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Artigo de método

Imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores das subpopulações de células T em amostras de carcinoma de células escamosas humano oftaríngeas fixadas em formalina, arquivadas, formadas por formalina

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DOI:

10.3791/55589

⸱

29 de julho de 2017

 ,  , 
1Department of Pathology, Leiden University Medical Center, 2Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, Erasmus University Medical Center, 3Center for Gynecological Oncology Amsterdam, VU Medical Center

Neste artigo

Resumo

A imuno-histoquímica de fluorescência multiparamétrica pode ser usada para avaliar o número, a distribuição relativa e a localização das populações de células imunes no microambiente do tumor. Este manuscrito descreve o uso desta técnica para analisar subpopulações de células T no câncer orofaríngeo.

Resumo

A técnica de imuno-histoquímica de fluorescência de quatro cores (IHC) é um método para quantificar populações de células de interesse, levando em consideração sua distribuição relativa e sua localização no tecido. Esta técnica tem sido amplamente aplicada para estudar o infiltrado imunitário em vários tipos de tumores. O microambiente do tumor é infiltrado por células imunes que são atraídas para o local do tumor. Diferentes populações de células imunológicas têm desempenhado diferentes papéis no microambismo do tumor e têm um impacto diferente no resultado da doença. Este manuscrito descreve o uso de ICC de fluorescência multiparamétrica no carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) como exemplo. Esta técnica pode ser estendida a outras amostras de tecido e tipos celulares de interesse. No estudo apresentado, analisamos o compartimento intra-epitelial e estromal de uma grande coorte de OPSCC (n = 162). Concentramo-nos em linfócitos T totais (CD3 + ), regulação imunossupressoraCélulas T (Tregs, ie, FoxP3 + ) e T helper 17 (Th17) ( ie, IL-17 + CD3 + ) usando uma contra-prova nuclear para distinguir o epitélio tumoral do estroma. Um número alto de células T encontrou-se correlacionado com uma melhor sobrevivência livre de doença em pacientes com um número baixo de células não T T-17 + intratumorais. Isso sugere que as células T não-T IL-17 + podem estar correlacionadas com uma resposta imune pobre no OPSCC, o que está de acordo com a correlação descrita entre a IL-17 e a fraca sobrevivência em pacientes com câncer. Atualmente, novas técnicas de IHC de fluorescência multiparamétrica estão sendo desenvolvidas usando até 7 fluorocromos diferentes e permitirão uma caracterização e localização mais precisa das células imunes no microambiente do tumor.

Introdução

Os carcinomas de células escamosas orofaríngeas (OPSCCs) são um grupo heterogêneo de câncer de células escamosas originadas na orofaringe. Os fatores de risco para o OPSCC incluem infecção por papilomavírus humano (HPV) e álcool e tabaco 1 , 2 . O papel da resposta imune e como usar isso em um cenário clínico está apenas começando a ser explorado. O microambiente do tumor é infiltrado por células imunes que são atraídas pelo site do câncer. Embora uma alta freqüência de células T citocíticas CD8 + tenha sido correlacionada com a sobrevivência melhorada em pacientes com OPSCC 3 , o papel de outros subconjuntos de células T, incluindo células Tregs e Th17, ainda não está claro 4 . Considerando que as células Th1 e Th17 devem ajudar na resposta imune dirigida às células tumorais, as Tregs são bem conhecidas por suas habilidades para suprimir a atividade de outras células T 5 . No entanto, a presença de TRegs encontrou-se correlacionar com respostas favoráveis ​​e desfavoráveis ​​em diferentes tipos de tumor 6 . Uma vez que nem todas as células imunes presentes no sangue infiltram o tumor na mesma extensão, estudar o microambiente tumoral local fornece a medida mais confiável da resposta imune dirigida contra o tumor. O objetivo deste estudo é determinar a correlação entre os números e os tipos de células imunes e o desfecho clínico. Usamos imagens de IHC de fluorescência de quatro cores para analisar o número e a localização de várias subpopulações de células T no OPSCC humano.

