Artigo de método

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55519

⸱

14 de abril de 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Nós descrevemos um protocolo para dissecação, fixação e imunocoloração de órgãos esteroidogênicas em Drosophila larvas e adultos do sexo feminino para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. Em adição aos órgãos esteroidogênicas, podemos visualizar a inervação dos órgãos esteroidogênicas, bem como células alvo esteroidogênicas, tais como células estaminais da linha germinal.

Resumo

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Em organismos multicelulares, um pequeno grupo de células é dotado com uma função especializada na sua actividade biogénico, induzir uma resposta sistémica para o crescimento e reprodução. Em insetos, a glândula larval prothoracic (PG) e as fêmeas adultas de reprodução ovário papéis essenciais no biosynthesizing os principais hormônios esteróides chamados ecdisteroides. Estes órgãos ecdysteroidogenic são inervados do sistema nervoso, através do qual o momento da biossíntese é afetado por estímulos ambientais. Aqui nós descrevemos um protocolo para a visualização de órgãos ecdysteroidogenic e seus órgãos interativos em larvas e adultos de mosca da fruta Drosophila melanogaster, que fornece um sistema modelo adequado para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. dissecção Hábil nos permite manter as posições dos órgãos ecdysteroidogenic e seus órgãos interativas, incluindo o cérebro, a medula nervosa ventral, e outros tecidos. Imunomarcação com umntibodies contra enzimas ecdysteroidogenic, juntamente com proteínas de fluorescência transgénicos accionados por promotores específicos de tecido, estão disponíveis para marcar células ecdysteroidogenic. Além disso, os inervação dos órgãos ecdysteroidogenic podem também ser marcados por anticorpos específicos ou um conjunto de controladores de GAL4 em vários tipos de neurónios. Portanto, os órgãos ecdysteroidogenic e as suas ligações neuronais possa ser visualizado simultaneamente por imunocoloração e técnicas transgénicas. Finalmente, descrevemos como visualizar as células-tronco germinativas, cuja proliferação e manutenção são controlados por ecdisteroides. Este método contribui para a compreensão abrangente da biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação neuronal.

Introdução

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Em organismos multicelulares, um grupo de células é dotado com uma função especializada na sua actividade biogénico que é essencial para o corpo inteiro. Para desempenhar a sua missão, cada tecido ou órgão expressa uma série de genes relacionados com as suas funções e comunica com outros tecidos para orquestrar a sua actividade no âmbito do desenvolvimento. Para caracterizar tais funções celulares especializadas e interacções inter-órgãos, é preciso especificar um grupo de células, juntamente com outros tipos de células a ser mantida intacta na arquitectura multicelular.

Um exemplo de tais órgãos especializados é um órgão esteroidogénica,....

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Protocolo

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NOTA: O esquema geral de protocolos é mostrado na Figura 1.

1. A dissecção do Anel Glândula larval (RG)

NOTA: Em D. melanogaster, que pertence ao Diptera cyclorrhaphous, por o PG estar dentro de um órgão endócrino composto chamado a glândula anel (RG, Figura 2D). Uma vez que é inviável que o PG é cirurgicamente separado a partir de outros tipos de células (discutido mais tarde), um alvo é prático para isolar, um de RG não danificado intacta por dissecção.

  1. Preparação de larvas nos estádios de desenvolvimento apropri....

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Resultados

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Foram utilizados os protocolos acima para visualizar os órgãos esteroidogênicas e seus órgãos interativos em D. melanogaster larvas e adultos do sexo feminino. O esquema geral de protocolos é mostrado na Figura 1.

O RG, incluindo a PG (Figura 2D), é menor e mais transparente do que o cérebro e situa-se no lado dorsal anterior do cérebro (Figura 2A-C e 3A-E). Para marcar as células PG, vários grupos têm gerado vários tipos de anticorpos contra enzimas ecdyst.......

