Avaliando o procedimento para realizar cistometria acordada em um modelo de mouse

Summary

Este estudo descreve os procedimentos cirúrgicos e técnicas experimentais para realizar cistometria acordada em um mouse que se move livremente. Além disso, fornece evidências experimentais para apoiar sua otimização e padronização.

Abstract

A cistometria de enchimento acordada tem sido usada por um longo tempo para avaliar a função da bexiga em ratos que se movem livremente, no entanto, os métodos específicos utilizados variam entre os laboratórios. O objetivo deste estudo foi descrever o procedimento microcirúrgico utilizado para implantar um tubo intravesical e a técnica experimental para registro da pressão da bexiga urinária em um mouse acordado, movendo livremente. Além disso, dados experimentais são apresentados para mostrar como a cirurgia, bem como o tipo e tamanho da tubulação, afetam a função do trato urinário inferior ea sensibilidade de gravação. O efeito do diâmetro do tubo sobre o registo de pressão foi avaliado em tubos de polietileno e poliuretano com diferentes diâmetros internos. Subsequentemente, o tubo com melhor desempenho de ambos os materiais foi implantado cirurgicamente na cúpula da bexiga urinária de ratinhos C57BL / 6 machos. Foi registada uma frequência de micturização de doze horas durante a noite em animais e animais saudáveis ​​e intactos 2, 3, 5 e 7 dias após a cirurgia. Na colheita, as bexigasForam avaliados para detectar sinais de inchaço usando a observação bruta e foram posteriormente processados ​​para análise patológica. A maior extensão de inchaço da bexiga foi observada nos dias 2 e 3, o que correlacionou com dados de micção comportamental mostrando significativamente deteriorada função da bexiga. Ao dia 5, a histologia da bexiga e a frequência de micção tinham normalizado. Com base na literatura e na evidência fornecida por nossos estudos, propomos os seguintes passos para o registro in vivo da pressão intravesical e volume void em um mouse acordado: 1) Realizar a cirurgia usando um microscópio operacional e ferramentas microcirúrgicas, 2) Use polietileno-10 Tubulação para minimizar artefatos de movimento, e 3) Realizar cistometria no 5º dia pós-operatório, quando o inchaço da bexiga resolve.

Introduction

A cistometria de enchimento (FC) é um método de diagnóstico que envolve a colocação de um cateter na bexiga urinária para registrar a pressão durante o enchimento lento da bexiga. Introduzido pela primeira vez em 1927 como um método de diagnóstico clínico para avaliar a função do trato urinário inferior, manteve-se amplamente utilizado. ¹ Em aplicações de pesquisa, o FC pode ser usado para testar a função da bexiga em modelos animais saudáveis ​​e doentes e para estudar os efeitos de agentes farmacológicos. Modelos animais de roedores são comumente usados ​​para investigar a função do trato urinário inferior. ² Neste grupo de mamíferos, o FC foi inicialmente desenvolvido para uso em ratos. ³ Aqui, a metodologia para implantar um tubo na bexiga urinária e realizar FC foi bem descrita e utilizada por muitos pesquisadores com um nível aceitável de reprodutibilidade. ⁴ A disponibilidade de estirpes transgênicas e knock out torna os ratos uma espécie valiosa para inúmeras áreas de pesquisa,Incluindo o campo da disfunção do trato urinário inferior. A metodologia utilizada para realizar a cistometria do mouse varia sensivelmente entre laboratórios, dificultando a comparação dos resultados. ⁵

Comparado com os modelos ex vivo , o FC preserva a anatomia do tracto urinário inferior, permitindo avaliar a função coordenada entre a bexiga e a sua saída durante as fases de armazenamento e micção do ciclo miccional. Pesquisas anteriores mostram que numerosos, comumente utilizados anestésicos suprimir contração micção. Agentes que preservam a contração do músculo liso da bexiga urinária (uretano, α-cloralose, cetamina e xilazina), permitindo que o animal micure, ainda reduz significativamente a capacidade funcional da bexiga e suprime a neurotransmissão. ^{6 , 7 , 8 , 9} Embora tecnicamente mais desafiador, FC realizado em awPreservando a integridade funcional do reflexo miccional.

A função do trato urinário inferior é influenciada por múltiplos fatores, incluindo inchaço pós-operatório da parede da bexiga, estresse devido à dor e desconforto e influências ambientais. Utilizando uma técnica cirúrgica que minimiza o dano tecidual durante a implantação do tubo e os métodos de registro que reduzem o movimento do tubo, ao mesmo tempo em que permite que o animal ambule livremente, são essenciais para a obtenção de gravações precisas e reprodutíveis.

