquelético, é reduzida em pessoas idosas. O declínio da frequência cardíaca com a idade explica uma grande parte da diminuição do VO 2max 1 , mas reduzidoA capacidade oxidativa, em grande parte relacionada à redução da atividade física 2 , contribui. A função mitocondrial comprometida também pode estar envolvida no desenvolvimento de sarcopenia e resistência à insulina 3 . A capacidade aeróbica do músculo foi avaliada em biópsias musculares através de análises bioquímicas dos conteúdos de enzimas mitocondriais e complexos proteicos localizados tanto na matriz ( isto é, citrato sintase) como na membrana mitocondrial interna. Além disso, as técnicas histoquímicas foram usadas para medir o efeito do treinamento de resistência na morfologia muscular ( ie, composição do tipo de fibra, área de seção transversal da fibra e densidade capilar). Um método alternativo para avaliar a capacidade aeróbica do músculo seria usar espectroscopia de ressonância magnética para medir a taxa de resíntese de fosfato de creatina após depleção induzida pelo exercício 4 . Este método fornece uma estimativa da capacitação aeróbica do músculo in vivoY, mas não pode discriminar entre disfunção mitocondrial e distúrbios circulatórios. Além disso, os altos custos de equipamentos limitam o uso desta técnica na maioria dos laboratórios. A capacidade aeróbica (VO 2max e densidade mitocondrial) pode ser melhorada pelo exercício de resistência em indivíduos jovens e idosos 5 , 6 . No entanto, o efeito do treinamento de resistência nesses parâmetros tem sido menos investigado, especialmente em indivíduos idosos, e os resultados estão em conflito 7 , 8 , 9 , 10 .

A diabetes tipo 2 é uma doença generalizada na população idosa. A inatividade física ea obesidade são fatores importantes relacionados ao estilo de vida, explicando o aumento da incidência de diabetes tipo 2. O exercício aeróbico de baixa intensidade é freqüentemente recomendado para indivíduos com tolerância reduzida à glicose. No entanto, é uncSaiba como o treinamento de força em idosos afeta a tolerância à glicose / sensibilidade à insulina 11 , 12 . A maneira mais precisa de medir a sensibilidade à insulina é usar a técnica de grampeamento de glicose, onde a glicose no sangue é mantida constante por infusão de glicose durante condições de insulina elevada 13 . As desvantagens com esta técnica são que é demorado e invasivo (cateterização arterial) e requer instalações laboratoriais especiais. Neste estudo, utilizou-se o teste de tolerância oral à glicose, que é comum nas unidades de saúde. Este método é adequado quando vários assuntos devem ser investigados por um período de tempo limitado.

O teste e a linha de tempo do procedimento experimental podem ser resumidos da seguinte forma. Use três dias separados para testar antes e depois de um período de oito semanas, com o mesmo arranjo e horários aproximados (≥24 h entre cada dia, < Forte> Figura 1). No primeiro dia do teste, medir: dados antropométricos, como altura, massa corporal, massa livre de gordura (FFM) e circunferência da perna superior ( ou seja, 15 cm acima do pico do ápice em posição supina relaxada); Capacidade de ciclagem submáxima; E força muscular do joelho, conforme descrito nas etapas 4 e 5. Pegue uma biópsia muscular da coxa no segundo dia do teste. Para mais descrições, veja o passo 6.1. Teste a tolerância oral à glicose (OGTT) no último dia do teste. Para mais descrições, veja o passo 7.1. Peça a todos os participantes que evitem atividade física vigorosa durante 24 h e que sejam rápidos durante a noite antes de cada dia do teste. No entanto, peça-lhes que evitem atividade física extenuante durante 48 h antes do dia do teste OGTT. Peça-lhes que sigam suas atividades físicas diárias normais e hábitos de dieta. Note-se que a pré e a pós-intervenção, a ingestão de alimentos e o tipo de alimentos de ambos os grupos foram inalterados.

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Figura 1: protocolo experimental. Diagrama esquemático. O tempo entre os três pré e pós-testes foi semelhante para cada assunto e foi pelo menos 24 h. Mais detalhes são fornecidos no texto. Esta figura foi modificada de Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Esportes . 2016: 26, 764-73. 28 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este estudo procurou investigar o efeito do treinamento de resistência a curto prazo em idosos sobre a capacidade oxidativa muscular e tolerância à glicose. O segundo objetivo foi examinar o efeito sobre a força, potência e melhorias qualitativas musculares ( ie, proteínas envolvidas na sinalização celular e composição do tipo de fibra muscular).

