Um Método celular agregação eficiente e flexível para 3D Spheroid Produção

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo rápido e flexível para a formação de esferoides de células 3D por meio da agregação celular. Isso é facilmente adaptado a vários tipos de células e é adequado para uso em uma variedade de aplicações, incluindo ensaios de migração celular, invasão ou anoikis, e para imagens e quantificação de interações célula-matriz.

Abstract

Cultura de células em monocamada não modelar adequadamente o comportamento in vivo de tecidos, que envolve complexas interacções célula-célula e célula-matriz. Tridimensionais técnicas de cultura de células (3D) são uma inovação recente desenvolvido para resolver as deficiências da cultura de células aderentes. Embora várias técnicas para a produção de análogos de tecidos in vitro, têm sido desenvolvidos, estes métodos são muitas vezes complexos, caros para estabelecer, requer equipamento especializado, e são geralmente limitados pela compatibilidade com apenas certos tipos de células. Aqui, nós descrevemos um protocolo rápido e flexível para a agregação de células em esferóides multicelulares 3D de tamanho consistente, que é compatível com o crescimento de uma variedade de linhas celulares tumorais e normais. Nós utilizamos concentrações variáveis ​​de soro e metil celulose (MC) para promover a geração de esferóide independente de ancoragem e prevenir a formação de monocamadas de células de um modo altamente reprodutível. As condições óptimas para indivlinhas celulares idual pode ser conseguido ajustando MC ou concentrações de soro no meio de formação de esferóides. Os esferóides 3D gerados pode ser recolhido para uso em uma grande variedade de aplicações, incluindo a sinalização celular ou estudos de expressão de genes, o rastreio de fármacos candidato, ou no estudo de processos celulares, tais como invasão celular tumoral e a migração. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides clonais de células isoladas, e podem ser adaptados para avaliar o crescimento independente de ancoragem e anoikis-resistência. Em geral, o nosso protocolo fornece um método facilmente modificável para a geração e utilização de esferóides de células 3D, a fim de recapitular o microambiente 3D de tecidos e modelar o crescimento in vivo de células normais e tumorais.

Introduction

Avaliação biologicamente relevante do comportamento das células tumorais é um desafio utilizando metodologias tradicionais de cultura de células de duas dimensões (2D), em parte porque estes não reflectem adequadamente o microambiente celular encontrado in vivo. Abordagens alternativas que incorporam os componentes da matriz extracelular em cultura (por exemplo, ensaios de câmara de Boyden) são representativos fisiologicamente mais do ambiente de tecido in vivo. No entanto, eles podem ser limitados a avaliação do comportamento de células individuais, e não recapitular o complexo in vivo em combinações de interacções célula-matriz e célula-célula que contribuem para o crescimento de tecido de tumor ou ^{1, 2, 3.}

O uso de esferóides multicelulares é uma abordagem recente que reproduz de forma mais precisa a arquitectura compacta de crescimento celular in vivo em ^1,4. Os esferóides podem ser utilizados para investigar interacções célula-matriz de células normais, mas também podem actuar como análogos de tumor para modelar as características de progressão tumoral, tais como o crescimento metastático ou resistência a drogas ^4.

Os esferóides podem ser formados pela proliferação de células individuais embebidas numa matriz de ^5, ou mais rapidamente, através da promoção da agregação de várias células de modo a formar um conjunto único de células (por exemplo, gota em suspensão, os métodos de centrifugação) ^{6, 7.} técnicas de agregação de células existentes pode exigir materiais caros ou equipamento especializado. Além disso, estes esferóides possuem uma vasta gama de tamanhos e morfologias e pode ser difícil de produzir em grandes quantidades, tornando a comparação entre condições de crescimento ou tratamentos difíceis. Finalmente, esferóides gerados por estes métodos podem ser difíceis de isolar a partir do extracel proteicolular matriz em que se encontram inseridas para utilização em outras aplicações.