Se realizada adequadamente, in vivo FC em animais que se movem livremente pode fornecer dados que reflictam fielmente a função fisiológica da bexiga. ¹⁰ FC em animais em movimento livre pode fornecer dados sobre os seguintes parâmetros; Pressão basal ou basal: Pressão mínima entre duas micções. Pressão de intermitência: Pressão média entre duas micções. Pressão de limiar: Im pressão intravesicalAntes da micção. Pressão máxima: Pressão máxima da bexiga durante um ciclo de micção. Atividade espontânea (ou pressão média oscilatória de intermiturização): Pressão de intermetria menos pressão basal. Contrações não votivas: Aumento da pressão intravesical durante a fase de enchimento, não associado à liberação de fluido. Conformidade da bexiga: Capacidade da bexiga dividida pela pressão de limiar menos a pressão basal. Frequência de micção: Número de micções por unidade de tempo. Intervalo de intermitência: Período entre duas pressões de micção máximas. Capacidade da bexiga: volume infundido dividido pelo número de micções. Uma descrição detalhada destes parâmetros e terminologia padronizada foi publicada anteriormente. ¹¹

FC pode ser realizada utilizando um método de infusão intravesical de ciclo único ou contínuo. A cistometria contínua permite o registro de múltiplos ciclos de micção e a seleção de dados representativosSobre a reprodutibilidade. Sua precisão na medição da capacidade da bexiga é limitada devido ao volume residual desconhecido. Além disso, é desafiador colecionar pequenos volumes anulados (os quais com base na tensão e no sexo variam entre 30 e 184 μL) em camundongos livremente ambulantes. A utilização deste método para registar volume esvaziado é menos precisa em comparação com uma preparação anestesiada, mas é superior na medida em que evita os efeitos supressores dos anestésicos na função da bexiga. A cistometria de ciclo único deve ser utilizada para avaliar a capacidade da bexiga. Neste método, a bexiga é esvaziada por aspiração antes da infusão e a capacidade é calculada como uma função da taxa de infusão multiplicada pelo tempo até à pressão máxima.

Embora a técnica de realização de cistometria em pequenos roedores tenha sido publicada, descreveu a cirurgia realizada em um rato e recomendou que a cistometria do mouse deve ser realizada sob anestesia com uretano. ¹⁰ O objetivo desta comunicação éO descrever tanto as técnicas microcirúrgicas utilizadas para implantar um tubo intravesical na cúpula da bexiga urinária quanto a configuração experimental usada para registrar a função do trato urinário inferior, in vivo , durante o enchimento contínuo da bexiga e a micção em um mouse livre acordado. Além disso, foram realizadas experiências para determinar como o comprimento, diâmetro e material da tubagem, bem como a metodologia para a realização de FC in vivo , afectam a gravação. Este protocolo experimental resume técnicas previamente publicadas e propõe uma série de modificações com base em resultados experimentais.

Protocol

Os animais foram alojados na Universidade de Vermont Animal Care Facilidade de acordo com diretrizes institucionais. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o guia do National Institutes of Health para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. Implantação de tubo intravesical