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Protocolo

O Comitê Regional de Ética de Estocolmo, Suécia, aprovou o projeto da investigação.

1. Material

  1. Recrute mulheres e homens relativamente saudáveis ​​de 65 a 80 anos com valores de IMC entre 20 e 30 kg · m -2 . Randomize-os em dois grupos. Certifique-se de que os indivíduos em ambos os grupos tenham níveis de atividade física relativamente baixos ( isto é, atividade física diária moderada e sem treinamento físico regular).
  2. Excluir usuários de bloqueadores beta e aqueles com doença arterial coronariana e problemas neurológicos ou articulares severos.
  3. Peça aos sujeitos por seu consentimento por escrito depois de informá-los sobre possíveis desconfortos e riscos no teste e nas sessões de treinamento.
  4. Balance o treinamento de resistência (RET) e controle sem grupos de treinamento (CON) em termos de idade, sexo e IMC. Peça a um grupo que realize RET sob um treinador por 1 h três vezes por semana durante oito semanas; O outro grupo servirá como controLs (CON).

2. Testes e treinamento

Nota: Os oito exercícios são exercícios de treinamento de força padrão: pressão de perna sentada, pressão abdominal sentada, prensa de tórax em decúbito dorsal, extensão traseira sentada, prensa de ombro sentada, remo a pé sentado, extensão da perna sentada e extensão de joelho propenso (flexão do joelho) ; Veja a Figura 8 na seção Resultados Representativos.

  1. Durante a primeira sessão de treinamento, avalie a força máxima em uma repetição máxima (1 RM) para cada exercício de treinamento.
    NOTA: O modelo 1 RM é comumente usado e é definido como a carga na qual o sujeito pode levantar ou empurrar a resistência apenas uma vez, mas não duas vezes.
    1. Antes do início, peça ao participante que realize um aquecimento curto (com alguns ensaios iniciais com cargas de peso muito baixas) do exercício testado. Posteriormente, aumente a carga até ficar abaixo do provável valor de 1 RM (na maioria das vezes, o máximo de 3-4 aumentouPublicidades). Registre a carga máxima que o sujeito pode executar apenas uma vez (= 1 RM).
    2. Medir 1 RM nos oito exercícios de treinamento de força padrão (veja a Figura 8 na seção Resultados Representativos). Peça aos indivíduos para descansar por pelo menos 2-3 minutos entre cada exercício testado.
      NOTA: O equipamento de treinamento de força foi usado para todos os exercícios de treinamento, incluindo os testes de cada exercício de treinamento.
  2. Peça a todo o grupo RET para realizar 1 h de treinamento de força supervisionada três vezes por semana durante oito semanas. Peça aos participantes que realizem, após o aquecimento, os oito exercícios de treinamento padrão acima mencionados. Eles devem repetir um exercício 12 vezes em cada conjunto e executar três conjuntos de cada exercício. Deixe descansar por 1 minuto entre cada conjunto e 2-3 minutos entre cada exercício.
    1. Peça aos indivíduos que realizem cada exercício o mais rápido possível durante a fase concêntrica ( ie, fase de encurtamento muscular) e lentamente durante a faseFase excêntrica ( ie, fase de alongamento muscular).
      NOTA: Os indivíduos podem fazer os exercícios em qualquer ordem. No entanto, peça-lhes para começar e terminar com um exercício de perna e também para tentar executar os oito exercícios na ordem apresentada. Use equipamentos de treinamento de força para os oito exercícios.
    2. Durante cada sessão de treino, peça aos participantes que realizem três conjuntos em 75-80% de 1 RM para cada exercício. Aumente a carga em aproximadamente 5% da sessão após quando um participante pode fazer 12 repetições em todos os três conjuntos de exercícios.

3. Teste de ciclismo submaximal

Nota: Execute o teste de ciclismo submáximo no primeiro dia do teste (veja a Introdução e a Figura 1 ).

