CAPRRESI: montagem de quimera por recuperação de plasmídeos e restrição de inserção do site enzimático

Resumo

Aqui, apresentamos a montagem de quimera por recuperação de plasmídeo e inserção de site de enzima de restrição (CAPRRESI), um protocolo baseado na inserção de sites de enzimas de restrição em seqüências de DNA sinônimo e recuperação de plasmídeo funcional. Este protocolo é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.

Resumo

Aqui, apresentamos a montagem da quimera por recuperação do plasmídeo e inserção do sistema enzimático de restrição (CAPRRESI). CAPRRESI beneficia de muitos pontos fortes do método original de recuperação de plasmídeos e introduz a digestão de enzimas de restrição para facilitar as reações de ligação de DNA (necessárias para a montagem da quimera). Para este protocolo, os usuários clonam os genes do tipo selvagem no mesmo plasmídeo (pUC18 ou pUC19). Após a seleção in silico de regiões de sequências de aminoácidos onde as quimeras devem ser montadas, os usuários obtêm todas as seqüências de DNA sinônimo que as codificam. Os scripts perl ad hoc permitem aos usuários determinar todas as seqüências de DNA sinônimo. Após este passo, outro script Perl procura sites de enzimas de restrição em todas as seqüências de DNA sinônimo. Esta análise in silico também é realizada utilizando o gene de resistência à ampicilina ( ampR ) encontrado em plasmídeos pUC18 / 19. Os usuários projetam oligonucleótidos dentro de regiões sinônimas para interromper genes de tipo selvagem e ampR por PCR. Depois do obtAinando e purificando fragmentos de DNA complementares, a digestão com enzimas de restrição é realizada. A montagem da quimera é conseguida ligando fragmentos de DNA complementares apropriados. Os vetores pUC18 / 19 são selecionados para CAPRRESI porque oferecem vantagens técnicas, como tamanho reduzido (2.686 pares de bases), alto número de cópias, características vantajosas de reação de sequenciação e disponibilidade comercial. O uso de enzimas de restrição para o conjunto de quimeras elimina a necessidade de polimerases de DNA que produzem produtos de extremidade contundente. CAPRRESI é um método rápido e de baixo custo para a fusão de genes que codificam proteínas.

Introdução

A montagem de genes quiméricos tem sido amplamente utilizada na biologia molecular para elucidar a função protéica e / ou para fins biotecnológicos. Existem diferentes métodos para a fusão de genes, tais como a ampliação de produto de PCR em sobreposição ¹ , a recuperação de plasmídeo ² , a recombinação homóloga ³ , os sistemas ^{4 de} CRISPR-Cas9, a recombinação ⁵ dirigida ao local e a montagem ^{6 de} Gibson. Cada um destes oferece vantagens técnicas diferentes; Por exemplo, a flexibilidade do design de PCR sobreposto, a seleção ....

Protocolo

1. Protocolo CAPRRESI

NOTA: A Figura 1 representa o protocolo CAPRRESI geral. Esta técnica é baseada em um projeto in silico e a construção subsequente das quimeras desejadas.

1. Seleção do plasmídeo de clonagem, pUC18 ou pUC19.
   1. Selecione o vetor pUC que melhor se adequa às demandas técnicas.
      NOTA: Ambos os vetores têm a mesma seqüência, exceto para a orientação do site de clonagem múltipla. Isto é importante para o desenho de oligonucleótidos e a ruptura do plasmídeo PCR.
2. Análise in silico dos genes do tipo selvagem e sequências pUC18 ....

Resultados

A Figura 1 mostra CAPRRESI. Usando este método, dois genes quiméricos foram montados trocando os domínios de dois fatores sigma primários bacterianos ( isto é, E. coli RpoD e R. etli SigA). As seqüências de DNA dos genes rpoD e sigA foram obtidas usando o Artemis Genome Browser ¹⁴ dos arquivos Genoma GenBank NC_000913 e NC_007761, respectivamente. A sequência de DNA do vetor pUC18 foi obtida a partir do banco de.......

Discussão

CAPRRESI foi projetado como uma alternativa ao PRM ² . O PRM original é uma técnica poderosa; Ele permite a fusão de seqüências de DNA ao longo de qualquer parte dos genes selecionados. Para PRM, os genes de tipo selvagem devem ser clonados no mesmo plasmídeo. Depois disso, os oligonucleótidos são projetados dentro de genes de resistência de tipos selvagens e antibióticos encontrados no plasmídeo. A interrupção do plasmídeo é conseguida através de PCR utilizando polimerases de DNA de extrema extr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Polimerase de DNA Taq de platina Alta fidelidade	Thermo Fisher	11304011	Produz uma mistura de produtos de PCR com extremidade em saliência romba / 3'-A
Kit de isolamento de plasmídeo de alta pureza	Roche	11754785001	Usado para todas as reações de purificação de plasmídeo
Kit de purificação de produto de PCR de alta pureza	Roche	11732676001	Usado para todas as reações de purificação de PCR de géis
de agaroseEnzima de restrição AflII	New England Biolabs	R0520L	Reconhece a sequência 5'-CTTAAG-3' e corta a 37 &graus; C
KpnI-HF enzima de restrição	New England Biolabs	R3142L	Reconhece a sequência 5'-GGTACC-3' e corta a 37 &graus; C
SpeI-HF enzima de restrição	New England Biolabs	R3133L	Reconhece a sequência 5'-ACTAGT-3' e corta a 37 &graus; C
XbaI enzima de restrição	New England Biolabs	R0145L	Reconhece a sequência 5'-TCTAGA-3' e corta a 37 &graus; C
Ampicilina de sódio sal	Sigma Aldrich	A0166-5G	Antibióticos
Ácido nalidíxico	Sigma Aldrich	N8878-5G	Antibióticos
Extrato de levedura	Sigma Aldrich	Y1625-1KG	Cultura de células bacterianas
Peptona de caseína	Sigma Aldrich	70171-500G	Cultura de células bacterianas
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG	cloreto de sódio
Agar	Sigma Aldrich	05040-1KG	Cultura de células bacterianas
XbaI enzima	de restrição Thermo Fisher	FD0684	Enzima de XbaI enzima
KpnI	Thermo Fisher	FD0524	KpnI enzyme
	New England Biolabs	M2200S	Kit de ligação rápida de DNA
AflII enzima de restrição	Thermo Fisher	FD0834	AflII de digestão rápida enzyme
SpeI enzima de restrição	Thermo Fisher	FD1253	SpeI enzyme

Kit de ligação rápida