Concentramo-nos em linfócitos T totais (CD3 + ), células Th17 e Tregs FoxP3 + imunossupressores, cuja via de diferenciação está intimamente relacionada às células Th17. As células Th17 são caracterizadas pela combinação de CD3 e IL-17. A citocina IL-17 também pode ser produzida por células não-T 7 . Determinamos a distribuição do intrapinteCélulas T helicoidais e estromáticas, Tregs, Th17 e IL-17 + células não-T em uma grande série de casos de OPSCC e analisou as correlações com a sobrevivência do paciente. A fluorescência multicolor IHC foi utilizada para identificar a expressão de CD3, Foxp3 e IL-17, em combinação com uma contra-prova DAPI. Este ensaio permitiu a identificação fácil e clara de ambas as células tumorais (utilizando a coloração nuclear DAPI) e as populações de células T infiltrantes (utilizando uma combinação de diferentes marcadores). Após a preparação e coloração da amostra, utilizou-se um microscópio fluorescente e um software de imagem para separar as diferentes cores fluorescentes usadas e determinar o número e o tipo de células presentes tanto no epitélio tumoral quanto no estroma associado ao tumor.

Um teste alternativo para quantificar e fenotípio populações de células imunes é a análise de citometria de fluxo, ou a citometria por análise de tempo de vôo (CyTOF), de amostras tumorais ou periféricas ( ou seja, sangue ou ascite). Usando issoTécnica, todas as informações sobre localização e distribuição relativa dos diferentes tipos de células são perdidas. O uso e a análise de amostras periféricas também não fornecem informações sobre quais células podem infiltrar o microambiente do tumor. As análises de células imunitárias de sangue e ascite demonstraram não refletir o fenótipo e a freqüência de infiltração de células imunes do tecido tumoral 8 , 9 .

Outra alternativa é o uso de microscopia de campo brilhante. Uma vantagem desta técnica em relação à imagem de fluorescência é a ausência de autofluorescência de tecido. Embora algumas amostras contenham mais autofluorescência - particularmente eritrócitos, mas também outros tipos de células, incluindo granulócitos neutrofílicos - essas áreas podem ser facilmente removidas na análise de quase todas as amostras. A imunofluorescência oferece a vantagem de analisar marcadores múltiplos em uma amostra usando um painel de fluorescência específicaNt wavelengths. Isto é actualmente impossível na mesma medida para o microscópio de campo brilhante devido à falta de um número suficiente de rótulos e isotipos de anticorpos comercialmente disponíveis para um antígeno particular.

A técnica de fluorescência multicolor de IHC descrita aqui foi utilizada em vários tipos diferentes de câncer e combinações de anticorpos para estudar diferentes populações de células imunes, bem como moléculas expressas por células tumorais, tais como antígenos de leucócitos humanos (HLA) e PD-L1 10 , 11 , 12 . O protocolo foi estabelecido e validado utilizando vários tipos diferentes de amostras e anticorpos.

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Protocolo

As amostras de pacientes foram manipuladas de acordo com as diretrizes éticas médicas descritas no Código de Conduta para Uso Secundário Adequado de Tecido Humano da Federação Holandesa de Sociedades Científicas Biomédicas (www.federa.org).