  1. Execute um teste de ciclo ergômetro, incluindo dois níveis submáximos, cada um por 4 min 14 , 15 . Defina a primeira taxa de trabalho como baixa (30 W) e a segunda em 60-120 W, sem pausa entre as cargas no cicloergômetro.
    NOTA: A primeira carga é a mesma para todos os assuntos, mas o segundo e o último nível submáximo devem ser de aproximadamente 65 a 85% da freqüência cardíaca máxima para cada assunto. Ambas as cargas devem ser as mesmas antes e após o período de intervenção de 8 semanas de treinamento.
    1. Baseie o segundo nível de carga mais alto em testes de familiarização realizados antes dos ensaios, perguntando como a pessoa é fisicamente ativa e fazendo com que o assunto inicialmente circule por um curto período de tempo; O líder do teste formará uma opinião baseada na frequência cardíaca do sujeito quanto à carga submaximal final apropriada.
    2. Registre a freqüência cardíaca constante média (FC) usando um monitor de freqüência cardíaca através de um cinto de caixa no último minuto nas baixas e altas taxas de trabalho, tomando a média da HR observada às 3:15, 3:30, 3:45 E 4:00 min a cada taxa de trabalho.
    3. Use um dispositivo ergo-espirométrico para verificar a composição do gás (O 2 e CO 2 ) no ar expirado e inspirado. Registre a relação de troca de respiração (RER, ou seja, CO 2 / O 2 ) e quantifique os valores médios de RER durante o último minuto (de quatro medidas a cada 15 s) em ambas as cargas de taxa de trabalho.

4. Força do extensor do joelho: torque de pico estático, excêntrico e concêntrico e o desenvolvimento da taxa de força

Nota: Execute medidas de resistência do joelho no primeiro dia do teste (veja a Introdução e a Figura 1 ).

  1. Antes das gravações, peça ao sujeito que realize um aquecimento aquecendo durante 8-10 minutos em um cicloergômetro no nível submáximo (ou seja, aproximadamente 65-85% da freqüência cardíaca máxima).
  2. Peça ao sujeito que se sente no banco de um dinamômetro isocinético. Corrija o tronco do sujeito com tiras sobre os ombros e quadris. Fixe firmemente a haste do sujeito ao eixo do dinamômetro com duas correias: uma abaixo do joelho e uma apenas abovE o tornozelo. Alinhe o eixo articulado do joelho com o centro de rotação do eixo do dinamômetro.
  3. Quando o sujeito estiver seguro, avalie a força de joelho voluntária máxima como o torque de pico, com o sujeito sentado no dinamômetro isocinético. Inicialmente, permita que o sujeito execute vários ensaios para familiarização com o equipamento de resistência do joelho (dinamômetro isocinético).
  4. Peça ao indivíduo que execute quatro extensões de joelho excêntricas e concentradas máximas (alternadamente), com a perna direita a uma velocidade angular constante de 30 graus / s. Defina o intervalo de movimento entre 90 ° e 15 ° (perna reta = 0 °).
    1. Na tarefa excêntrica, peça ao sujeito que resista ao eixo do dinamômetro com esforço máximo através de todo o movimento do ângulo de joelho de 15 ° a 90 °. Na tarefa concêntrica, pergunte ao sujeito para pressionar a perna no eixo do dinamômetro em uma extensão do joelho, com a maior força possível em toda a faixa de movimento.
  5. Permita um descanso de 4 minutos após as gravações dinâmicas. Posteriormente, avalie o torque de contração voluntária máximo estático (MVC) quatro vezes em um ângulo de joelho de 65 °. Em cada teste estático, peça aos sujeitos, sentados no mesmo dinamômetro, para chutar o mais rápido e o mais difícil possível contra o eixo do dinamômetro, que agora está fixo (a 65 °) e não pode ser movido.
  6. Para sinais de torque (força), converta os sinais de torque analógicos em digital usando uma caixa conversora analógico-digital conectada ao dinamômetro isocinético.
    NOTA: O conversor altera automaticamente os sinais analógicos do dinamômetro para sinais digitais, que posteriormente são exportados automaticamente para o computador onde os dados são coletados.
    1. Defina a frequência de amostragem a 5 kHz no programa de análise de software do computador. Armazene os sinais digitais no computador para uma análise de valor de força subseqüente com o programa de análise de software.
  7. Na análise subseqüente, useO maior valor obtido a partir de quatro ensaios para cada assunto nas medidas excêntricas, concêntricas e estáticas. No programa de software, clique no valor mais alto dos quatro ensaios e anote o valor de força mostrado na tela do computador.
    1. Registre o torque de pico mais alto nas gravações excêntricas e concêntricas para cada assunto e o maior valor de força entre os quatro testes estáticos.
      NOTA: O teste do dinamômetro isocinético da força do extensor do joelho em uma posição sentada tem confiabilidade e validade adequada 16 , 17 .
  8. Mude a taxa de desenvolvimento de força (torque) (RFD) durante 0-30 ms e 0-200 ms no valor mais alto encontrado entre os testes estáticos. Defina o valor de zero no nível de 7,5 Nm para o início da contração para a força do extensor do joelho (tempo: 0 ms) 18 , 19 . Mova o cursor (no programa de software para músculoAnálise de força) para o valor de "7,5 Nm" na escala y para obter a posição por 0 ms.
    1. Para a avaliação pré-teste, posicione o cursor no valor de 30 ms (após o tempo 0 ms). Anote o valor que mostra o aumento em Nm a 30 ms ( ou seja, o aumento em Nm de 7,5 Nm = 0 ms). Faça o mesmo procedimento para o valor pós-teste.
    2. Calcule o aumento na porcentagem para o valor Nm pós-teste (numerador) comparado ao valor Nm pré-teste (denominador) no período de 0 a 30 ms. Assim, apresente o aumento de RFD em porcentagem do pré-teste para o pós-teste. Faça as mesmas análises para o intervalo de tempo de 0-200 ms.

