Artigo de método

Protocolo de rastreamento de vídeo para a tela de quimioterapia para abelhas

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DOI:

10.3791/55603

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12 de junho de 2017

 , 
1Entomology, Virginia Tech, 2Entomology, University of Nebraska-Lincoln

Neste artigo

Resumo

A perda de colônias de abelhas mel é um desafio para os serviços de polinização de culturas. As atuais práticas de proteção de polinizadores garantem uma abordagem alternativa para minimizar o contato de abelhas com pesticidas nocivos usando produtos químicos repelentes. Aqui, fornecemos métodos detalhados para um protocolo de rastreamento visual para detecção de dissuasores para abelhas.

Resumo

A abelha de abelha européia, Apis Mellifera L. , é uma polinizadora econômica e agrícola que gera bilhões de dólares por ano. O número de colônias de abelhas tem diminuído nos Estados Unidos e em muitos países europeus desde 1947. Vários fatores desempenham um papel neste declínio, incluindo a exposição não intencional de abelhas para pesticidas. O desenvolvimento de novos métodos e regulamentos é garantido para reduzir a exposição aos pesticidas a esses polinizadores. Uma abordagem é o uso de substâncias químicas repelentes que impedem as abelhas de uma cultura recentemente tratada com pesticida. Aqui, descrevemos um protocolo para discernir a dissuasão das abelhas expostas a quimicas repelentes seletivas. Os matadores de abelhas de mel são coletados e passaram a passar a noite numa incubadora 15 h antes do teste. Abelhas de mel individuais são colocadas em pratos de Petri que possuem um cubo de agarose-agarose (tratamento de controle) ou um cubo de açúcar-agarose-composto (tratamento repelente) colocado emPara o meio do prato. A placa de Petri serve como a arena que é colocada sob uma câmera em uma caixa de luz para gravar as atividades locomotoras de abelha de mel usando software de rastreamento de vídeo. Um total de 8 tratamentos de controle e 8 repelentes foram analisados ​​por um período de 10 min, cada tratamento foi duplicado com novas abelhas. Aqui, demonstramos que as abelhas são dissuadidas dos cubos de açúcar-agarose com um tratamento composto, enquanto que as abelhas são atraídas para os cubos de açúcar-agarose sem um composto adicionado.

Introdução

A abelha de mel europeia, Apis melliferaL. , É um inseto econômico e de importância agrícola que fornece serviços de polinização que são valorizados em mais de US $ 200 bilhões globalmente 1 . Nos Estados Unidos e na Europa, os números das colônias de abelhas têm diminuído. Os Estados Unidos perderam ca. 60% das colônias de abelhas de mel geridas de 1947 a 2008, enquanto a Europa perdeu ca. 27% de 1961 a 2007 2 , 3 . Existem vários fatores que podem ser responsáveis ​​pelo aumento do número de perdas de colônias, incluindo, entre outras, infestações parasitárias, infecções por patógenos, práticas de apicultura e uso de pesticidas 2 a 4 .

As abelhas podem ser expostas a pesticidas através de duas vias principais. A exposição a pesticidas fora da colméia pode ocorrer quando os indivíduos forrageiros entram em contato com culturas queForam pulverizados com produtos químicos para proteção contra pragas. A exposição a pesticidas dentro da colméia pode ocorrer quando os apicultores utilizam produtos químicos para controlar pragas e agentes patogénicos na invasão, tais como ácaros, bactérias e microsporidia 4 . Os resíduos de pesticidas foram identificados dentro de amostras de cera, pólen e abelhas de 24 apiários nos Estados Unidos e Canadá 5 , 6 . Os efeitos do contato de pesticidas com abelhas incluem toxicidade aguda, bem como efeitos sub-letais, como paralisia, desorientação e alterações comportamentais e de saúde 1 , 7 . Como a agricultura moderna exige o uso de pesticidas para manter altos rendimentos das culturas, esses produtos químicos continuarão a ser utilizados no futuro 2 . A fim de proteger melhor as abelhas das exposições aos pesticidas, é necessário o desenvolvimento de novos protocolos e regulamentos 5 .Uma possível abordagem para a proteção é o uso de repelentes para reduzir a exposição de abelhas meladas a pesticidas enquanto forrageiam alimentos.