Aqui, nós descrevemos um método de agregação celular robusta e facilmente controlável para a rápida formação de esferóides de células dimensionados de forma consistente utilizando placas disponíveis comercialmente de fundo em U de células-repelente e uma matriz de promoção de adesão inerte, celulose de metilo. Uma vez formados, estes esferóides multicelulares são prontamente isolados para utilização numa vasta gama de aplicações. O protocolo também é facilmente adaptada para gerar esferóides através da proliferação de células, o que pode ser utilizado para avaliar outros processos celulares. Aqui, mostramos ensaios de invasão celular, quantificados pela técnica de imunofluorescência, e um ensaio anoikis, como exemplos de aplicações destes dois protocolos de formação esferóide diferentes.

Protocol

Nota: Todos os reagentes e consumíveis estão listados na Lista de Materiais.

1. Produção Spheroid por agregação celular

1. Solução de metil-celulose: preparar 100 ml de 100 mg / ml de celulose de metilo.
   1. Calor 50 mL ultrapura _H2O a 80 ° C. Adicionar 10 g de pó de metil-celulose e agite até que as partículas são uniformemente dispersos.
   2. Levar o volume final com ultrapura frio _H2O e agita-se a 4 ° C, até a solução se tornar clara, cor de palha, e não contém os sólidos visíveis.
   3. Filtrar através de um filtro de 0,45 um para remover os sólidos não dissolvidos. solução preparada pode ser dividido em alíquotas e armazenado a 4 ° C durante até 12 meses.
      NOTA: Metil celulose serve como um não-citotóxico, agente inerte, suspende para aumentar a adesão célula-célula e desencorajar a formação de uma monocamada de células aderentes. A metilcelulose é solúvel em água e pode ser lavada a seguir sphergeração oid.
2. Meio de formação esferóide
   NOTA: Prepare meio de formação esferóide imediatamente antes da utilização. Não guarde.
   1. Diluir solução de metilcelulose a 1-5 mg / mL no meio de cultura apropriado.
   2. Filtrar através de um filtro de 0,22 uM para esterilizar e remover os sólidos não dissolvidos.
3. Salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)
   1. Diluir até 1x e passar através de um filtro de 0,45 um antes da utilização. solução preparada pode ser armazenada indefinidamente à temperatura ambiente.
4. A produção celular esferóide (Figura 1)
   NOTA: Prepare todos os reagentes com antecedência. É importante evitar a contaminação de soluções de pó, fibras ou outras partículas insolúveis. A presença destes contaminantes irá afectar de forma adversa a formação de esferóides. O meio de cultura e outras soluções deve ser passado através de um filtro de 0,45 um para remover estas partículas quando possível. Evitar o uso de pipetas filtrada de algodão durante a transferência de soluções como estas podem introduzir fibras adicionais.
   1. As monocamadas de células de cultura para 70% de confluência no meio de cultura apropriado suplementado com soro a 10%. meio de cultura Aspirar e lavar com 1x PBS para remover detritos. Adicionar 3 ml de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina) de tampão de dissociação para um prato de cultura de células de 10 cm, e incuba-se as células a 37 ° C e 5% de CO _2.
   2. Inspecione células sob microscópio em aumento de 10x para confirmar o desapego. Neutralizar tampão de dissociação com 7 ml de meio de cultura suplementado com soro.
   3. suspensão de células centrifugar a 500 xg durante 10 min para as células suavemente pelotas.
   4. Remover o sobrenadante. sedimento de células ressuspender em 1 médio formação esferóide mL utilizando uma pipeta P1000 com uma ponta de filtro.
      NOTA: A suspensão de células deve ser livre de grumos.
      1. Para triturar pellet celular, pressione a ponta da pipeta contra o fundo do tubo com uma ligeira inclinação, enquantopipetagem ao cisalhamento sedimento celular. Evitar trituração mais de 3 - 5 vezes como este pode danificar as células. Pipeta devagar e não expelir todo o conteúdo da ponta da pipeta para evitar a criação de bolhas.
   5. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e diluídas suspensão de células a 1 x 10 ⁴ células / ml.
      NOTA: O número de células pode ser otimizado para gerar esferóides de tamanhos variados. Tripano coloração com azul de células danificadas podem ser usadas para confirmar a viabilidade das células ressuspensas.
   6. suspensão de células para uma transferência estéril, pipeta multicanal reservatório livre de poeira e utilizar pontas de filtro para dispensar 100 uL em cada poço de uma placa de 96 poços-célula-repelente de fundo em U.
      1. Reservatório de lavagem com filtrada ultrapura _H2O para remover a poeira e fibras.
      2. Misture a suspensão de células periodicamente enquanto sementeira para evitar que as células se deposite no fundo do reservatório. Para evitar a criação de bolhas, use uma técnica de pipetagem inversa, enquanto a mistura e Dispensing.
   7. Transferência de placas para cultura de tecidos incubadora (37 ° C e 5% de CO ₂₎ e inspeccionar diária para a formação de esferóides. As células devem assentar no fundo de cada cavidade dentro de 6 h e, geralmente, agregar-se em um esferóide dentro de 24-48 h (Figura 2).
   8. Para confirmação da formação esferóide bem sucedido, use uma ponta de p10 e gentilmente pipeta médio sobre o esferóide, observando sob um microscópio no aumento de 10x. Corretamente esferóides formados vai soltar a partir da placa and roll, confirmando a sua estrutura 3D.
      NOTA: metil-celulose e as concentrações séricas deve ser determinada por titulação para cada linha de células para produzir a formação de um único esferóide por poço. Condições optimizadas desta forma para as linhas de células seleccionadas são apresentados na Tabela 1, e exemplos dos esferóides formado na Figura 2B. Os esferóides podem ser cultivadas por mais tempo do que o indicado, mas tornam-se maiores à medida que elas crescem progressivamente mais difícilpara lidar com sem fragmentação. Se as células formam uma monocamada, esferóides de satélite, ou não conseguem depositar-se no fundo do poço, a concentração de celulose de metilo e de soro podem necessitar de ser ajustado para a formação de esferóides óptimo (Figura 3B). Não utilizar esferóides contendo contaminantes, tais como fibras ou de pó (Figura 3A). esferóides pré-formados podem ser tratadas com os compostos de interesse, tais como factores de crescimento, as manchas de células vivas, ou inibidores para análise.