5. Biopsia muscular

Nota: Realize uma biópsia muscular no dia de teste 2 (veja a Introdução e a Figura 1 ).

  1. Pegue uma biópsia muscular a partir da porção do meio do músculo da coxa vastus lateralis usando um conchotomo 20 .
    1. Antes da biópsia, injete 1-2 mL de anestesia local por via subcutânea e na fáscia. Após alguns minutos, faça uma incisão com um pequeno bisturi através da pele e da fáscia, aproximadamente a 1/3 da distância da patela à espinha ilíaca anterior superior. Extrair cerca de 100-150 mg de tecido muscular usando o conchotome.
  2. Congele amostras para histoquímica em isopentano arrefecido até seu ponto de congelamento em nitrogênio líquido e guarde-o a -80 ° C. Armazene uma amostra de 30-50 mg de tecido muscular.
  3. Gelar rapidamente as amostras para análise de proteínas em nitrogênio líquido e armazená-las a -80 ° C. Armazene uma amostra de 30-50 mg de tecido muscular.

6. OGTT

Nota: Execute o OGTT (teste oral de tolerância à glicose) no dia do teste 3 (veja a Introdução e a Figura 1 ). O tempo entre o exercício eo OGTT deve exceder 48 h e deve ser semelhante entre o pré e o post- testes. Um OGTT oral de 2 horas é usado para investigar se as amostras de sangue freqüentes durante esse tempo mostram níveis normais ou aumentados, indicando diabetes ou condições de prediabetes.

  1. Execute o teste OGTT pela manhã em indivíduos que jejem durante a noite e não fizeram nenhum exercício extenuante no dia do teste ou no dia anterior.
  2. Pegue amostras de sangue (4 mL) de participantes supino através de uma cânula venosa na veia antecubital 15 min antes e imediatamente antes da ingestão de glicose, seguida de 15, 30, 60, 90 e 120 min após a ingestão de glicose ( 75 g de glicose numa solução de 250 g / L).
  3. Centrifugar as amostras de sangue a 1.500 xg e 4 ° C por 10 min e armazenar o plasma a -20 ° C para futuras análises. Use as amostras para realizar testes padrão de nível de glicose (passo 7).
  4. Para a glicose, a insulina e o peptídeo c, calcule a área sob a curva (AUC), determinando a integral temporal da glicose acima dos níveis basais de glicose. Use os resultados do OGTTPara calcular a sensibilidade à insulina para todo o corpo usando o método Matsuda 21 , conforme a equação: 10 000 * √ [(Glucose basal * Insulin basal ) * ( Média de glicose * média de insulina).

7. Análise da amostra de sangue

  1. Quantifique a concentração de glicose no plasma venoso com um analisador automatizado. Defina o nível de tolerância à glicose prejudicada em valores de glicose no sangue> 7,8 mmol / L após um OGTT de 2 h 22 .
  2. Use kits ELISA 22 para realizar análises plasmáticas de insulina e peptídeo c. Use um leitor de placas. Coloque as placas ELISA tanto para insulina quanto para peptídeo c em um leitor de placas (cada uma em uma ocasião separada).
    NOTA: O leitor de placas mede a quantidade de insulina e a quantidade de péptido c medindo as amostras na placa em determinadas absorvências. Os lipídios de sangue TG, HDL, apolipoproteína A1 e apolipoproteína B foram analisados ​​com métodos padrão emO Hospital Universitário Karolinska, Estocolmo, Suécia.