1. Preparação de tubos e instrumentos para o procedimento cirúrgico
   1. Corte um pedaço de 7 cm de tubo PE10 para fazer o cateter para implantação.
   2. Criar um alargamento em uma extremidade do tubo PE10 lentamente avançando a extremidade para uma chama aberta.
      NOTA: Retire rapidamente o tubo assim que a flare se desenvolver.
   3. Aplique três gotas de cola quente para todos os fins, usando o ajuste de baixa temperatura em uma pistola de cola, a 4,5, 5 e 5,5 cm da extremidade queimada na parte externa do tubo PE10. Estes ajudarão a proteger o tubo na parte traseira do animal. ( Figura 1 )
   4. Esterilizar a tubulação por imersão em 70%Etanol e, em seguida, lave com NaCl a 0,9% esterilizado antes da utilização. Deixe o tubo cheio para evitar a introdução de bolhas de ar no sistema.
   5. Crie um plugue de calibre 30 para selar a extremidade do cateter PE10 separando uma agulha de calibre 30 do cubo manualmente manipulando a extremidade proximal de lado a lado. Aplique uma gota de cola quente no final. Certifique-se de que o selo é estanque. ( Figura 2 )
   6. Utilize os seguintes instrumentos microcirúrgicos: Dois pares de microfortes curvos Dumont # 7, dois microcondutores curvos Dumont # 5, uma agulha 21 G, um hemostato recto ultrafino, micro tesouras, pequenas tesouras de dissecação e um suporte de micro-agulhas.
   7. Esterilize todos os instrumentos antes de iniciar o procedimento.
2. Preparação do animal
   1. Depois de anestesiar o animal, raspar a parte inferior do abdome primeiro, em seguida, transformar o animal propenso e barbear e limpar a área na parte superior das costas com 70% de álcool seguido por betadine. Aplique pomada veterinária aos olhos para evitar a secura. Em seguida, use um par de tesouras retas e sem corte e um par de micro-forças curvas Dumont # 7 para fazer uma incisão cutânea de 1,5 cm de comprimento entre as escápulas e colocar o animal em decúbito dorsal sobre uma almofada aquecida (37 ° C) coberta com cortinas estéreis.
   2. Finalmente, limpe o abdômen com álcool e betadine.
3. Procedimento cirúrgico
   OBSERVAÇÃO: Execute todos os procedimentos cirúrgicos sob um microscópio operacional com ampliação variando de 3,15X a 20X. Depois de colocar o animal sobre as cortinas estéreis, coloque luvas estéreis. Continue usando procedimentos estéreis durante toda a cirurgia.
   1. Colocar o animal numa caixa de indução e anestesiar usando 2% de isoflurano inalado com um transportador de oxigénio (1 L / min). Manter a anestesia durante todo o procedimento colocando a cabeça do animal em um cone de nariz e usando 2% de isoflurano inalado com um transportador de oxigênio (1 L / min). Inicie a cirurgia após receber um negativoAtiva do teste toe-pinch.
   2. Use um par de tesoura reta e romba e um par de micro-forças curvas Dumont # 7 para fazer uma incisão abdominal inferior de 1,5 cm na linha mediana através da pele. Subseqüentemente, criar uma incisão correspondente através da fáscia ao longo da linha alba e músculo para expor a cúpula ea metade superior da bexiga urinária. Evite ferir a bexiga, aplicando tração para cima para cada camada de tecido usando um par de Dumont # 7 curvo microforceps. Manter as vísceras abdominais da dessecação adicionando gotas de soro fisiológico quente.
   3. Gire o animal para o lado para acessar a incisão na nuca. Empurre um hemostato estreito subcutaneamente através da incisão. O canal subcutâneo deve começar na parte de trás, e continuar ao longo do lado.
   4. Uma vez que a ponta do instrumento chegue ao fundo da caixa torácica, vire a ponta em direção à linha média e dentro do abdômen (haverá um pequeno estalo ao perfurar os músculos da parede abdominal). Continue avançando o hemostasio até a ponta é exposta na incisão abdominal sob a camada muscular. ( Figura 3 )
   5. Segure a extremidade "não queimada" da tubulação com o hemostato e retraia lentamente a ferramenta, puxando a extremidade do tubo para fora através da incisão na parte posterior do pescoço. Ajustar a extremidade alargada da tubagem de modo a que fique directamente acima da cúpula da bexiga.
   6. Faça um laço solto de sutura monofilamento 6-0 (não absorvíveis) e colocá-lo em cima da cúpula da bexiga. Este laço será usado mais tarde para fixar o tubo na bexiga.
   7. Coloque um pequeno rolo de tecido sem fiapos no abdômen e atrás da bexiga para ajudar a estabilizá-lo e elevá-lo.
   8. Prepare-se para inserir a extremidade alargada do cateter PE10 na bexiga.
      1. Na mão não-dominante, segure a cúpula da bexiga com Dumont # 7 curvo microforceps e manter esta aderência até que o cateter é colocado na bexiga.
      2. Use uma agulha de calibre 21Fazer uma cistotomia no ápice da cúpula. Suavemente sonda a cistotomia com um par fechado de # 5 curvo microforceps para se certificar de que o cateter pode facilmente passar pelo buraco.
      3. Enquanto ainda segura a cúpula da bexiga na mão não dominante, coloque a extremidade queimada do cateter PE10 na bexiga (empurre a chama até o pescoço da bexiga para que ela não escorregue enquanto a protege).
      4. Amarre a sutura monofilamento 6-0 em torno da cúpula da bexiga e tubulação com o empate colocado anterior à tubulação. Certifique-se de amarrar a sutura tão alto na bexiga quanto possível para evitar reduzir artificialmente a capacidade da bexiga. ( Figura 4 )
      5. Alternativamente, fixe o cateter usando uma sutura de cordão de bolsa da seguinte maneira. Faça uma sutura de selo de bolsa solta na cúpula da bexiga usando monofilamento 6-0. Siga os passos 1.3.8.1 - 1.3.8.3 para realizar a cistotomia e inserir o cateter. Fixe o tubo amarrando a sutura da bolsa. ( Figura 5 )
   9. Teste a permeabilidade eo selo do tubo na bexiga, ligando uma seringa de insulina de 0,5 mL com uma agulha de calibre 30 à extremidade distai do tubo. Lentamente preencher a bexiga com 0,1 - 0,2 mL de 0,9% NaCl até que uma gota aparece no orifício uretral, em seguida, esvaziar a bexiga por aspiração. É importante que a bexiga possa ser cheia e esvaziada.
   10. Se não houver vazamentos na cúpula, encaixe a bexiga com um par de micro-forças curvas e puxe suavemente a tubulação até que a chama esteja descansando contra o interior da cúpula da bexiga.
   11. Antes de fechar, retire o pequeno rolo de tecido e certifique-se de que a bexiga está na sua posição normal.
   12. Feche a parede abdominal em duas camadas (músculo e pele) com 6-0 sutura de corrida. É preferível aproximar o músculo reto do abdome pela sutura apenas das bordas da fáscia abdominal anterior (parede anterior da bainha do reto).
   13. Para segurar a tubulação nos animais de volta, suavemente roO animal em seu abdômen. Inserir a porção subcutânea da âncora metálica na incisão interescapular. ( Figura 12 ) Use uma sutura 6-0 para fixar o tubo e a âncora ao envolvê-los com uma sutura de colchão vertical.
   14. Certifique-se de uma bolha cola permanece acima e abaixo da pele para evitar que o tubo de puxar para fora. Corte o tubo aproximadamente 2 cm acima da pele.
   15. Insira suavemente o plugue de calibre 30 (passo 1.1.5) na extremidade do tubo para evitar que a urina vaze.
4. Injectar 0,5 mL NaCl a 0,9% por via subcutânea para hidratação. Administre analgesia pós-operatória imediatamente após a cirurgia e mantenha por 48 h.
   1. Coloque o animal de volta em sua gaiola localizada sob uma lâmpada infravermelha. Manter constante observação até que o animal se move em torno da gaiola livremente.
5. Monitorar o animal diariamente e permitir que ele se recupere por 5 dias antes da gravação.