2. Ensaio de Invasão esferoidal (Figura 4)

1. colágeno neutralizado
   1. Arrefecer todos os líquidos a 4 ° C e manter em gelo quando se trabalha com colágeno para evitar a polimerização indesejada.
   2. Prepare frescos soluções de NaOH e fresco HCl 0,1 M 0,1 M e 0,01 M em ultrapura H ₂ O. Passe todas as soluções através de filtros de 0,22 um.
   3. Misture bovino tipo 1 do colágeno (3,1 mg estoque / mL), NaOH 0,01 M e 10x PBS (8: 1: 1 razão em volume) e se ajustar a pH 7,4 usando NaOH 0,1 M frio e HCl. A concentração final de colagénio é de 2,5 mg / mL.
   4. Prepare colagénio neutralizado suficiente para encher o vaso de imagem a uma profundidade de 2-3 mm. É necessário um mínimo de 100 uL para cada poço da corrediça câmara de cultura de tecidos de 8 poços listados na Lista de Materiais.
2. Incorporação esferóides em colágeno (Figura 4)
   1. Cubra o fundo de cada poço de uma corrediça câmara de cultura de tecidos de 8 poços com um mínimo de 50 ul de colagénio neutralizado.
      1. Use técnica de pipetagem inversa para evitar a criação de bolhas no colágeno. Utilize a ponta da pipeta para espalhar o colagénio uniformemente sobre a superfície do poço.
         NOTA: Esta camada de base de colágeno vai realizar esferóides em suspensão e é tipicamente 1-2 mm de espessura. A camada de base minimiza a formação de um menisco sobre a camada superior de colagénio. Se a camada base for demasiado fina, esferóides podem fazer contacto com o fundo da câmara e corrediçaformar uma monocamada de células.
   2. Colocar a lâmina de câmara, e um prato de 35 milímetros de cultura de tecidos preenchido com ultrapura _H2O, numa placa de 10 cm de cultura de tecidos. Incubar a 37 ° C até que o colagénio é polimerizada, tipicamente 1 h. Loja restantes neutralizado colágeno no gelo.
      NOTA: A 35 milímetros prato cheio de água irá fornecer umidade e evitar a secagem. O slide câmara deve permanecer nesta câmara de umidade ao longo do ensaio. A camada de base de colagénio pode ser deixado a polimerizar durante a noite. incubações mais longas tipicamente resultar num gel mais rígida.
   3. Usando uma ponta de filtro P1,000, recolher esferóides pré-formadas (passo 1.4.7) da placa de células-repelente de 96 poços de fundo em U em 1,5 mL tirar os tubos de topo. Pipeta lentamente e evitar repetidas ou pipetagem vigorosa para minimizar fluido de corte de esferóides. Várias esferóides podem ser reunidos num único tubo de transferência para uma cavidade de corrediça a câmara de cultura de tecidos de 8 poços.
   4. Centrifugar os esferóides recolhidos em um tablETOP microcentrífuga a 2.000 xg por 2-5 s e remover o sobrenadante com uma pipeta p200. Evite centrifugação por mais tempo do que o necessário, pois isso pode fazer com que os esferóides se quebre ou se aglutinarem.
      NOTA: Depois de pipetagem a maior parte do sobrenadante, o tubo pode ser invertido cuidadosamente sobre uma toalha de papel limpa para afastar o excesso de líquido. Não permita que esferóides para secar.
   5. Usando uma grande ponta bore p200, delicadamente ressuspender esferóides em 50 ul colágeno neutralizado. Faça isso para cada tubo de esferóides recolhidos antes de qualquer esferóides são transferidos para o slide de câmara. Manter esferóides que foram ressuspensas em colagénio neutralizado em gelo até estar pronto para a transferência para lâminas de câmara.
   6. Remover slides câmara da incubadora e pipeta com cuidado a mistura esferóide-colágeno no topo da camada de base de colágeno. Incubar a 37 ° C e 5% de CO ₂ até colagénio é polimerizada.
      1. Não dispensam o conteúdo total do pipeta para evitar a criação de bolhas. Dropwise pipetagem reduz as chances de perturbar a camada de base de colágeno.
   7. Adiciona-se lentamente um mínimo de 100 uL aquecida meio de cultura contendo quimioatractores desejados, inibidores, ou outros tratamentos para cada poço da câmara de corrediça. Os contendo esferóides camada de colágeno pode rasgar se o líquido é pipetado para ele com muita força. O meio de cultura pode ser lentamente dispensado para o lado de um poço para evitar a perturbação do colágeno.
   8. Incubar corrediça câmara a 37 ° C e 5% _{de CO2} para permitir a invasão celular. invasão celular para o colagénio circundante pode ser observada por imagiologia de campo claro ou de fluorescência e quantificada por uma variedade de métodos utilizando epifluorescência, microscopia confocal ou folha de luz.

3. Quantificação de Invasion: Brightfield Microscopia

1. Em intervalos de tempo definidos, esferóides imagem colágeno embutido no aumento de 10x utilizando um microscópio de campo claro (passo 2.2.8).
   NOTA: Paraexperimentos em células vivas, a longo prazo, um estágio do microscópio aquecida e CO ₂ câmara regulada pode ser usado para manter esferóides a 37 ° C e CO _2, enquanto imagens de 5%.
2. Quantificar invasividade utilizando o software ImageJ tal como para medir o número de células invasoras para o colagénio circundante e a distância média invadido em cada ponto de tempo.

