Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Resumo

Aqui, apresentamos um método para expressar e purificar S100A12 (calgranulina C). Descrevemos um protocolo para medir sua atividade antimicrobiana contra o patógeno humano H. pylori .

Resumo

As proteínas de calgranulina são mediadores importantes da imunidade inata e são membros da classe S100 da família EF-mão de proteínas de ligação de cálcio. Algumas proteínas S100 têm a capacidade de se ligar a metais de transição com alta afinidade e efetivamente seqüestrar eles longe de patógenos microbianos invasores em um processo que é denominado "imunidade nutricional". O S100A12 (EN-RAGE) liga tanto o zinco como o cobre e é altamente abundante em células imunes inatas tais como macrófagos e neutrófilos. Relatamos um método refinado para a expressão, enriquecimento e purificação de S100A12 na sua configuração ativa de ligação a metais. A utilização desta proteína em análises de crescimento e viabilidade bacteriana revela que S100A12 tem actividade antimicrobiana contra o patogénio bacteriano Helicobacter pylori . A actividade antimicrobiana baseia-se na actividade de ligação ao zinco de S100A12, que quela o zinco nutriente, privando assim H. pylori que requer zinco para crescimento e pRoliferation.

Introdução

As prote�as S100 s� uma classe da fam�ia EF-hand de prote�as de liga�o de c�cio com uma diversidade de fun�es ¹ . Eles são expressos de uma forma específica de tecidos e células, e regulam um amplo espectro de funções celulares ^{2 , 3} . Exclusivas para proteínas de ligação ao cálcio, as proteínas S100 exibem funções intracelulares e extracelulares ^{4 , 5} . Dentro da célula, a ligação de Ca2 ⁺ induz uma alteração conformacional que expõe uma superfície hidrofóbica que alveja especificamente parceiros de li....

Protocolo

1. Expressão de S100A12

1. Transformar células BL21 DE3 competentes com um plasmídeo pGEMEX-S100a12 utilizando um protocolo padrão de choque térmico ¹⁸ . Adicionar 1 a 5 μL de plasmídeo a 50 μL de bactérias num tubo de microcentrífuga em gelo. Incubar durante 20 min.
2. Aquecer as células a 42 ° C durante 30 s.
3. Incubar as células em gelo durante 2 min.
4. Adicionar 500 μL de meio SOC às células. Incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm num agitador orbital durante 1 h.
5. Placa 150 μL da reação de transformação em meio LB-agar (suplementado com 100 μg / mL de ampicilina). Incubar durante 12-16 h a 37 ° C. ....

Resultados

S100A12 expressão e purificação

Uma purificação em três passos produziu ~ 40 mg de S100A12 recombinante a partir de 50 mL de cultura bacteriana. O primeiro passo foi uma precipitação com sulfato de amónio de proteínas endógenas de E. coli . Este passo foi seguido por cromatografia de permuta aniónica ( Figura 1A ). A proteína é rastreada por uma SDS-PAGE corada com Coomassie Brilliant Bl.......

Discussão

É apresentado um protocolo eficiente para expressão e purificação de S100A12 humano. O sistema de expressão de E. coli é a ferramenta mais comum usada para a produção de proteínas recombinantes, particularmente quando são necessárias quantidades de mg para estudos bioquímicos e biofísicos. Um aperfeiçoamento chave do procedimento aqui descrito é o uso de meios de auto-indução ²⁶ que aumenta o rendimento da proteína purificada por um factor de quase trinta em comparação com a expressão co.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
S100A12 Expressão
Células de expressão
BL 21 (DE3) células competentes	New England Biolabs	C25271
Componentes
de pesquisa de extrato de	levedura	Y20020-250.0
Produtos	de pesquisa NaCl International	S23020-500.0
pesquisa de	triptona	T60060-250.0
FeCl3	Sigma-Aldrich	F2877
MgSO4	Research Products International	M65240-100.0
Na2HPO4	Research Products International	S23100-500.0
KH2PO4	Research Products International	P41200-500.0
NH4Cl	Research Products International	A20424-500.0
Na2SO4	Research Products International	S25150-500.0
Produtos de Pesquisa de Glicerol	International	G22020-1.0
Produtos de Pesquisa	de D-glicose	G32040-500.0
	lactose Sigma-Aldrich	L2643
Agente de seleção
ampicilina	Produtos de Pesquisa Internacional	A40040-5.0
S100A12 Purificação
AKTA Start Sistema de Cromatografia	GE	29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow	GE	17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR	GE	17-1166-01
Nanodrop lite espectrofotômetro	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE
Tris Base	Research Products	International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Placas de ágar sangue	Lab Supply Company	BBL221261
Caldo Brucella	Sigma-Aldrich	B3051
Colesterol (250x)	Thermo Fisher Scientific	12531018
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Cloreto de Zinco	Sigma-Aldrich	229997

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