RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

Resumo

A eletroporação de próxima geração é um método eficiente para transfectar células Th17 humanas com pequenos RNAs para alterar a expressão gênica e o comportamento celular.

Resumo

As células T CD4⁺ podem se diferenciar em vários subconjuntos de células T auxiliares efetoras, dependendo do meio de citocinas circundante. As células Th17 podem ser geradas a partir de células T CD4⁺ virgens in vitro, ativando-as na presença das citocinas polarizadoras IL-1β, IL-6, IL-23 e TGFβ. As células Th17 orquestram imunidade contra bactérias e fungos extracelulares, mas sua atividade aberrante também tem sido associada a várias doenças autoimunes e inflamatórias. As células Th17 são identificadas pelo receptor de quimiocina CCR6 e definidas por seu fator de transcrição mestre, RORγt, e citocina efetora característica, IL-17A. As condições de cultura otimizadas para a diferenciação de células Th17 facilitam os estudos mecanísticos da biologia das células T humanas em um ambiente controlado. Eles também fornecem um cenário para estudar a importância de genes específicos e programas de expressão gênica por meio da interferência de RNA ou da introdução de imitadores ou inibidores de microRNA (miRNA). Este protocolo fornece um método fácil de usar, reprodutível e altamente eficiente para a transfecção transitória de células Th17 humanas primárias diferenciadoras com pequenos RNAs usando um dispositivo de eletroporação de última geração.

Introdução

As células T CD4 ⁺ são orquestradoras cruciais da resposta imunitária adaptativa. As células T CD4 ⁺ naive são capazes de se desenvolver em várias células T efectoras diferentes (por exemplo, Th1, Th2, Th17, etc), cada um com o seu próprio conjunto de citocinas característicos e factores de transcrição, dependendo do microambiente local ^1. As decisões da linhagem que as células T fazem são fundamentais tanto para a imunidade protetora e tolerância à auto. Culas Th17 são um subconjunto de células T conhecidos para combater bactérias extracelulares e fungos, mas as suas respostas erradas também está implic....

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes da UCSF de Ética em Pesquisa humanos.

1. Preparação de Culturas de Células T, Isolamento de células T CD4 ^+, e Th17 Polarização

1. No Dia 0, revestimento 6-se placas de cultura de tecido com 1,5 mL por po de anticorpo anti-CD3 humano (2 ug / mL) e anti-CD28 humano (4 ug / mL) em PBS com cálcio e magnésio, durante pelo menos 2 h a 37 ° C.
   1. Alternativamente, revestir as placas durante a noite a 4 ° C. Enrole placas em parafilme.
2. Preparar as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMCs) por centrifugação em gradiente de densidade ....

Resultados

O primeiro passo para o desenvolvimento de um sistema fiável de electroporating com sucesso células Th17 humanos era robusta para gerar in vitro diferenciadas culturas de culas Th17 humanos. As células T cultivadas sob condições polarizantes Th17-expressa o receptor de quimiocina CCR6 e o factor de transcrição RORγt (figura 1A, esquerda). Estes marcadores não foram expressas quando as células T foram cultivadas sob condições não polarizadores (THN) (figu.......

Discussão

Este protocolo fornece um método melhorado para a entrega de pequenos RNAs em células Th17 humanos. Embora as células Th17 humanos foram usadas aqui, este método de electroporação com pequenos RNAs pode ser utilizado com outros subconjuntos auxiliar humano primário de T, tais como Th1, Th2, e Tregs. Não tem funcionado bem para as células T CD4 ⁺ naive então as células devem ser activadas em cultura antes da transfecção. Para este protocolo, que primeiro optimizado o sistema in vitro de cultura de uma.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anti-humano IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-humano IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S. B3
anti-humano CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
camundongo anti-humano CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-humano RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-humano CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3 / Coloração do fator de transcrição Conjunto de buffer	ebioscience	00-5523-00	Para coloração de citometria de fluxo de fator de transcrição intracelular
Inibidor de ligação Hu FcR Purificado	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Mídia de base sem soro"
MACS CD28 grau funcional puro, humano	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-CD3 humano Purificado	UCSF núcleo de anticorpo monoclonal	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purificado anti-humano IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-humano IFNg, ebiociência purificada de grau funcional		16-7318-85	Clone: NIB42
IL-23 humano recombinante	Peprotech	200-23
IL-1 humana recombinanteβ	Peprotech	200-01B
TGF humano recombinante-β 1	Peprotech	100-21C
IL-6 humano recombinante	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Não-alvo #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Humano RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Humano PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Kit de Células T CD4 Humanas Intocadas	ThermoFisher Scientific	11346D	Células T CD4+ Kit de
Isolamento Sistema de Tranfecção Neon	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Instrumento de eletroporação de próxima geração
Sistema de Tranfecção Neon 10 μ L Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Tampão de Ressuspensão T	ThermoFisher Scientific	Fornecido no kit (MPK1096)	"Tampão de Ressuspensão de Transfecção"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Gradiente de Densidade Médio
costar 6-well placas tratadas para cultura de tecidos	Placas de	fundo
plano Corning 3516placas tratadas com cultura de tecidos de 48 poços costar	Placas de fundo plano	Corning	3548
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Deve fazer 1x solução com água destilada antes de usar