4. Quantificação de Invasion: microscopia de fluorescência com mancha de células vivas

1. Seguindo o passo 2.2.8, suplementar o meio nas lâminas de câmaras com um corante fluorescente, tal como DAPI, calceína AM, ou outro composto de localização de células apropriado para a linha celular de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Para a quantificação da capacidade de invasão, coloração homogénea em todo o esferóide não é essencial. Para aplicações que requerem uma penetração mais profunda da mancha, incubações longas (> 3 h) podem ser necessárias.
2. Remover a mancha e substituir com 500 mL quente 1x PBS. DentroCubate a 37 ° C durante 10 min para remover o excesso de corante. Repetir um mínimo de duas vezes.
3. Usando um microscópio de fluorescência, através de secções ópticas adquirir os esferóides invasores.
   NOTA: A exposição prolongada à luz do laser deve ser minimizada durante a imagem repetitivo para limitar fototoxicidade e fotodegradação.
4. Usar o software ImageJ tal como para gerar um Z-projecção, que pode ser utilizada para quantificar a área total do esferóide, números de células invasoras, e as distâncias invadido no interior da matriz de colagénio.
5. Como um exemplo, para quantificar a invasão, ajustar o limiar de imagem para excluir fundo, destacando apenas o esferóide e invadir as células, e medir a sua área. A área do esferóide original pode ser subtraído a partir deste total para quantificar invasividade.

5. A quantificação da Invasão: Imunofluorescência

Nota: Todas as soluções e tampões devem ser passados ​​através de um filtro de 0,45 um antes da utilização para remove detritos, o que pode afetar negativamente a coloração.