Os repelentes de insetos (IRs) geralmente foram usados ​​como medidas de proteção de mordida pessoal contra vetores de doenças artrópodes 8 . O IR mais utilizado e bem sucedido, desenvolvido há mais de 60 anos, é DEET 8 , 9 . É considerado o padrão-ouro para testes de repelente de insetos e é usado pela Organização Mundial da Saúde e pela Agência de Proteção Ambiental como um controle positivo para a nova triagem repelente 10 . Além disso, descobriu-se que o DEET dispersa as abelhas de uma ameaça à sua colônia 11 . Os atributos atuais associados aos IRs pessoais incluem: (1) efeito duradouro contra um grande número de artrópodes; (2) não irritante para o usuário quando aplicado na pele ou na roupa; (3) inodoro ouOdor agradável; (4) nenhum efeito na roupa; (5) nenhuma aparência oleosa quando aplicado à pele e para suportar a transpiração, lavagem e limpeza pelo usuário; (6) nenhum efeito em plásticos de uso comum; E (7) quimicamente estável e acessível para uso generalizado 12 . Um repelente utilizado para as abelhas só precisaria de alguns desses atributos, como efeitos duradouros, não irritantes para aplicadores, odor inodoro ou agradável, quimicamente estável e acessível para uso generalizado e não tóxico para as abelhas. No entanto, antes de explorar esses atributos em profundidade, é necessário um método para rastrear compostos para repelência / dissuasão de maneira eficiente. Aqui, descrevemos um protocolo para um ensaio laboratorial para pesquisar compostos para a dissuasão das abelhas, um passo importante na determinação da repelência. O protocolo a seguir é modificado a partir de um estudo anterior descrevendo um método de rastreamento visual para avaliar os efeitos subtlethal de pesticidas em abelhas mel 13 . HoweEm verdade, esse protocolo difere na medida em que é projetado para medir os efeitos dos repelentes candidatos que podem impedir as abelhas das culturas tratadas com pesticidas. Não há protocolos recomendados para o teste laboratorial de dissuasores químicos para abelhas e, portanto, este protocolo fornece uma abordagem simples para a tela de tais compostos.

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Protocolo

1. Prepare cubos de agarosa-agarose

  1. Pesar 8 g de açúcar e colocar em um balão Erlenmeyer de 50 ml.
  2. Encha o frasco Erlenmeyer com 20 mL de água desionizada. Dissolver o açúcar girando o frasco.
  3. Pesar 170 mg de agarose e adicioná-lo à solução de açúcar.
  4. Aqueça a solução de açúcar-agarose em um microondas alto durante 25 s. Dissolver a agarose na solução de açúcar.
  5. Permitir que o frasco e a solução de açúcar-agarose esfriem.
    NOTA: O frasco deve ser frio ao toque, mas não permita que a solução se solidifique.
    1. Para preparar um cubo de agarose-agarose para o tratamento de controle, despeje a solução de agarosa-agarose semi-arrefecida em um molde de barco de pesagem.
      NOTA: O molde do barco de pesagem tem as dimensões 1,5 x 1,5 x 0,3 cm 3 .
    2. Para preparar um cubo de açúcar-agarose-composto para o tratamento repelente, adicione a quantidade desejada de composto à solução semi-arrefecida ( por exemplo , 1% de DEET em sSolução ugar-agarose (v / v)). Remova o balão para misturar no composto e depois despeje a solução em um molde de barco de pesagem.
      NOTA: São preparados oito moldes de controle e oito moldes de teste neste ponto. Os moldes de controle não contêm repelente.
  6. Arrefecer os cubos de açúcar-agarose nos moldes em uma geladeira por 5-10 min. Remova os cubos de agarosa de açúcar solidificados dos moldes do pesado e coloque-os em um recipiente de plástico com uma toalha de papel humedecida.
  7. Coloque os recipientes em uma geladeira para armazenamento. Os cubos de açúcar-agarose devem ser utilizados no prazo de 7 dias após a preparação.

