Artigo de método

Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de Bacillus -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

DOI:

10.3791/55576

⸱

16 de maio de 2017

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

Neste artigo

Resumo

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Bacillus anthracis é o agente patogénico obrigatório do antraz mortal por inalação, pelo que os estudos dos seus genes e proteínas são rigorosamente regulados. Uma abordagem alternativa é estudar genes ortólogos. Descrevemos estudos biofísico-químicos de um ortólogo de B. anthracis em B. cereus , bc1531, requerendo equipamento experimental mínimo e sem preocupações de segurança graves.

Resumo

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Para superar as restrições e regulamentações de segurança ao estudar genes e proteínas de patógenos verdadeiros, seus homólogos podem ser estudados. Bacillus anthracis é um agente patogénico obrigatório que provoca o antraz mortal por inalação. Bacillus cereus é considerado um modelo útil para estudar B. anthracis devido à sua estreita relação evolutiva. O grupo de genes ba1554 - ba1558 de B. anthracis é altamente conservado com o cluster bc1531 - bc1535 em B. cereus , bem como com o cluster bt1364 - bt1368 em Bacillus thuringiensis, indicando o papel crítico dos genes associados no gênero Bacillus . Este manuscrito descreve métodos para preparar e caracterizar um produto proteico do primeiro gene ( ba1554 ) do grupo genético em B. anthracis usando uma proteína recombinante de seu ortholog em B. cereus , bc1531.

Introdução

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A expressão de proteína recombinante é amplamente utilizada para superar problemas associados a fontes de proteína naturais, tais como quantidades limitadas de proteínas e contaminação prejudicial. Além disso, nos estudos de genes patogénicos e proteínas, uma estirpe laboratorial alternativa que não requer precauções adicionais de segurança pode ser utilizada. Por exemplo, Bacillus cereus é um modelo útil para estudar Bacillus anthracis devido à sua estreita relação evolutiva 1 .

B. anthracis é um agente patogénico obrigatório que provoca o antraz mortal por inalação em seres humanos e ga....

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Protocolo

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1. Produção e Purificação de Proteína Recombinante de rBC1531

  1. Prepara�o de um plasm�eo de express� da prote�a BC1531 recombinante (rBC1531)
    1. Preparar DNA genômico de B. cereus 10 .
    2. Amplificar o gene bc1531 a partir de um molde de ADN genómico de B. cereus por reacção em cadeia com polimerase (PCR), utilizando iniciadores directos e inversos (ver a Lista de Materiais) para criar locais de enzimas de restrição Bam HI e Sal I, respectivamente 10 .
    3. Digerir o produto de PCR e um vector pET49b modificado (pET4....

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Resultados

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A caracterização da proteína de interesse neste estudo começou por preparar uma quantidade suficiente de proteína Bc1531 (rBC1531) recombinante de B. cereus , de preferência mais do que vários miligramas. O fragmento de ADN que codifica a proteína BC1531 foi preparado por PCR utilizando o ADN genómico de B. cereus como molde, uma vez que contém genes ortólogos idênticos a ba1554 . RBC1531 foi sobre-expresso como uma proteína solúvel em células de E.......

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Discussão

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Os estudos de patógenos verdadeiros são limitados devido a restrições e regulamentos de segurança. Alternativamente, os patógenos podem ser estudados usando não patógenos evolutivamente relacionados ou espécies menos patogênicas. O gene ba1554 é considerado um gene crítico em B. anthracis. Felizmente, um gene idêntico está presente no B. cereus não clínico.Assim, sem sérias preocupações de segurança, a proteína BC1531 recombinante pode ser usada para caracterização biofísica e enzimática. Aqui.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Os conjuntos de dados de difracção de raios X foram recolhidos na linha 7A do Laboratório de Aceleração de Pohang (Coreia). Este estudo foi apoiado pelo Programa de Investigação Científica Básica administrado através da Fundação Nacional de Investigação da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planeamento do Futuro (2015R1A1A01057574 a MH).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bacillus cereus ATCC14579Coleção coreana para cultura de tecidos3624
Kit de preparação de DNA genômicoGeneAll106-101Preparação de DNA genômico
Primer diretoMacrogenGAAGGATCCGGAAGCAAAAA
CGATGAAAGATATGCA		em>BamHI o local está sublinhado
Primer reversoMacrogenCTTGTCGACTTATTCTTTCTCT
CCCTCATCAATACGTG		SalI O site está sublinhado
nPfu-ForteEnzynomicsP410PCR polimerase
BamHIEnzynomicsR003S
SalIEnzynomicsR009S
pET49b vetor de expressãoNovagen71463O vetor de expressão foi modificado para adicionar tags de afinidade e sítios BamHI/Sali10
T4 DNA ligaseEnzynomicsM001S
Memebranade diálise Thermofisher18265017
Aquecedor de bloco secoJSRJSBL-02T
LB caldo (Luria-Bertani)Solução LPSLB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton, Dickinson and Company
Solução de canamicinaLPSKAN025
Kit de mini-preparaçãoFavorgenFAPDE300Preparação de DNA de plasmídeo
BL21 (DE3) Célula competenteNovagen69450-3CN
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)Fisher BioReagents50-213-378
Cloreto de sódioDaejung7548-4100PBS material
Cloreto de potássioDaejung6566-4405PBS material
Fosfato de potássioBio Basic IncPB0445PBS material
Fosfato de sódioBio Basic IncS0404PBS material
ImidazolBio Basic IncIB0277
SonicatorSonicsVCX 130
Ni-NTA agarosQiagen30210Níquel talão
RotatorFinepcrAG
Precision Plus Proteína Dual Color StandardsBio-rad1610374SDS-PAGE proteína padrão
Coonmassie Azul Brilhante R-250Fisher BioReagentesBP101-25Solução de coloração Coomassie
Álcool metílicoSamchun químicoM0585Solução de coloração de Coomassie
Ácido acéticoDaejung1002-4105Solução de coloração de Coomassie
Memebrana de diáliseThermofisher68035
2-MercaptoetanolSigma-aldrichM6250
TrombinaMerckmillipore605157-1KUCNPrepare alíquotas de 20 μ L (1 Unidade por μ L) e armazene a 70 graus; C e descongelar antes do uso
Superdex 200 16/600General Electric28989335Cromatografia de exclusão de tamanho
Padrão de filtração em gelBio-rad151-1901
Filtro centrífugoAmiconUFC800396
Placas de cristalizaçãoHampton researchHR3-083Placa de queda de 96 poços
O conjunto principal JCSG I-IVQiagen130924-130927Solução de secreening de cristalização
MicroscópioNikonSMZ745T
Placas CryschemHampton researchHR3-158Placa de gota de 24 poços
Pirofosfatase inorgânicaSigma10108987001
Solução de molibdato de amônioSigma13106-76-8
Ácido L-ascórbicoSigma50-81-7
NTP substratoStartagene200415-51
EspectrofotômetroBiotekSynergyH1leitor de microplacas
GraphPad Prism 5GraphPadPrism 5 para janela
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Referências

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  1. Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
  2. Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
  3. Deli, A., et al.

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Etiquetas

Recombinant Protein ExpressionProtein CrystallizationEnzymatic KineticsNickel Affinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyThrombin DigestionSitting Drop Vapor DiffusionX ray CrystallographySpectrophotometric AnalysisBacillus Cereus

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