2. Cisto acordadoOmetry Gravação

1. Preparação do programa de gravação, transdutor de pressão e bomba de infusão.
   1. Antes de anestesiar o animal, conecte a bomba de infusão, o transdutor de pressão e o giro 22 G com tubo PE50. ( Figura 6 )
   2. Abra o programa de gravação (veja a tabela de materiais para um exemplo), em um computador para calibrar a pressão do sistema e preparar a gravação. Certifique-se de usar as mesmas configurações durante a calibração e gravação.
      1. Encha uma seringa de 20 mL com 10 - 15 mL de NaCl a 0,9% de temperatura ambiente e carregue na bomba de infusão. Programe a bomba para infundir a uma taxa de 0,6 mL / h.
      2. Fixe o transdutor de pressão à mesma altura da bexiga do animal ou do fundo da gaiola de gravação.
      3. Conecte o giro de calibre 22 à extremidade do transdutor de pressão (PE50 - tubulação - transdutor de pressão para girar)
         NOTA: O giro é usado para evitar que o tubo torça ou dobre umaO animal se move.
      4. Avançar a bomba de seringa para lavar 0,9% NaCl através do sistema. Certifique-se de remover todas as bolhas de ar antes de calibrar.
      5. Com o programa de gravação funcionando, use uma régua para calibrar a pressão (cm / H ₂ O). Mova lentamente a extremidade do cabo PE50 de 0 a 30 cm. Ajuste o zero se necessário.
         NOTA: A marca de 0 cm deve estar na mesma altura que o chão da gaiola de gravação e do transdutor de pressão.
   3. Suspender o giro de calibre 22 acima do centro da gaiola de gravação. Certifique-se de que o fundo da gaiola permite que a urina caia sobre o dispositivo coletor da balança posicionada abaixo da gaiola. Ajuste a altura da alça para que o mouse possa se mover livremente ao redor da gaiola sem forçar ou esticar a tubulação. ( Figura 7 )
   4. Quando terminar, verifique se o sistema e a tubulação PE50 externa estão cheios de NaCl a 0,9% e todas as bolhas de ar foram removidas.
2. PreparaçãoPara a gravação do animal
   1. Anestesiar o animal com 2% de isoflurano inalado e colocá-lo em seu abdômen. Remova o plugue de calibre 30 e deslize a tubulação PE10 (cateter vesical) na extremidade do cabo PE50. Use cola quente para formar um selo estanque.
   2. Desligue a anestesia e coloque o animal na caixa de registro com um piso de arame paralelo, o que permitirá que a urina caia diretamente sobre um dispositivo de coleta colocado sobre um balanço analítico. ( Figura 7 )
   3. Iniciar a gravação uma vez que o animal está na gaiola, mas não comece a infundir. Monitorar o animal até que ele se recupera completamente da anestesia. Uma vez estabilizada a pressão da bexiga, comece a infusão de 0,9% de NaCl a uma taxa de 0,6 mL / h.
      NOTA: Faça uma anotação no programa de gravação quando quaisquer alterações forem feitas. É importante ter um registro de quando a infusão começa, pára, ou irregularidades ocorrem.
   4. Verifique se há vazamentos no sistema e verifique se o animalAlimentos e água.
   5. Continue a gravar numa sala silenciosa até se obterem três ciclos de micção reprodutíveis.
      NOTA: O animal deve ser completamente inalterado durante a gravação. De preferência, use o monitoramento remoto de vídeo para observar o comportamento.