2. Programação do Software de Rastreamento de Vídeo e Configuração Experimental

  1. Em Configurações de Experiência na barra Explorador de Experiência (no software de rastreamento, veja Tabela de Materiais), localizado à esquerda da tela, verifique se a câmera correta está selecionada e a gravação de vídeo está centrada nas arenas do prato de Petri.
    1. Se a gravação de vídeo precisa ser centrada, entre nas configurações da câmera e sob os controles AOI e selecione as opções de centro X e Y central.
  2. Em Configurações de Experiência, altere o número de arenas para 16. Em Recursos de Rastreamento, selecione Detecção de ponto central.
  3. Selecione Configurações de arena para configurar a arena desejada para o ensaio.
    1. Coloque as 16 placas de Petri em um padrão de 4 x 4 em cima de uma caixa de luz, posicionada sob a câmera ( Figura 1 ).
      NOTA: Estes pratos são usados ​​para criar a arena de gravação e estão vazios.

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Figura 1: disposição do prato de Petri na caixa de luz. As placas de Petri estão dispostas em um bloco de 4 x 4 em cima da caixa de luz. Este arranjo fornece fácil identificação dos tratamentos de controle e repelente para o vProtocolo de rastreamento inicial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Nas Configurações da arena, use o botão de gravação do fundo, localizado no painel da ferramenta lateral direita, para tirar uma foto das 16 placas de Petri. Isso será usado como o modelo para configurar a arena.
  2. Selecione "Criar elipse" na barra de ferramentas na parte superior da tela Configurações de arena e crie um círculo que corresponda ao diâmetro de uma das placas de Petri na imagem agarra. Coloque a marca Arena 1 no círculo ( Figura 2 ).

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Figura 2: Captura de tela do Visual Tracking Software Arena Settings. A observação de listras diagonais dentro do círculo fornece confirmação da área de detecção no círculo. UMA O marcador da Zona 1 é fornecido para cada quadrado e define a zona alvo para cada prato de Petri. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Selecione "Zone Group 1" localizado na Arena 1 no painel de ferramentas do lado direito. Selecione "Criar retângulo" na barra de ferramentas na parte superior da tela. Crie um quadrado de 30 x 30 pixels usando isso e depois posicione-o no centro do círculo que foi criado na etapa anterior. Selecione "Adicionar Zona" na barra de ferramentas superior e clique no meio do quadrado. Mova o marcador da Zona 1 para que ele esteja no quadrado.
    NOTA: O quadrado criado é a zona de alimentação e não é um requisito de que a zona de alimentação seja exatamente do mesmo tamanho que a listada, desde que seja um pouco maior do que o cubo de agarosa-agarose.

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Figura 3: Captura de tela das Configurações de Arena Completadas. As configurações completas da arena devem ser parecidas com este exemplo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Selecione "Arena 1" no painel da ferramenta lateral direita e clique em duplicar arena completa. No menu suspenso, selecione "Todas as outras arenas" e clique em OK. Mova as configurações de arena duplicadas para as demais placas de Petri na imagem agarra (Figura 3).
    1. Selecione "Arena 1" e selecione "Calibrate Scale" na barra de ferramentas superior. Desenhe a linha de calibração através do diâmetro da placa de Petri Arena 1. Mude a medição do diâmetro para 9 cm (diâmetro das placas de Petri sendo usadas). Selecione "Validar configurações da arena" no painel da ferramenta lateral direita.
  2. Selecione "Configurações de detecção "na barra de controle à esquerda.
  3. Selecione "Configurações de detecção 1" e selecione "Escalar cinza" no menu suspenso localizado na caixa de ferramentas do lado direito. Sob a detecção, defina a faixa de modo que seja de 0 a 83 ( Figura 4A ).
  4. Clique com o botão direito do mouse em "Configurações de detecção" e crie uma nova configuração chamada "Configurações de detecção 2". Certifique-se de que "Gray Scaling" ainda está selecionado, mas não altere os outros parâmetros.
    NOTA: haverá grandes círculos amarelos na janela de vídeo nas arenas. Isso ajudará a organizar as placas de Petri nas posições corretas antes da gravação ( Figura 4B ).