1. Prepare tampão de lavagem PBS ^+. Prepare 1x PBS e adicionar _CaCl2 e _MgCl2 para uma concentração final de 0,1 mM. Não autoclave buffer depois de CaCl ₂ e MgCl ₂ são adicionados. Solução e pode ser armazenado à temperatura ambiente esterilizada por filtração.
2. Prepare tampão de fixação neutra de formalina tamponada (NBF). Adicionam-se 5 gotas de NaOH 1 M a 0,6 g de paraformaldeído. Traga a 20 mL com PBS ⁺ e incuba-se a 60 ° C até paraformaldeído é dissolvido (aproximadamente 1 h). Arrefecer até à temperatura ambiente e ajustar o pH para 7,4 com HCl 1M.
   NOTA: tampão de fixação NBF deve ser preparada imediatamente antes da utilização.
3. Prepare a albumina de soro bovino (BSA) a tampão de bloqueio. Dissolve-se BSA em PBS ⁺ 3% w / v. A solução pode ser esterilizada por filtração e armazenada a 4 ° C durante vários dias, mas é melhor preparado fresco. Não aqueça.
4. Preparar tampão de permeabilização. Dilui-se Triton X-100a 0,2% v / v em PBS ^+.
   NOTA: tampão permeabilização deve ser preparada imediatamente antes da utilização.
5. Opcionalmente, preparar MOWIOL meio de montagem. Combinar 2,4 g de MOWIOL, 6 g de glicerol, e 6 mL _de H ₂ O. ultrapura mistura durante 3 h, num rotor a temperatura ambiente. Adicionar 12 mL de 0,2 M de Tris-Cl (pH 8,5). Incubar, com mistura, a 50 ° C durante 10 min.
   1. Centrifugar a 5.000 xg durante 15 min para sedimentar o material insolúvel. Adicionar agente anti-branqueamento, tais como 2,5% de DABCO. Loja em 500 mL alíquotas a -20 ° C.
6. Coloração por imunofluorescência de esferóides (Figura 5)
   NOTA: Use uma pipeta para adicionar lentamente ou remover líquidos de slides câmara. Evitar o uso de um aspirador, pois isso pode perturbar a camada de colágeno.
   1. Prepare esferóides e incorporar em lâminas de câmara cheia de colágeno, conforme descrito nos pontos 1 e 2.
      NOTA: O colágeno autofluorescência podem ser minimizados utilizando camadas finas ou pequenos volumes de collagen.
   2. Remova o meio de cultura, tanto quanto possível de cada slide câmara.
   3. Resumidamente lavar camada de colágeno com 500 mL de tampão de lavagem PBS ⁺ para remover o meio residual.
   4. Adicionar 500 ul de PBS ⁺ tampão de lavagem fresco a cada poço e incubar a 37 ° C durante 5 minutos para lavar esferóides. Repita duas vezes.
   5. Substitua PBS ⁺ tampão de lavagem com 500 tampão de fixação mL NBF. Incubar à temperatura ambiente durante 20-25 min.
   6. Remover o tampão de fixação NBF e lavar com 500 mL de tampão de lavagem PBS ^+. Lavar durante 5 min com PBS fresco ⁺ tampão de lavagem de um mínimo de 3 vezes.
      NOTA: Fixa esferóides podem ser armazenadas a 4 ° C em tampão de lavagem PBS ⁺ fresco durante vários dias. 0,01% de azida de sódio pode ser adicionado ao tampão de lavagem para inibir o crescimento microbiano durante o armazenamento.
   7. Substitua PBS ⁺ tampão de lavagem com 500 tampão de permeabilização mL. Incubar à temperatura ambiente durante 10-15 min.
   8. Substitua tampão de permeabilização com 500 uL de BSA tampão de bloqueio e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