8. Análise de amostras musculares

  1. Imunotransferência
    1. Primeiro, lave a amostra muscular em um liofilizador a uma pressão abaixo de 10-1 mbar por 12 h. Dissecê-lo para que ele esteja livre de sangue e tecido conjuntivo usando uma agulha e fórceps sob um microscópio de luz. Armazene-o a -80 ° C.
      NOTA: Uma quantidade adequada de músculo é entre 1 e 5 mg de peso seco, mas o protocolo pode ser ajustado para menos de 1 mg, até fibras únicas. Devido à baixa quantidade de tecido muscular presente em uma biópsia, os valores desse participante de RET não foram utilizados para a imunotransferência.
    2. Homogeneizar as amostras musculares Com um batedor de mini bead em tampão gelado (80 μL / mg) composto por ácido 2 (2-hidroxietil) -1-piperazino-etanossulfónico 2 mM (HEPES), ácido etilenodiaminotetracético 1 mM (EDTA), etilenoglicol-bis 5 mM (Éter β-aminoetil) -N, N, N ', N'-tetraacetiloÁcido (EGTA), MgCl2 10 mM, ß-glicerofosfato 50 mM, TritonX-100 a 1%, Na3OT4 1 mM, ditiotreitol 2 mM, leupeptina 20 μg / mL, aprotinina a 50 μg / 1, inibidor de fosfatase Cocktail e 40 μg / μL de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonilo).
      1. Coloque uma bola de pérolas de óxido de zircônio de 0,5 mm em cada tubo com o músculo. Adicione buffer e homogeneize por 2 x 1 min no passo de velocidade 7-8 (aqui, o máximo é 10) e 4 ° C.
    3. Centrifugar o homogeneizado durante 10 min a 10 000 x g. Transfira o sobrenadante remanescente para novos tubos e descarte o grânulo contendo as proteínas estruturais.
    4. Determinar espectrofotométricamente a concentração de proteína no sobrenadante com um kit comercialmente disponível usando um leitor de placas a 660 nm 23 .
      1. Posteriormente, diluir as amostras com tampão de amostra 2x Laemmli e tampão de homogeneização (1: 1) até uma concentração final de proteína de 1,5 μg /# 181; L. Aquecer até 95 ° C durante 5 minutos para desnaturar as proteínas. Armazene as amostras diluídas a -20 ° C antes da análise.
    5. Para a eletroforese em gel de poliacrilamida nativa (PAGE), coloque 30 μg de proteína de cada amostra em géis de gradiente pré-moldados de 18 poços (acrilamida a 4-20%) e realize eletroforese a 300 V durante 30 minutos em gelo.
    6. Equilibre o gel em tampão de transferência (base de Tris 25 mM, glicina 192 mM e 10% de metanol) durante 30 min a 4 ° C. Transferir proteínas para membranas de fluoreto de polivinilideno com tamanhos de poro de 0,2 μm a uma corrente constante de 300 mA durante 3 h a 4 ° C.
    7. Para confirmar o mesmo carregamento e transferência, mancha as membranas com uma mancha de proteína total 24 . Para cada proteína alvo, coloque todas as amostras de cada matéria no mesmo gel e execute todos os géis ao mesmo tempo.
    8. Bloquear a membrana durante 1 h a temperatura ambiente em solução salina tamponada com Tris (Tris-base 20 mM, NaCl 192 mM, TBS, pH 7,6) contendo5% de leite não gordo.
    9. Incube as membranas durante a noite com anticorpos primários (veja a Lista de Materiais) diluída em TBS contendo 2,5% de leite não gordo e suplementada com 0,1% de Tween-20 (TBS-TM).
    10. Após a incubação do anticorpo primário, lavar as membranas (2 x 1 min mais 3 x 5 min) com TBS-TM e incubar com anticorpos secundários (ver Lista de Materiais) conjugados com peroxidase de rábano durante 1 h à temperatura ambiente. Lavar novamente com TBS-TM (2 x 1 min e 3 x 10 min) e novamente sujeitá-los a quatro lavagens adicionais de 5 min com TBS.