figure-protocol-3
Figura 4: Captura de tela das Configurações de Detecção 1 e 2. ( A ) Mostra o aspecto da arena com a escala cinza corrigida por umaAssunto de mel em uma placa de Petri. ( B ) Mostra a área de detecção de arena para que o posicionamento das placas de Petri possa ser feito entre os ensaios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Selecione "Lista de julgamentos" no Explorer Experimental e clique em "Adicionar variável" na barra de ferramentas superior. Nomeie a variável definida pelo usuário como "Tratamento". Selecione a barra suspensa "Valores Predefinidos" na coluna Tratamento definida pelo usuário e adicione C (controle) e T (tratamento) como Valores Predefinidos. Selecione o botão "Adicionar Trials" localizado na barra de ferramentas superior. Adicione dois testes e, em seguida, para cada arena selecione se é uma arena de controle (C) ou arena de tratamento (T) ( Figura 5 ).

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FiGure 5: Captura de tela da Lista de Julgamentos. Etiquetar as arenas corretamente é importante aqui, pois o programa usa as informações aqui para separar os dados para analisá-lo estatisticamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Selecione "Perfil de dados" no painel Experiment Explorer. Na coluna da esquerda selecione "Tratamento" localizado sob o título "Variáveis ​​independentes definidas pelo usuário". Isso irá adicionar uma caixa "Filtro" na área com o fluxograma. Selecione "C" na caixa pop-up e, em seguida, coloque o filtro recém-criado entre a caixa "Iniciar" e a caixa "Resultado 1". As setas do fluxograma devem ajustar para que eles apontem da caixa inicial para o filtro e, finalmente, para o resultado 1.
    1. Repita a etapa 2.12, no entanto, selecione "T" para o filtro e selecione"Resultado" na seção "Elementos comuns". Mova as caixas recém-criadas para a área do fluxograma e conecte as caixas com setas ( Figura 6 ).

figure-protocol-5
Figura 6: Captura de tela do Perfil de dados. Isso mostra como o fluxograma deve ser configurado para obter a separação apropriada na análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Salve o arquivo.

3. Recolher pessoas de abelhas de mel

  1. Coloque roupas protetoras e selecione uma colméia para coletar abelhas (principalmente forrageiras).
  2. Remova a cobertura externa e interna da colméia. Use uma ferramenta de colméia para selecionar um quadro do corpo da colméia superior que não contenha ninhada.Levante suavemente o quadro da caixa da colméia.
  3. Inspecione o quadro para a rainha das abelhas. Se ela não estiver lá, varre os trabalhadores das abelhas do quadro para um recipiente para o transporte. Recolher indivíduos suficientes para poder executar dois testes completos para cada composto a ser testado (16 indivíduos são utilizados por teste com controles).
    NOTA: Os indivíduos coletados devem principalmente ser forrageiros; No entanto, pode haver outros indivíduos idosos, como abelhas enfermeiras incluídas na coleção.
  4. Anote o tempo em que as abelhas foram removidas. Transfira-os para uma caixa de plástico de 9 cm x 7 cm x 9 cm contendo orifícios de ar e coloque-os em uma incubadora a 32 ° C e 70% de umidade relativa.
  5. Fome as abelhas durante 15 h.
    NOTA: Isto geralmente funciona melhor se as abelhas são coletadas a noite antes de serem testadas.