1. Preparar slides

  1. Obter material de tecido ressecado (qualquer tipo de tecido) de um departamento de patologia após a obtenção da permissão do comitê de ética médica para usar o material ressecado.
    NOTA: Para a experiência atual, amostras de tumor de pré-tratamento foram obtidas a partir de tumores orofaríngeos primários diagnosticados no Leiden University Medical Center, Leiden, Holanda entre 1970 e 2011, selecionados como descrito anteriormente (n = 162) 13 . O tamanho do tecido foi limitado apenas pela exigência de uma quantidade suficiente de tecido tumoral para tomar de forma confiável 4 imagens microscópicas dentro do tumor.
  2. Corrigir o tecido em formalina tamponada a 4% por um mínimo de 12 h. Desidratar o tecido em agSérie radiante de etanol. Lavá-lo em xileno e incorporá-lo em cera de parafina usando um processador de tecido automatizado.
  3. Corte secções de tecido de 4 μm de espessura fixadas em formalina, embebidas (FFPE) em lâminas de vidro usando um microtomo. Coloque o bloco de tecido no suporte de tecido microônico usando procedimentos padrão.
    1. Corte fitas de tecido e coloque-as sobre a superfície de um banho de água contendo água desionizada a 45 ºC. Use um slide adequado para coloração imuno-histoquímica para pescar uma seção, colocando o slide na água diretamente abaixo da seção. Mova cuidadosamente o deslize para cima em um ângulo, tirando a seção da água e colando-a sobre o slide.
  4. Deixe as lâminas secar durante a noite a 37 ° C.
  5. Deparafine os slides FFPE imergindo-os completamente em 100% xileno fresco, três vezes por 5 minutos cada. Rehydrate os slides submergindo-os duas vezes em 100% de etanol fresco, etanol a 70% e etanol a 50% durante 5 min cada.

2. Execute Antigen Retrieval

  1. Lave as lâminas em água desionizada durante 5 min.
  2. Pré-aqueça o tampão de ácido Tris-etilenodiaminotetracético (EDTA) (Tris 10 mM mais EDTA 1 mM, pH 9,0) até a temperatura de ebulição usando um microondas. Execute a recuperação do antígeno submergindo os slides no tampão EDTA pré-aquecido e mantendo o buffer a esta temperatura por 10 min no microondas.
    NOTA: Qualquer microondas com potência de 900 W pode ser usado.
  3. Deixe as lâminas arrefecerem no buffer durante 2 h.

3. Corrediças de tecido de mancha

  1. Lave as lâminas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 5 minutos cada.
  2. Desenhe um círculo ao redor do tecido com uma caneta hidrofóbica para evitar que os anticorpos diluídos derramem o slide. Lave mais uma vez com PBS; Isso é opcional.
  3. Incubar o tecido com anticorpos primários (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 e anti-IL-17 1:50) diluído em soro bovino a 1% p / v aLbumin (BSA) em PBS à temperatura ambiente durante a noite.
    NOTA: O volume por slide depende do tamanho do tecido, mas geralmente é de 50 a 150 μL. Substitua os anticorpos primários com anticorpos da mesma classe de isotipo com uma especificidade desconhecida para os lâminas de controle negativo na mesma diluição que os anticorpos CD3, CD8 e FoxP3 ( ie anticorpo de controle de isotipo de coelho, anticorpo de controle de isotipo de IgG1 de rato e cabra Anticorpo anti-isotipo IgG).
  4. Lave os slides três vezes com PBS por 5 minutos cada.
  5. Incubar o tecido com uma combinação de anticorpos secundários marcados de forma fluorescente visando as espécies e / ou isotipos de anticorpos primários ( ou seja, IgG Alexa 488 de burro anti-cabra de 1: 200, IgG A546 anti-coelho de burro e A647 anti-rato de burro) diluídos em 1% de BSA em PBS à temperatura ambiente durante 1 h.
    NOTA: O volume por slide depende do tamanho do tecido, mas tipicamente é de 50 a 150 μL.
    1. Depois deAdicionando o anticorpo secundário, mantenha as lâminas protegidas da luz, tanto quanto possível, armazenando-as em uma caixa escura ou envolvendo a caixa em papel alumínio.

4. Montar e desmoldar lâminas de tecido

  1. Lave os slides três vezes em PBS por 5 minutos cada.
  2. Montar as lâminas usando um meio aquoso de montagem anti-fade contendo uma contra-corrosão nuclear ( por exemplo, DAPI). Analise as lâminas usando um microscópio fluorescente o mais rápido possível (dentro de duas semanas). Armazene as lâminas no escuro a 4 ° C até a análise.