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Discussão

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Foram estudados biossíntese ecdiesteróide e o seu mecanismo de regulação em D. melanogaster, e concebido um protocolo para a dissecção e imunocoloração. A temporização da biossíntese de ecdiesteróide é afectada por sinais ambientais através das entradas 33 neuronais, por isso, é essencial para a manutenção da inervação dos órgãos ecdysteroidogenic juntamente com o cérebro, VNC, e outros tecidos durante a dissecção.

Como descrito acima, o de D. melanogaste.......

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Divulgações

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Nenhum conflito de interesses declarado.

Agradecimentos

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Agradecemos Reiko Kise e Tomotsune Ameku por seu apoio técnico para este trabalho. Também somos gratos a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, o Bloomington Drosophila da Center, Kyoto Stock Center (DGRC), e os estudos de desenvolvimento Hibridoma Bank for stocks e reagentes. Este trabalho foi apoiado por subsídios para YSN de JSPS KAKENHI Grant Número 16K20945, a Fundação Naito, e Inoue Research Award Ciência; e por uma doação para RN de MEXT KAKENHI Grant Número 16H04792.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
coleção de ovosplaca de cultura de
tecidos (55 mm)AS ONE1-8549-02  para placas de ágar suco de uva
copo de coletaHIKARI KAGAKU
pastalevedura Levedura seca oriental, Tóquio
100% suco de uvaWelch Food Inc.
criação forte
pequenos (12ml, 40× 23,5 mm, PS)SARSTEDT58.487
alça descartávelAS ONE6-488-01
alimentomoscas  o recepi nos no site do centro de estoque de Blooington.
dissecçãomicroscópio de
dissecaçãoCarl ZeissStemi 2000-C
LeicaS8 AP0
(35 x 10 mm, não tratada)IWAKI1000-035
SylgardTORAYcoarting silicone dentro de placas
Agulha Terumo (27G, 0,40 x 19 mm) TERUMONN-2719SUma "faca" para cortar a pinça de tecido
, Inox, #Dumont, Suíça
pino de inseto (0,18 mm de diâmetro)Marcadissecação de filetes
NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
fixação
água ultrapuraMerck Millipore
fosfato tamponado solução salina (PBS)
FormaldeídoNacalai tesque16222-65
ParaformaldeídoNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
microtubos (1,5 ml)INA OPTIKACF-0150
< forte > incubação < / forte >
como um misturador de swist TM-300 (balancim)Como umbalancimTM-300
albumina de soro bovinoSIGMA9048-46-8
< forte > anticorpo primário < / forte>
anti-Sro (cobaia), 1:1000
anti-GFP (coelho), 1:1000Sondas MolecularesA6455Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (camundongo mAb, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (coelho), 1:500SIGMAS5545
anti-Hts 1B1 (camundongo)Banco de Hibridoma de Estudos de Desenvolvimento (DSHB)1B1
anti-DE-caderina (rato), 1:20DSHBDCAD2
anti-nc82 (camundongo), 1:50DSHBnc82
anticorpo secundário
Cabra anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-11008
Anticorpo secundário anti-camundongo IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-11001
Anticorpo secundário anti-rato IgG (H + L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 546Life TechnologiesA-11081
Anticorpo secundário IgG (H + L) de cobaia de cabra, conjugado Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 faloidina conjugada com coranteLife TecnologiasA-22283
Reagentes de montagem
Micro slide glassMatsunami Glass Ind.,Ltd.SS7213
Vidro quadradoMatsunami Glass Ind., Ltd.
Reagente FluorSave (Reagente de montagem)Calbiochem345789
Pipeta de transferência 1 ml (conta-gotas descartável)WATSON5660-222-1S
imaging
LSM700 sistema de microscópio de varredura a laserCarl Zeissinvertido Axio Observer. Z1 SP left
processamento de imagem
LSM700 ZENCarl ZeissÉ uma interface de usuário especial baseada no sistema operacional Microsoft Windows7 de 64 bits
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  do Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS– GFP; UAS– mCD8::GFPpresentes de K. Ito, Universidade de Tóquio.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4ver em Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP  do Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  do Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)
de padrão para Placa de cultura de tecidos 5 Shiga para micro tesoura de C218181

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....

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Etiquetas

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