Results

Não houve diferença significativa entre os materiais da tubulação e os diâmetros na consistência da subida e queda da pressão dentro do sistema durante a oclusão do tubo. A implantação do tubo intravesical pós-inchamento da parede da bexiga foi significativa para materiais de polietileno (PE) e poliuretano (PU). No dia 2, desenvolveu-se um inchaço submucoso grave. Ele ocupava metade da seção transversal da bexiga, levando à obstrução do lúmen. No dia 5, o edema se resolveu completamente,...

Discussion

Óptimo material e tamanho da tubulação intravesical

Para determinar o efeito do diâmetro da tubulação em gravações de pressão, testámos diferentes tubos microfluídicos; PE50 (0,58 mm ID), poliuretano PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) e PE10 (0,28 mm ID). Para cada tubo, a pressão foi registada com a bomba de infusão funcionando a 1 mL / h, enquanto se movia rapidamente o tubo verticalmente de 0 a 30 cm. As experiências iniciais in vivo tentaram usar a tubagem PE50, mas não tiveram sucesso de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubulação de polietileno (PE) 10	Instech	BTPE-10	Serve para conectores/plugs 30G
Tubulação de polietileno (PE) 50	Instech	BTPE-50	Serve para conectores/plugs 22G
Girador de aço inoxidável de canal único 22 G	Mola	375/22
(9/64" OD)	Grainger	1NAH1	Protege a tubulação PE50 - Corte no comprimento
Conector de 22 G	Instech	SP22/12
Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun	Yutaoz		Use configuração de baixa temperatura (100 ° C) - Qualquer pistola de cola quente com uma faixa de temperatura ajustável funcionará
Surebonder DT-2010 bastão de cola multiuso	Surebonder		Qualquer cola quente de uso geral funcionará
Dumont #5 micropinças curvas	World Precision Instruments	500232
Dumont #7 pinças curvas	Mini
tesoura de dissecação - reta	Pinça Micro mosquito da World Precision Instruments	503240
(12,5 cm)	de 500451		World Precision Instruments
Porta-agulhas Castroviejo
Isoflurano, USP	Phoenix		2%, taxa de fluxo de 1 L/min
Buprenorfina			0,05 mg/kg
0,9% Cloreto de Sódio Irrigação, USP	Baxter
6-0 Monofilamento preto de Ethilon, sutura não absorvível	Ethicon		Bexiga amarração
6-0 Vicryl violeta trançada, sutura absorvível	Ethicon		Sutura muscular, correndo
6-0 Monofilamento azul de Prolene, sutura não absorvível	Ethicon		Sutura de pele, colchão vertical, enterrado interrompido
KD Legato 210 bomba de infusão/retirada	KD Scientific		1.5 mL/hr
Transdutor de pressão descartável	Digitimer	NL108T2
Amplificador de Pressão Digitimer		NL108A
Interface de aquisição de dados Power1401-3 Digitimer
Spike2	Cambridge Electronic Design Limited		Software de registro de pressão para PC
Microscópio cirúrgico Leica MZ6 (3,2 - 20X)	Leica Microsystems		Ampliação