5. Analisar lâminas de tecido manchado

  1. Obtenha quatro imagens de cada slide usando um microscópio de fluorescência equipado com um objetivo de 20-25. Tire imagens em locais aleatórios em toda a área tumoral total incluída no slide para capturar uma fração representativa do tumor.
    NOTA: uma ampliação padrão de 250X deve ser usada. Qualquer fluorescente oO microscópio de varredura a laser pode ser usado, desde que tenha os filtros e lasers necessários para visualizar os fluoroquromos utilizados.
    1. Para visualização do Alexa 488, use um máximo de excitação de 490 e um máximo de emissão de 525; Para visualização do Alexa 546, use um máximo de excitação de 556 e um máximo de emissão de 573; Para visualização do Alexa 647, use um máximo de excitação de 650 e um máximo de emissão de 665; E para visualização de DAPI, use um máximo de excitação de 358 e um máximo de emissão de 461.
    2. Salve as imagens como arquivos de imagem ( ie, jpeg e tiff) no software disponível para o usuário.
  2. Discriminar entre o epitélio do tumor e as áreas de estroma tumoral com base nas formas nuclear e celular das células epiteliais do tumor versus estromal após consulta de um patologista.
    1. Para determinar a área total da superfície do estroma, desenhe uma linha em torno de todas as áreas ocupadas por células do estroma (em vez de células tumorais) e recorD a área de superfície usando o software de análise de imagem fornecido pelo fabricante do microscópio.
      1. Clique na guia "Sobreposição" sob a imagem; Escolha a forma "Fechado Poly-line" e clique nele. Demarque o limite entre os campos do epitélio tumoral e do estromal clicando na área até chegar ao primeiro ponto novamente. Isso fornece uma medida para essa área.
        NOTA: Uma vez que o formato está fechado, aparecerá um número ao lado da forma que circunda a área de superfície da imagem selecionada (A = x μm 2 ).
    2. Subtrair esta área de superfície da área total da superfície da imagem (fornecida nas propriedades da imagem) para calcular a área da superfície epitelial. Excluir áreas vasculares, necróticas e autofluorescentes, desenhando uma linha em torno delas, registrando o tamanho da área fornecida e subtraindo isso da área da superfície epitelial.
    3. Salve todos os números da área de superfície em um arquivo de planilha para calcular as áreas de superfície médias eNúmeros de células por slide.
    4. Usando o software de análise de imagem, determine se as células são simples, dupla ou tripla positiva, verificando a fluorescência de todos os quatro canais.
      1. Contar as células simples, dupla e triplo positivo em cada imagem usando o ImageJ.
        1. Faça o download do ImageJ. Abra uma imagem clicando em "Arquivo" e "Abrir" e selecionando a imagem a ser analisada. Clique com o botão direito do mouse na "Ferramenta de Ponto" (um quadrado vermelho no meio de quatro linhas) e selecione a "Ferramenta Multi-Ponto". Clique duas vezes na "Ferramenta multiponto" e conte o número de diferentes tipos de células na imagem selecionando um número de contador diferente para cada tipo de célula.
          NOTA: Conte todas as células de cada tipo de célula diferente, conforme identificado pela presença de uma, duas ou todas as três cores fluorescentes. Exclua DAPI, pois esta contra-corrosão nuclear está presente em todas as células e é usada para discriminar células tumorais de células imunes. Cada tipo de célula é contadoUsando um número de contador diferente. Contar os números de células de cada tipo de célula separadamente nas áreas do epitélio e estromal do tumor escolhendo um número de contador diferente a cada vez. Não conte as células dentro dos vasos sanguíneos e áreas em grande parte autofluorescentes.
        2. Registre o número de células analisadas em cada compartimento do contador para cada imagem em um arquivo de planilha.
        3. Divida o número total de células para cada tipo de célula sobre a área superficial total do epitélio tumoral e o estroma tumoral analisado.

6. Análise estatística

NOTA: Todas as análises estatísticas devem ser discutidas com um estatístico para assegurar a qualidade dos dados. Para estatísticas gerais, use qualquer guia de estatísticas médicas 14 .