    11. Aplique 6-12 mL de substrato quimioluminescente na membrana por 5 min. Coloque a membrana entre duas folhas de plástico transparentes. Coloque as membranas na frente de uma câmera CCD bloqueando a luz externa. Faça exposições em série usando um filtro de câmera quimioluminescente.
      1. Use o programa de software para adquirir 10 exposições por 2 min, ou até que os sinais estejam saturados. Use uma configuração padrão, tanto para as configurações do filtro óptico tO adquirir quimioluminiscência, bem como para as configurações da lente.
    12. Use a exposição mais alta que não leve à saturação e marque os contornos da banda. Quantifique as bandas como a intensidade x mm 2 usando o mesmo software. Subtrair o ruído de fundo da intensidade da banda. Apresentar os resultados relativos à mancha de proteína total e expressá-la como a variação percentual, em comparação com a linha de base.
  2. Histoquímica
    NOTA: A técnica de histoquímica abaixo é baseada em métodos descritos em uma publicação anterior 25 .
    1. Para a histoquímica, corte as secções transversais em série (10 μm) a -20 ° C usando um criostato. Montar as secções transversais em lâminas de vidro armazenadas em uma cubeta de vidro e secar ao ar as fatias de biópsia à temperatura ambiente.
    2. Prepare soluções tampão para cada nível de pH para pré-incubação a pH 4,3, 4,6 e 10,3 para coloração com ATPase 26 . Para visualizar capilares, staNas secções transversais usando o método amilase-PAS 27 .
    3. Calibre um medidor de pH despejando as soluções de calibração em copos de calibração rotulados. Pressione o botão apropriado para selecionar o pH no menu principal.
      1. Enxague a sonda com água desionizada e coloque a sonda no primeiro copo de calibração. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na membrana. Mude a primeira solução de calibração e, em seguida, apresente a próxima solução de calibração (a tela solicitará a próxima solução).
      2. Enxaguar a sonda com água desionizada e colocá-la no segundo copo de calibração. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na membrana. Mude uma segunda solução de calibração e vá para a próxima solução de calibração.
      3. Enxaguar a sonda com água desionizada e colocá-la em um terceiro copo de calibração. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na membrana. Medir a terceira solução de calibração.
        NOTA: quando a calibração éBom, a exibição mostrará brevemente, " 3º Buffer OK" e retornará ao menu principal.
    4. Use os buffers da seguinte forma para coloração com ATPase.
      1. Para preparar uma solução a pH 10,3, use duas soluções diferentes: (A) 4,506 g de glicina, 4,8 g de CaCl2, 3,51 g de NaCl e 600 mL de dH2O e (B) 2,176 g de NaOH e 540 mL De dH 2 O. Armazene as soluções em uma sala fria ou uma geladeira. Use-os no prazo de um mês.
      2. Para preparar soluções a pH 4,3 e 4,6, realize "pré-incubação ácida". Preparar o ácido para a pré-incubação utilizando: 6,47 g de acetato de Na, 3,7 g de KCl e 500 mL de dH2O. Em seguida, preparar uma solução de CaCl2 a 1% dissolvendo 2,5 g da mesma em 250 mL de dH2O. Prepare 2 % De solução de CoCl2 dissolvendo 5 g da mesma em 250 mL de dH2O.
      3. Armazene e use essas soluções como mencionado acima. Finalmente, prepare sulfato de amônio a 0,2%Misturando 800 μL de 20% (NH4) 2S em 40 mL de dH2O. Preparar o último recém-nascido.
    5. Prepare soluções em certos valores de pH da seguinte forma. Após a calibração do medidor de pH, retire as cubetas e os cloretos de cálcio e cobalto da geladeira e deixe-os aquecer até a temperatura ambiente antes da coloração.
