A imuno-histoquímica de fluorescência multiparamétrica pode ser usada para avaliar o número, a distribuição relativa e a localização das populações de células imunes no microambiente do tumor. Este manuscrito descreve o uso desta técnica para analisar subpopulações de células T no câncer orofaríngeo.
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Artigo de método
Imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores das subpopulações de células T em amostras de carcinoma de células escamosas humano oftaríngeas fixadas em formalina, arquivadas, formadas por formalina
Neste artigo
Resumo
Resumo
A técnica de imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores (IHC) é um método para quantificar populações de células de interesse, levando em consideração sua distribuição relativa e sua localização no tecido. Esta técnica tem sido amplamente aplicada para estudar o infiltrado imunitário em vários tipos de tumores. O microambiente do tumor é infiltrado por células imunes que são atraídas para o local do tumor. Diferentes populações de células imunológicas têm desempenhado diferentes papéis no microambismo do tumor e têm um impacto diferente no resultado da doença. Este manuscrito descreve o uso de ICC de fluorescência multiparamétrica no carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) como exemplo. Esta técnica pode ser estendida a outras amostras de tecido e tipos celulares de interesse. No estudo apresentado, analisamos o compartimento intra-epitelial e estromal de uma grande coorte de OPSCC (n = 162). Concentramo-nos em linfócitos T totais (CD3 + ), regulação imunossupressoraCélulas T (Tregs, ie, FoxP3 + ) e T helper 17 (Th17) ( ie, IL-17 + CD3 + ) usando uma contra-prova nuclear para distinguir o epitélio tumoral do estroma. Um número alto de células T encontrou-se correlacionado com uma melhor sobrevivência livre de doença em pacientes com um número baixo de células não T T-17 + intratumorais. Isso sugere que as células T não-T IL-17 + podem estar correlacionadas com uma resposta imune pobre no OPSCC, o que está de acordo com a correlação descrita entre a IL-17 e a fraca sobrevivência em pacientes com câncer. Atualmente, novas técnicas de IHC de fluorescência multiparamétrica estão sendo desenvolvidas usando até 7 fluorocromos diferentes e permitirão uma caracterização e localização mais precisa das células imunes no microambiente do tumor.
Introdução
Os carcinomas de células escamosas orofaríngeas (OPSCCs) são um grupo heterogêneo de câncer de células escamosas originadas na orofaringe. Os fatores de risco para o OPSCC incluem infecção por papilomavírus humano (HPV) e álcool e tabaco 1 , 2 . O papel da resposta imune e como usar isso em um cenário clínico está apenas começando a ser explorado. O microambiente do tumor é infiltrado por células imunes que são atraídas pelo site do câncer. Embora uma alta freqüência de células T citocíticas CD8 + tenha sido correlacionada com a sobrevivência melhorada em pacientes com OPSCC 3
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Protocolo
As amostras de pacientes foram manipuladas de acordo com as diretrizes éticas médicas descritas no Código de Conduta para Uso Secundário Adequado de Tecido Humano da Federação Holandesa de Sociedades Científicas Biomédicas (www.federa.org).
1. Preparar slides
- Obter material de tecido ressecado (qualquer tipo de tecido) de um departamento de patologia após a obtenção da permissão do comitê de ética médica para usar o material ressecado.
NOTA: Para a experiência atual, amostras de tumor de pré-tratamento foram obtidas a partir de tumores orofaríngeos primários diagnosticados no Leiden University Medical Center, Leiden, Hol....
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Resultados
Uma série de amostras de tumor de pré-tratamento de FFPE obtidas a partir de tumores orofaríngeos primários diagnosticados no Leiden University Medical Center, Leiden, Holanda entre 1970 e 2011, selecionados como descrito anteriormente (n = 162), foi corada usando o protocolo descrito 13 . Foram analisadas uma a quatro imagens aleatórias de cada slide ( Figura 1 ). Algumas células autofluorescentes são indicadas, que podem ser clarame.......
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Discussão
Para o protocolo descrito, uma das etapas mais críticas é determinar a diluição correta dos anticorpos primários utilizados. A diluição dos anticorpos secundários marcados foi de 1: 200, conforme recomendado pelo fabricante desses anticorpos específicos marcados com Alexa. A diluição dos anticorpos primários deve então ser determinada por uma diluição em série, de preferência usando duas amostras diferentes do tipo de tecido pretendido (neste caso, OPSCC). A diluição de trabalho ideal é a diluição em que é obtido um sin.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesse comercial ou financeiro.
Agradecimentos
Simone Punt foi apoiada pela concessão UL2010-4801 da Dutch Cancer Society. Gostaríamos de agradecer a todos os co-autores do artigo original que este protocolo JoVE se baseia: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter e Sjoerd van Der Burg.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Processador de tecidos ultrarrápido Pathos Delta | Milestone e Histostar | Processador de tecidos automatizado | |
| Histostar | Thermo Scientific | Máquina de incorporação de blocos | |
| de tecidos Formaldeído | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Etanol | Merck | ||
| milliQ água | Elaga Purelab Chorus | ||
| Cera de parafina/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Suporte de tecido de micrótomo | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Lâmina de tecido | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Coelho anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titulação necessária diluição de anticorpos |
| Camundongo IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titulação necessária diluição de anticorpos |
| Cabra IgG anti-IL-17 | R & D Systems | AF-317-NA | Titulação necessária diluição de anticorpos |
| Anticorpo de controle do isotipo Ig de coelho | Abcam | ab27472 | Use na mesma concentração final que o anticorpo anti-CD3 |
| de controle do isotipo IgG1 de camundongo | Abcam | ab91353 | Use na mesma concentração final que |
| anticorpo anti-FoxP3 IgG de controle do isotipo de cabra | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use na mesma concentração final que anti-IL-17 |
| Burro anti-coelho IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Diluir 1:200 em 1% BSA/PBS |
| Burro anti-rato-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Diluir 1:200 em 1% BSA/PBS |
| Burro anti-cabra IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Diluir 1:200 em 1% BSA/PBS |
| VectaShield contendo DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Microscópio confocal de varredura a laser LSM700 | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 objetiva | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | versão 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | versão 4.2.0.121 | Disponível para download em www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | versão 20.0 | |
| ImageJ | versão 1.50i | Disponível para download em http://rsb.info.nih.gov/ij. |
Referências
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al.
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Reimpressões e permissões