4. Ensaio de acompanhamento visual de conduta

  1. Inicie o programa de rastreamento visual e abra a salvarD arquivo experimental que foi criado para este ensaio.
  2. Selecione "Configurações de detecção 2".
  3. Coloque controles de cubos de açúcar e agarose nos centros de 8 das 16 placas de Petri. Repita este processo com os cubos de açúcar-agarose-composto (dissuasão) nos restantes 8 pratos.
  4. Use fórceps para remover uma única abelha de mel da caixa de plástico e coloque-a em uma das placas de Petri de controle.
  5. Repita o passo 4.4 para os restantes 15 pratos de Petri.
  6. Coloque todos os pratos na caixa de luz e posicione-os para que as áreas de detecção de arena (mostradas na tela do computador quando a configuração de detecção 2 for selecionada) encaixem em cada uma das arenas de petri. Ilumine a caixa de luz de baixo por uma série de luzes LED configuradas para o espectro vermelho. Cercado toda a caixa e a câmera com uma folha de plástico preto para eliminar a luz externa e reduzir as sombras nas arenas.
  7. Depois que as placas de Petri foram configuradas, verifique se "Configurações de Detecção 1" é aConfiguração selecionada.
    NOTA: Neste ponto, o software de rastreamento visual deve ser apenas apanhar as abelhas dentro das arenas do petri.
  8. Selecione "Aquisição" do Experiment Explorer. Pressione o botão "Iniciar Trial" verde localizado na caixa pop-up Controle de Aquisição à direita para começar a gravar.
  9. Execute o ensaio durante 10 min e, em seguida, clique no botão vermelho "Parar Trial" na caixa de seleção do Controle de Aquisição para parar a gravação.
  10. Remova os indivíduos das placas de Petri e coloque-as em um recipiente separado para que não sejam testadas duas vezes.
  11. Repita as etapas 4.4-4.10 para o segundo teste no mesmo composto.
    NOTA: Este método pode ser modificado para aumentar o número de abelhas-mel por tratamento, conforme necessário pelo usuário.
  12. Selecione Estatísticas no Experiment Explorer e clique em calcular.
  13. Exporte os dados para um software de gerenciador de dados e, em seguida, analise os dados para significância usando um usando um one-wAnálise de variância com um pós-teste de Tukey e teste t de teste não utilizado, usando o programa de software estatístico preferido.

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Resultados

Um protocolo de rastreamento visual foi desenvolvido para registrar a quantidade de tempo que as abelhas doces passaram em uma zona-alvo com açúcar-agarose (tratamento de controle) ou cubo de açúcar-agarose-composto (tratamento dissuasivo). O tempo gravado foi analisado usando um programa de software estatístico e o tempo médio gasto ± erro padrão na zona alvo é relatado como um gráfico de barras. DEET, o padrão-ouro para testes de repelente de insetos / dissuasão, foi usado neste protoc...

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Discussão

Este protocolo de rastreamento visual fornece uma abordagem simples para dissuasores químicos de tela para abelhas de uma maneira relativamente rápida e fácil. Não há protocolos recomendados para o teste laboratorial de dissuasores químicos para abelhas. Estudos anteriores de campo semi- e completo examinaram os repelentes de abelhas mel 14 , 15 ; No entanto, os protocolos descritos são demorados, são intensivos em mão-de-obra e requerem recursos adicionais da i...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Thomas Kuhar pelo uso do software de rastreamento visual e equipamentos. Agradecemos a James Wilson e Scott O'Neal por sua assistência técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Balão Erlenmeyer de 50 mLKimax26500-50usado para fazer os cubos de açúcar/agarose
AçúcarKrogerqualquer produto similar será suficiente
Águaadquirida em casa
AgaroseApex20-102usado para fazer os cubos de açúcar/agarose
Molde para cubos de agarose (Barco de pesagem)qualquer molde que forneça ao pesquisador um cubo de açúcar/agarose de 1,5 cm x 1,5 cm x 0,3 cm será suficiente
de rastreamento visualEthoVision XTNoldus
LEDs de 633 nm CyronHTP904EEssas luzes foram colocadas em uma caixa de luz construída para iluminar as arenas por baixo.  A caixa era uma estrutura de madeira simples com uma tampa de plástico fosco / vidro plexi que permitia que a luz se dispersasse para cima sem qualquer brilho.
Laptop ou PCDellInspiron One 2305necessário para software de rastreamento de vídeo. Qualquer dispositivo de PC capaz de executar o software de rastreamento visual será suficiente
as roupas de proteçãoDadant & Sons IncV0126qualquer capuz e jaqueta de proteção serão suficientes
Ferramenta HiveDadant & Sons IncM00757usado para abrir colmeia
abelhas Recipiente para abelhasde mel qualquer recipiente adequado para abrigar e armazenar abelhas de mel será suficiente
Ponta estreita de fórceps de peso penaBioquip4748usado para selecionar abelhas individuais
9 cm (diâmetro) Placa de PetriFisher Scientific S01778arena usada para conter abelhas individuais durante o rastreamento de vídeo
Dispositivo de gravação (câmera)BasleracA-1300-60gmqualquer dispositivo que possa gravar o assunto claramente e transferir o arquivo para um computador será suficiente
GraphPad PrismGraphpadqualquer pacote de software estatístico será suficiente
deionizada Software para manter de

Referências

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