      1. Para pH 10,3 , adicione cerca de 25 mL de solução A a um copo de vidro pequeno (aproximadamente 70 mL). Meça o pH. Continue adicionando a solução B até atingir o pH desejado de 10,37. Se a coloração estiver muito escura, aumente o pH. Se for muito brilhante, reduza o pH.
      2. Para pH 4,6 , adicione cerca de 25 ml de "pré-incubação ácida" a um copo de vidro pequeno. Meça o pH. Reduza o pH usando ácido acético 5 M. Se a imagem da mancha estiver muito escura, tente aliviar o pH aumentado. Se é muito brilhante, escurece com um pH diminuído. Se a coloração não ajuda, tente outro pH: 4,8 inst.Ead de 4.6.
      3. Para pH 4,3 , faça o mesmo que para 4,6, mas adicione mais ácido acético. Diminua o pH se a mancha for muito brilhante e aumente o pH se estiver muito escuro para as fibras serem especificadas.
      4. Prepare a solução ATP da seguinte maneira. Pesar 0,017 g de ATP por cuvete (10 mL), de modo 0,051 g por 3 cubetas ou 0,068 g para 4 cubetas. Pegue 30 mL (para 3 cuvetes, 10 mL / cuvete) de solução a pH 10.3 (use uma garrafa de cilindro) e coloque-a em um copo de vidro com ATP pesado.
        1. Misture bem e mestre o pH. Reduza o pH usando HC1 concentrado até o pH atingir exatamente 9,40.
      5. Para incubação em vários valores de pH, faça o seguinte. Coloque a solução 10.3 em uma cubeta e incuba-a em banho-maria a 37 ° C durante 9 min. Coloque a solução 4.3 em outra cuvete e incuba-a à temperatura ambiente durante 5 min. Coloque a solução 4.6 na última cuvete e incube à TA por 1 min.
      6. Seguindo o pH preferidoProcedimento de incubação, aplique o conteúdo de cada cuvete como segue. Lavar 15 vezes com dH 2 O. Adicionar a solução de ATP (0,170 g de ATP / 100 mL de H 2 O) à amostra de biópsia. Incubar em banho-maria a 37 ° C durante 30 min. Lavar 15 vezes com dH2O.
      7. Adicionar solução de CaCl2 (1 g de CaCl2 / 100 mL de H 2 O) à amostra de biópsia nas cubetas. Incubar à RT por 3 min. Lavar 15 vezes com dH2O. Adicionar solução de CoCl2 (2 g de CoCl2 / 100 mL de H 2 O) à amostra de biópsia nas cubetas. Incubar à RT por 3 min. Lavar 15 vezes com dH2O.
      8. Coloque-o em solução (NH 4 ) 2 S por 30 s e lave rapidamente 15 vezes sob a exaustão. Colar as fatias de biópsia no vidro deslizante. Para evitar bolhas, aperte as biópsias, mas não muito difícil.
    6. Selecione uma região da seção transversal sem artefatos ou cortes longitudinais da fibra. Analisar sob um liMicroscópio GHT usando software.
    7. Avalie a área de seção transversal (CSA), os capilares e a classificação do tipo de fibra ( ie, tipo I, IIA ou IIX) por meio de análise de imagem por computador, de uma média de pelo menos 150-200 fibras por biópsia. A partir de uma imagem de microscópio de fibras musculares nas secções transversais, certifique-se de que os três tipos de fibras musculares ( ie, tipo I, IIA e IIX) têm vários tons de branco a cinza a preto, dependendo da coloração do pH ( isto é, 4.34, 4.65 e 10.37).
    8. Comece marcando algumas fibras de tipo I. Posteriormente, o programa registrará automaticamente as outras fibras de tipo I. Verifique se todas as fibras de tipo I estão marcadas corretamente. Para marcar uma determinada fibra, clique no botão "Vector". Use o cursor para medir a área para cada fibra muscular selecionada individualmente.
    9. Após a análise de fibras de tipo I, continue o mesmo procedimento para tipo IIA e tipo IIX. A média ± SEM para cada tipo de fibra muscular ( ie, tipo I, IIA e IIX) devem ser calculados em relação à quantidade de fibra e ao CSA para os grupos RET e CON.
      Nota: A área de seção transversal (CSA), capilares e classificação do tipo de fibra ( ie, tipo I, IIA e IIx) foram avaliadas a partir de uma média de 163 ± 9 fibras por biópsia.