      1. Opcionalmente, remover o tampão de bloqueio de ASB. Usando bisturi ou tesouras, esferóides especiais de consumo e os 3 mm Área mm x 3 mm em torno da camada de colagénio. Usando uma grande ponta bore P1000, desalojar o bloco excisadas de colágeno por lavagem suavemente com tampão BSA bloqueio fresco. Transferir bloco colágeno a 1,5 tubo mL.
      2. Centrifugar a 2000 xg durante 2 minutos e remover o sobrenadante. O tubo pode ser cuidadosamente invertida sobre uma toalha de papel limpa para afastar o excesso de líquido.
   9. Adicionar anticorpo primário para esferóides e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Adicionar um volume suficiente de anticorpo primário de tal forma que a camada de colagénio está uniformemente toda submersa. Os passos opcionais acima referidas (tipicamente 5.6.8.1-5.6.8.2) permitir a utilização de menores volumes de anticorpo.
   10. Submergir slides câmara em um recipiente com pelo menos 10 mL PBS ⁺ buf lavagemfer durante 10 minutos para lavar. Repetir um mínimo de duas vezes.
       1. Opcional, se esferóides foram excisados a partir de camada de colagénio anteriormente (Passo 5.6.8.1), adicionar um mínimo de 1 ml de PBS ⁺ tampão de lavagem para o tubo de 1,5 ml e agitar suavemente. Deixar na água durante um mínimo de 10 min.
       2. Remover o máximo ⁺ tampão de lavagem de PBS e possível repetir a lavagem com PBS ⁺ tampão de lavagem de um mínimo de duas vezes. Centrifugar a 2.000 xg durante vários minutos para sedimentar o colagénio bloco.
          NOTA: limpar as superfícies externas da corrediça da câmara de limpeza com etanol 70% antes de mergulhar em tampão de lavagem.
   11. Repita os passos 5.6.9-5.6.10 utilizando anticorpo secundário apropriado.
       NOTA: Se esferóides foram coradas directamente no vaso de imagem, vá para o passo 5.6.13.
   12. Opcional, se esferóides foram excisadas a partir da camada de colágeno anteriormente (Passo 5.6.8.1), lâminas de vidro limpas e lamelas de microscopia confocal compatível com etanol 70%.
       1. Remover o tampão de lavagem, tanto quanto possível a partir do bloco de colágeno e ressuspender em ultrapura H ₂ O. Execute esta etapa imediatamente antes da montagem. Não deixe blocos manchadas imersão em água.
       2. Utilizando uma pinça fina com ponta, segure borda do bloco de colágeno e transferência para lâmina de vidro.
       3. Usando a pinça para segurar o colágeno no lugar, use um cotonete de algodão limpo para pavio excesso de líquido do bloco de colágeno, tomando cuidado para não tocar o colágeno diretamente.
          NOTA: Se o colágeno torna-se preso a cotonete pode ser gentilmente removidos ou usando uma pinça, ou por submersão em água.
   13. Utilizando uma técnica de pipetagem inversa, dispensar 100 L MOWIOL meio de montagem para o bloco de colágeno e lugar lamela sobre a amostra.
       1. Use um cotonete ou toalha de papel para pavio excesso de meio de montagem MOWIOL e água para fora sob a lamela.
       2. Permitir MOWIOL meio de montagem para endurecer durante a noite a 4 °C. Selo bordas da lamela com unha polonês.
   14. Imagem esferóides coradas utilizando microscopia confocal de fluorescência ou de observar a localização de proteínas de interesse, a formação de estruturas invasoras, etc (Figuras 5B, 5C).
       NOTA: manchado esferóides deve ser protegido da luz para evitar a fotodegradação.