  1. Teste as correlações entre as freqüências celulares usando o teste rho de correlação de classificação de Spearman.
  2. Teste as diferenças estatísticas nos números de células positivasÉ entre grupos de pacientes usando o teste de Wilcoxon Mann-Whitney.
  3. Teste as correlações entre o número de células e a sobrevivência livre de doença ( ou seja, o tempo do diagnóstico até a recidiva local ou distante da morte ou da doença), dividindo os pacientes em grupos com base em um número de células cortadas usando a geração e registro da curva Kaplan-Meier Análise de classificação 15 .
  4. Execute análises multivariadas utilizando análise de regressão proporcional de riscos de Cox.

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Resultados

Uma série de amostras de tumor de pré-tratamento de FFPE obtidas a partir de tumores orofaríngeos primários diagnosticados no Leiden University Medical Center, Leiden, Holanda entre 1970 e 2011, selecionados como descrito anteriormente (n = 162), foi corada usando o protocolo descrito 13 . Foram analisadas uma a quatro imagens aleatórias de cada slide ( Figura 1 ). Algumas células autofluorescentes são indicadas, que podem ser clarame...

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Discussão

Para o protocolo descrito, uma das etapas mais críticas é determinar a diluição correta dos anticorpos primários utilizados. A diluição dos anticorpos secundários marcados foi de 1: 200, conforme recomendado pelo fabricante desses anticorpos específicos marcados com Alexa. A diluição dos anticorpos primários deve então ser determinada por uma diluição em série, de preferência usando duas amostras diferentes do tipo de tecido pretendido (neste caso, OPSCC). A diluição de trabalho ideal é a diluição em que é obtido um sin...

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Divulgações

Os autores não declaram conflito de interesse comercial ou financeiro.

Agradecimentos

Simone Punt foi apoiada pela concessão UL2010-4801 da Dutch Cancer Society. Gostaríamos de agradecer a todos os co-autores do artigo original que este protocolo JoVE se baseia: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter e Sjoerd van Der Burg.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Processador de tecidos ultrarrápido Pathos DeltaMilestone e HistostarProcessador de tecidos automatizado
HistostarThermo ScientificMáquina de incorporação de blocos
de tecidos FormaldeídoBaker
XylolMerck
EtanolMerck
milliQ águaElaga Purelab Chorus
Cera de parafina/ParacleanKlinipath5079A
Suporte de tecido de micrótomoLeicaRM225
Flex IHC sideDakoLâmina de tecido
TrisMerk-Milipore1,083,821,000
EDTABaker1073
PBSBio-RadBUF036A
BSASigmaA9647
Coelho anti-CD3Abcamab828Titulação necessária diluição de anticorpos
Camundongo IgG1 anti-FoxP3Abcamab20034Titulação necessária diluição de anticorpos
Cabra IgG anti-IL-17R & D SystemsAF-317-NATitulação necessária diluição de anticorpos
Anticorpo de controle do isotipo Ig de coelhoAbcamab27472Use na mesma concentração final que o anticorpo anti-CD3
de controle do isotipo IgG1 de camundongoAbcamab91353Use na mesma concentração final que
anticorpo anti-FoxP3 IgG de controle do isotipo de cabraThermoFisher Scientific02-6202Use na mesma concentração final que anti-IL-17
Burro anti-coelho IgG A546ThermoFisher ScientificA10040Diluir 1:200 em 1% BSA/PBS
Burro anti-rato-A647ThermoFisher ScientificA31571Diluir 1:200 em 1% BSA/PBS
Burro anti-cabra IgG A488ThermoFisher ScientificA11055Diluir 1:200 em 1% BSA/PBS
VectaShield contendo DAPIVector LaboratoriesH-1200
Microscópio confocal de varredura a laser LSM700 Zeiss
LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 objetivaZeiss420852-9972-720
LSM Zen SoftwareZeissversão 2009
LSM Image BrowserZeissversão 4.2.0.121Disponível para download em www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.
SPSSIBM Corp.versão 20.0
ImageJversão 1.50iDisponível para download em http://rsb.info.nih.gov/ij.
o

Referências

  1. Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
  2. Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
  3. Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
  4. Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
  5. Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
  6. Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
  7. Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539(2015).
  8. Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
  9. Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
  10. Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
  11. van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
  12. Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
  13. Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
  14. Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
  15. Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
  16. Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).

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Reimpressões e permissões

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