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Resultados

Material

No estudo, 21 mulheres e homens relativamente saudáveis, de 65 a 80 anos de idade e com valores de IMC entre 20 e 30 kg · m -2 participaram e foram randomizados em dois grupos. Os indivíduos em ambos os grupos tiveram níveis de atividade física relativamente baixos ( ou seja, um nível de atividade física diário moderado e nenhum treinamento de exercícios regulares). Um grupo (n = 12, 6 mulheres e 6 ho...

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Discussão

Neste estudo, foram utilizadas várias técnicas para investigar os efeitos do treinamento de resistência progressiva a curto prazo sobre a função / morfologia muscular dos indivíduos idosos, a capacidade aeróbia e a tolerância à glicose. A principal descoberta foi que, em comparação com um grupo de controle, muitas melhorias ocorreram na capacidade aeróbica muscular, tolerância à glicose, força, poder e qualidade muscular ( ie, proteína envolvida na sinalização celular e composição da fibra muscular). Um aumento...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Andrée Nienkerk, Dennis Peyron e Sebastian Skjöld por supervisionar as sessões de treinamento e vários testes; Para os participantes; Para Tim Crosfield para revisão de idioma; E ao apoio econômico da Escola Sueca de Ciências do Desporto e da Saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Western blot
Pierce 660 nm Kit de Ensaio de ProteínaThermo Scientific, Rockford, IL, EUA22662
SuperSignal West Femto Substrato de Sensibilidade Máxima Thermo Scientific34096
Inibidor de Protease Halt Cocktail (100x)Thermo Scientific78429
Restore PLUS Western Blot Stripping BufferPierce da Thermo Scientific46430
para Membranas PVDFThermo Scientific24585
10 st - 4– 20% Criterion TGX Gel, 18 poços, 30 µ LBio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EUA567-1094
Membrana PVDF Immun-Blot Bio-Rad162-0177
Precision Plus Protein Padrões de Duas Cores Bio-Rad161-0374
2x Tampão de Amostra LaemmliBio-Rad161-0737
10x Tris/GlicinaBio-Rad161-0771
2-MercaptoetanolBio-Rad161-0710
Tween 20Bio-RadP1379-250ML
Análise de banda com Quantidade Um versão 4.6.3.softwareBio-Rad
Inibidor de fosfatase a 1% coctailSigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA
forte>Anticorpos
mTOR (1:1.000)Sinalização Celular, Danvers, Massachusetts, EUA2983
Akt (1:1.000)Sinalização Celular, Danvers9272
Secundário anti-coelho e anti-camundongo ligado a HRP (1:10.000)Sinalização celular, Danvers
Citrato sintase (CS) (1:1.000)Gene tex, San Antonio, Califórnia, EUA
OXPHOS (1:1.000)Abcam, Cambridge, Reino Unido
strong>Equipamento - Análise de amostras musculares
Bullet Blender 1.5 para homogeneizaçãoNext Advance, Nova York, EUA
Leitor de placasTecan infinite F200 pro, Mä nnedorf, Suíça
Histochemistry
Mayer hematoxilinaHistoLab, Vä stra Frö lunda, Suécia 1820
Óleo Vermelho oSigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA00625-25y
NaClSigma-Aldrich793566-2,5 kg
Cloreto de cobaltoSigma-Aldrich60818-50G
AmilaseSigma-AldrichA6255-25MG
ATPSigma-AldrichA2383-5G
GlicinaVWR-produtos químicos / VWR-internacional, Spå nga, Suécia101196X
Cloreto de cálcioVWR-químicos / VWR-international22328.262
IsopentanoVWR-químicos / VWR-international24872.298
Etanol 96%VWR-chemicals / VWR-international20905.296
NaOHMERCK, Estocolmo, Suécia1.06498.1000
Acetato de NaMERCK1.06268.1000
KClMERCK1.04936.1000
Sulfeto de amônioMERCKU1507042828
Ácido acético 100%MERCK1.00063.2511
Schiffs´ ReagenteMERCK1.09033.0500
Ácido periódicoMERCK1.00524.0025
ClorofórmioMERCK1.02445.1000
medidor de pH LANGEHACH LANGE GMBH, Dusseldorf, Alemanha
Microscópio ópticoOlympus BH-2, Olympus, Tóquio, Japão
Criostato  Leica CM1950Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha
Software Leica Leica Qwin V3Leica Microsystems
Gel Doc 2000 - Bio-Rad, configuração da câmeraBio-Rad Laboratories AB, Solna, Suécia 
Programa de software Quantift One - 4.6 (versão 4.6.3; Bio Rad)Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Suécia 
Teste oral de tolerância à glicose, OGTT
Glukos APL 75 gAPL, Estocolmo, Suécia323.188
Analisador automatizado Biosen 5140EKF Diagnostics, Barleben, Alemanha
Insulina e peptídeo C no kit de plasma ELISAMercodia AB, Uppsala, Suécia,10-1132-01, 10-1134-01
Placa leitorTecan infinite F200 pro, Mä nnedorf, Suíça
Equipamento adicional
Medidas de massa livre de gorduraFFM-Tanita T5896, Tanita, Tóquio, Japão
Equipamento de treinamento de força para todos os exercícios de treinamentoCybex International Inc., Medway, Massachusetts, EUA 
Cicloergômetro Monark Ergometer 893E, Monark Exercises, Varberg, Suécia 
Monitor de frequência cardíaca RS800, PolarPolar Electro OY, Kampele, Finlândia
Oxycin-Pro - dispositivo ergoespirométrico automáticoErich Jaeger GmbH, Hoechberg, Alemanha
Dinamômetro isocinético, Isomed 2000, força muscular do joelhoD& R Ferstl GmbH, Henau, Alemanha
Sistema de aquisição de dados CED 1401 e software SignalCambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido
Software para análise de força muscular, Spike 2, versão 7Signal Hound, LA Center, WA, EUA
Software Statistica para análises estatísticasStatistica, Stat soft. inc, Tulsa, Oklahoma, EUA
Equipamento de biópsia muscular
Weil Blakesley conchotomeWisex, Mö lndal, Suécia
Anestesia local Carbocaína, 20 mL, 20 mg/mL; Astra Zeneca, Sö dertä lje, Suécia169,367
Lâmina Cirúrgicade Segurança de Penas CO, LTD, Osaka, Japão 
Kit de Mancha de Proteína Reversível <<11048030

Referências

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