6. anoikis Assay

NOTA: O protocolo formação esferóide é facilmente adaptado para quantificar o crescimento independente de ancoragem e resistência anoikis em uma variedade de tipos de células.

1. Sementeira células para ensaio anoikis (Figura 6)
   1. Siga as instruções para a produção de esferóide na secção 1.4, mas usar um mínimo de 30 mg de metil-celulose / mL para preparar meio de formação esferóide.
      NOTA: Quando aquecida, a 30 mg / mL de metil-celulose devem produzir um gel espesso que mantém as células em suspensão.
   2. Incubar as células durante vários dias a semanas e emspect regularmente a 10X de ampliação utilizando um microscópio. As células que resistem a anoikis deverão proliferar e formar colónias.
   3. Quantificar anoikis através da medição do número e tamanho das colónias formadas em cada poço.
      Observação: Uma vez que as colónias são formadas, elas podem ser lavadas para remover a metil celulose e utilizada para ensaios baseados em esferóide, tal como descrito.

Results

Nós descrevemos um método flexível e eficiente para gerar esferóides discretos utilizando placas de células-repelentes e meios de formação de esferóides suplementadas com MC. Sob as condições apropriadas de MC e de soro, as células individuais assentar e aderir em conjunto no centro do poço para formar esferóides com adesão mínima para o fundo do poço. Usando este protocolo, esferóides foram gerados a partir de uma variedade de linhas celulares (Figura 2B). Titulação de ...

Discussion

Apresenta-se um método rápido e flexível para a produção de esferóides de células 3D para modelar a arquitectura dos tecidos in vivo, utilizando reagentes baratos e amplamente disponíveis. Nosso protocolo explora as propriedades não-citotóxico e de promoção de adesão de MC ^{8, 9} para mediar a agregação celular e minimizar a formação de monocamada de células. Ao contrário de matrizes à base de proteínas isoladas a partir de fontes animais, MC é inerte, nã...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffers
10x Fosfato tamponado salina	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Solução de cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	21114	Usado para PBS+ tampão de lavagem; Não autoclave o tampão de lavagem PBS+ após a adição de cloreto de cálcio
Solução de cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M1028	Usado para tampão de lavagem PBS+; Não autoclave o tampão de lavagem PBS+ após a adição de cloreto de magnésio
Nome<	strong>Empresa	Número de catálogo	Comentários
Para formação de esferoides
96-well Placa repelente de células com fundo em U	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	Para cultura de linhas celulares SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	Para cultura de linha celular TT
Soro bovino fetal	Filtro Sigma-Aldrich	F1051	antes de usar para remover contaminantes particulados
Metilcelulose	Sigma-Aldrich	M7027	Prepare em água a 100 mg / mL
Roswell Park Memorial Institute Médio	Sigma-Aldrich	R8758	Para cultura de linhas celulares HCT-116, BxPC-3
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Tampão de dissociação
Nome< / strong>	Empresa< / strong>	Número de catálogo< / strong>	Comentários
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3,1 mg/mL; Mantenha no gelo quando em uso
DMEM Vermelho Fenol Livre Baixa Glicose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Menos fluorescência de fundo em comparação com o meio suplementado com Vermelho de Fenol
Fator Neurotrófico Derivado da Linha de Células Gliais	Peprotech	450-10	Quimioatrativo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Para Microscopia de Imunofluorescência
#1.5	Microscopia Eletrônica	72225-01	Para montagem de esferoides excisados
Alexa-Fluor 488 Faloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379	Usado para corar actina a 1:200
Albumina de soro bovino Bioshop	Canada Incorporated	ALB001	Usado em tampão de bloqueio BSA
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glicerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Usado no meio de montagem MOWIOL
Software ImageJ	Freeware, NIH-Usado		para análise de imagem
Microslides	VWR International	48312-024	Para montagem de esferoides excisados
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Usado no meio de montagem MOWIOL
Paraformaldeído	EMD-Millipore	PX0055-3	Usado no tampão de fixação
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Usado no tampão de permeabilização